Summary
Здесь мы опишем Шванновских клеток (СК) миграции тест, в котором SCs могут развиваться расширения аксонов.
Abstract
Развитие периферических нервов, интригующий процесс. Нейроны посылают аксоны иннервируют конкретные цели, которых у людей часто являются более 100 см от сомы нейрона. Выживаемость нейронов в процессе развития зависит от целевой факторы роста, но и на поддержку шванновских клеток (СК). С этой целью SC ensheath аксоны из области нейронных сома (или переход от централизованного к периферической нервной системы) к синапса или нервно-мышечного соединения. Шванновские клетки являются производными нервного гребня и мигрируют в качестве предшественников по развивающиеся аксоны, пока весь аксон покрыт SCs. Это показывает важность SC миграции для развития периферической нервной системы и подчеркивает необходимость исследовать этот процесс. Для того чтобы проанализировать SC развитие, установка необходима, который рядом с ТЦ также включает их физиологическим субстратом для миграции, аксона. В связи с внутриутробного развития
Protocol
1. Подготовка Коллагеновые гели
- Подготовить запас среду, содержащую 455 мкл 10х MEM, 112 мкл 7,5% NaHCO 3, 50 мкл глутамина и NaOH. Концентрация и количество NaOH зависит от крысы хвост коллагена подготовки (см. п. 1.2), окончательный объем фонда среде бытия 1.000 мкл.
- Подготовка крысы хвост коллагена в соответствии с Ebendal (1). Хранить раствор коллагена при 4 ° C. Деградации коллагена решение не могло быть обнаружено. После подготовки новой партии, оценки концентрации NaOH, необходимого для фондового среды (см. 1.1). С помощью рН-индикатор среда для титрования количества и концентрации NaOH. 800 мкл кислого крысы хвост коллагена придется обратиться оттенок красного цвета при смешивании с 210 мкл фондовом среды. Если концентрация NaOH слишком низкой коллагена решение будет желтеют, в связи с индикатором рН среды. Добавить коллагена для средних и микс без продуктовucing пузыри. Выполните следующие шаги на льду. Полимеризация происходит в течение 2 часов после решения коллагена и фондовых среды были смешаны и новый раствор инкубировали при 37 ° C. Проверьте это перед началом эксперимента. 1,3) смешать 800 мкл раствора коллагена с 210 мкл на складе среды (см. 1.2). Разместить 100 мкл этого раствора в скважинах 8 хорошо слайд камеры. Инкубируйте слайды при 37 ° C, 5% CO 2 и влажных условиях в культуре клеток инкубатора. Подготовка коллагена гелей под лавку культуре клеток и стерильных условиях. Коллагена gelatinizes в течение 2 часов.
2. Препарирование Эмбриональные SCGs
- Урожай эмбрионов времени беременных мышей (E16-18) из матки и держать их в PBS до дальнейших необходимости.
- Проанализируйте один эмбрион от амниона. Обезглавьте эмбриона хвостового из ключичной уровне. Исправить голову на блюде нижней кремния с "насекомое-иглы". Вентральной стороне головы имеет к лицу, чтобы выD Вы должны видеть подчелюстной области. Фиксация позволяет легче подготовки.
- Снимите кожу подчелюстной области слева и справа и с ним подкожной соединительной ткани.
- Снимите подчелюстной слюнной железы от их местонахождения, чтобы очистить вид на подъязычную, infrahyoidal мышц и кивательной мышцы.
- Удалить эти мышцы тщательно очистить вид на гортань и трахею. Удалить трахею и гортань. Сонной артерии, то видны с обеих сторон на предпозвоночные мышц. SCG расположена в бифуркации сонной артерии и имеет овальную форму. Осторожно снимите ганглиев и поместить их в PBS. Снимите ганглиев мягко рассечение инструментов, если они придерживаются их. Это выгодно, чтобы использовать щипцы, а также держатель иглы с установленными на "насекомое игла" для SCG удаления.
- После того как в PBS, хранить ганглиев при комнатной температуре в PBS, пока вы не расчлененные enouGH ганглиев. Затем очистите ганглиях из кровеносных сосудов и соединительной ткани. Выполните SCG вскрытие и очистка под микроскопом рассечение под скамейку ламинарного потока.
