Summary
एक साधारण विधि से निकाले जाते हैं और बनाए रखने के वयस्क चूहों से spermatogonial स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल लाइनों यहां प्रस्तुत किया है. विधि फीडर दैहिक सेल वयस्क माउस वृषण के डिब्बे से प्रारंभिक कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है. इस तकनीक ट्रांसजेनिक, नॉक आउट सहित आम माउस उपभेदों, के लिए लागू है, और चूहों दस्तक.
Protocol
1. फीडर कोशिकाओं की तैयारी
ध्यान दें कि सभी नीचे वर्णित अभिकर्मकों बाँझ फैशन में तैयार किया जाना चाहिए (1 टेबल्स और 2 देखें). यह प्रोटोकॉल का भक्षण है जो वयस्क माउस वृषण दैहिक कोशिकाओं के एक बदल व्युत्पन्न है और कहीं 3 में वर्णित किया