- Наконец, поместите эксплантированных ганглиев на желатинизированный гелей коллагена с помощью шприца иглы установлен на шприц для легкого обслуживания.
- Инкубируйте SCG эксплантов на желатинизированный коллагена в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO 2 и влажных условиях.
3. Лечение SCG Экспланты
- Через 1-2 ч инкубации, накройте SCG эксплантов, содержащие коллаген с 100 мкл культуральной среды Neurobasal ячейку, содержащую добавку B27, глутамин и антибиотики. Теперь скважин камеры слайды содержат объемом 200 мкл (100 мкл геля и 100 мкл среды). Добавить еще 200 мкл среды, однако теперь содержащих NGF (60 нг / мл), чтобы облегчить рост аксонов. Соответственно окончательный NGF концентрация составляет 30 нг / мл.
- Для исследования наступления SC миграции, добавить дополнительные факторы, непосредственно в день в пробирке 0 (div0). Растворите факторов в среде, содержащей NGF в двойной концентрации, необходимых (2).
- Для того, чтобы проанализировать воздействие на КА, которые уже начали мигрировать вдоль аксонов, добавить дополнительные факторы DIV3 до DIV4 (потенциальных остановки эксперимента). Для этого осторожно удалить 180 мкл раствора, в DIV3, и добавить 200 мкл среды, содержащей новые NGF и дополнительные факторы процентов в двойной концентрации (2).
4. Время изображений в заданный промежуток
Используйте инвертированный микроскоп для анализа. Различные цели могут быть использованы, определяющих поля зрения и увеличении. Одним из важных аспектов, однако, является рабочим расстоянием используемого цель, как визуализация SCG эксплантов осуществляется через предметное стекло и коллагенагель. Скорость записи кадра 1/10-30 минут показали хорошие результаты (2). Однако, этот аспект должен быть отрегулирован на научные вопросы. Нормальная ПЗС-камеры могут быть использованы для получения изображений. Для визуализации промежуток времени инкубации культуры клеток камера должна быть прикреплена к этапу микроскопом. Инкубируйте ткани во время съемки при 37 ° C, 5% CO 2 и влажных условиях. Начало одной инкубационной системы часа до начала обработки изображений. Это позволяет микроскоп части (например, цели), включая камеры слайда, чтобы приспособиться к температуре и предотвращает температуры индуцированной сугробы. Определить конкретные направления анализа (в пределах от эксплантов и между различными эксплантов) с помощью микроскопа программного обеспечения и программно-управляемых моторизованных этапе (многопозиционные установки) для одновременного анализа различных прикладных условия для SCG эксплантов. Для покадровой визуализации дикого типа ткани, а также ткани из трансгенных животных может быть использованамаркировки СКС (S100B: GFP) (3). Для визуализации флуорофоров флуоресцентных источников света должен быть реализован в micropscope установки. Используйте стандартные фильтры.
5. Количественное SC расстояния миграции
- В конечной точке (DIV4 например), исправить коллагена гель с 4% PFA в камере слайд в течение 3-4 часов. Последовательно мыть коллагена гели 5 раз в течение 10 мин с PBS. Примените стандартные протоколы для иммуноцитохимия (2). Если вы новичок в подготовке SCGs, проверять личность ганглий, как симпатические ганглии с помощью иммуногистохимии против тирозингидроксилазы (TH) общего маркера катехоламинергических клеток. Во время иммуногистохимии (после первичного антитела), передает эксплантов содержащих гелей коллагена в 24-луночные планшеты, которые имеют больший объем, что выгодно для мытья гелями.
- После иммуногистохимии, осторожно поместите коллагена гелей на стеклах. Осторожноудалите остатки раствора и пусть коллаген сухой / сократится до двух измерениях. Это позволяет легко измерений расстояний (2). После этого, установите образцов.
- Наконец, измерения миграции расстояния с помощью Фиджи (NIH) программного обеспечения. Никаких специальных плагинов необходимых для этой цели. Для обеспечения правильного измерения в мкм, проверить правильность метаданных изображений и настройки в соответствии с Фиджи, изображения и масштаба. Используйте Фиджи также для количественного определения клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рост аксонов облегчается от SCG эксплантов при обработке NGF (4) (фильм схеме S1 рисунке 1 схемы). Этот процесс хорошо виден на любой инвертированный микроскоп и может сопровождаться замедленной съемки (фильм S2). Если ученый является новым для рассечения SCG из мышиных эмбрионов мы настоятельно рекомендуем проверки техники, с помощью простого анти-тирозин гидроксилазы (TH) иммуногистохимии. TH является общим маркером для катехоламинергических нейронов (в данном случае симпатических нейронов), а также делает этикетку аксонов (рис. 2В). Посредством этого аксональной длины могут быть проанализированы в этой системе (2).
Важно отметить, что после того, как рост аксонов были вызваны, волна миграции клеток можно наблюдать (фильм S2 и S3). Миграция клеток были подтверждены как положительные S100 иммуно SC (2). Кроме того трансгенной линии мышей, в которых GFP находится под контролем человека s100b фрагмента промотора (3) может быть использован для прямого анализа меченый SC населения (2) (фильм S4 и S5). С помощью этой трансгенной линии этих экспериментов также может быть выполнена с конфокальной-или светло-лист микроскопии (не производится здесь).
Для анализа SC во время миграции, мы рекомендуем области анализа с низкой плотностью аксональной (рис. 1 крупным планом DIV3 и DIV4) и, таким образом небольшая популяция SC в области анализа. Это способствует лучшей возможности, чтобы увидеть морфологии клеток и клеточных поведения (фильм S3).
SC миграции расстояния можно измерять в конце эксперимента (например, DIV4). Для этого DAPI ядерной маркировка может быть выполнена на фиксированные ткани и расстояния от ведущих ядер SC до границы эксплантов может быть измерена с помощью Фиджи (NIH программное обеспечение) (рис. 2 схемы и DAPI маркировка) (2).Кроме того, также SC распространения или SC смерти могут быть проанализированы. Для этого иммуногистохимии для pHH3 или активированный каспазы 3 может быть выполнена, например, определения митотического или апоптоза клеток соответственно (2).
Рисунок 1. Схема показывает рост аксонов от эксплантированных SCG с течением времени (div0-DIV4). B / C: светлое изображение, записанное во время покадровой визуализации показывает крупным планом одной области SCG эксплантов на DIV3 (B) и DIV4 (C) (шкала-бар = 100 мкм).
Рисунок 2. Схема показывает SC (синий), а также расширенную аксонов (серый), выращенных из эксплантированных SCG (светло-синий) на DIV3 и DIV4. Миграция расстояния могут быть измерены по ядерной DAPI-меченных образцов путем измерения расстояния от ядра из ведущих SC до границы эксплантированных SCG в нескольких местах (C). TH иммуногистохимии (DIV4) должны быть выполнены, если ученый является новым для SCG рассечение. Положительные маркировки четко определяет эксплантированных ганглий, как симпатические ганглии (B). TH иммуногистохимии также дает анализ аксонов, выращенные из эксплантированных SCGs.
Фильм S1. Схема, показывающая рост аксонов от эксплантированных SCG в течение нескольких дней в пробирке. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Фильм S2. Рост аксонов и SC миграции из NGF рассматриваться SCG эксплантов. Изображениями началась в div2. Скорость записи составляет 1/30 мин. Масштаб-бар = 100 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
ntent "> Фильм S3. Крупным планом периферийной области SCG эксплантов. Из-за низкой плотности аксональной одного SC можно легко проанализировать. изображений старт был DIV3. Скорость записи была 1/10 мин. Масштаб-бар = 100 мкм . Щелкните здесь для просмотра фильмов .Фильм S4. Сочетание светлого и флуоресценции позволяет визуализировать S100 GFP положительные ПК и аксонов. Скорость записи была 1/10 мин. Масштаб-бар = 100 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Фильм S5. SC миграции на границе SCG эксплантов. Вот только флуоресценции канал показал позволяя легче интерпретации S100 GFP положительные SCs. Скорость записи была 1/10 мин. Масштаб-бар = 100 мкм./ 50016/50016movieS5.avi "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра фильмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Развитие периферической нервной системы является захватывающим процессом. При развитии завершен, аксоны ensheathed по SCs по всей длине, которая может, у людей, часто более 100 см. Для этого нужное количество необходимых SCs должно быть установлено в процессе разработки и SCs также должны двигаться вдоль аксонов расширения на периферии, чтобы обеспечить полное покрытие аксональной. Это справедливо для миелиновых но и для unmeylinated аксонов. В обоих случаях все аксоны находятся в контакте с ПК и зависят от их поддержки. Для изучения SC развития, анализы необходимы, которые принимают аксональной отсек учета и, следовательно, имитирующие в развитие естественных условиях к лучшей степени, чем царапина анализов (5), Boyden анализы (6) или камера может делать анализы. В некоторых анализах аксонов отсек был учтен уже. Например разделы седалищного нерва были использованы в качестве маршрутов для SCs мигрироватьа (7, 8), или SCs были со-культурной с нейронами, по которым аксоны они наблюдались мигрировать (9).
SCG эксплантов SC миграции анализа, однако, имеет еще больше преимуществ. Это особенно интересно, потому что SCs развиваются по своим физиологическим аксонов, и они сами продолжают расти. Кроме того, методика проста в освоении и требует лишь немного технических навыков вскрытия и не требует сложного взаимодействия культуры система нейронов и SCs. Совершенно аналогичные установки, однако не используют SCGs а КДГ, был предложен Gumy и коллеги (10). Однако, чтобы в полной мере использовать возможности такого анализа, обратной установки микроскопа необходимо позволяя покадровой обработки изображений. Важно, чтобы иметь возможность сделать "несколько позиций экспериментов", для того, чтобы иметь возможность анализировать дифференциально рассматриваться SCG эксплантов, расположенный в камере слайд, в то жевремени, что позволяет работать с оптимальным боковой панели бок с факторами интерес (2). Для анализа мы использовали только обычных световых и обычных флуоресценции (для трансгенных S100B: GFP мышей) микроскопии. Техника, однако, могут быть легко использованы с конфокальной или даже свет лист микроскопии (не производится здесь). Замедленной записи могут быть использованы для выявления конкретных свойств клеток / поведения во время миграции. Пока только дикого типа и трансгенных мышей были использованы (2). Тем не менее, трансфекции ПК и тем самым изменение путей с РНК-интерференции, например, должно быть возможным. С помощью этой техники он может быть даже можно проанализировать SC-аксон взаимодействие нормальных и измененных SC на той же или соседней аксона. Что касается миграции расстояния, SC распространения и SC выживание, анализ конечной точки может быть легко выполнена с помощью иммуногистохимии с DAPI ядерной маркировки и Фиджи (NIH) программного обеспечения. Однако, в конце концов, даже жизнь репоrter для пролиферации (11) и гибель клеток (12, 13) могут быть использованы, тем самым давая прямого считывания во время съемки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить Урмас Arumae для обмена коллагена протокол и Ютта Фей и Урсула Hinz за отличную техническую помощь. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить христианских Ф. Аккерман, Ульрике Энгель и Nikon Imaging центра при университете Гейдельберга, а также Йоахим Кирш за любезно помочь для видео shoting. Работа была частично финансируется за счет Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | Gibco | 21430 | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080 | |
| Glutamine | Gibco | 25030 | |
| NaOH | Merck | 109137 | |
| NGF | Roche | 1058231 | R&D#556-NG-100 |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504 | |
| antibiotics | Gibco | 15640 | |
| d-PBS | Gibco | 14040 | |
| insect needles | FST | 26002-20 | |
| syringe needle | Braun | BD # 300013 | |
| 8 well chamber slide | Lab tek | 177402 |
References
- Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
- Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6 (12), e28692 (2011).
- Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).
- Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).
- Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34 (1), 39-51 (2001).
- Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).
- Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).
- Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).
- Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).
- Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).
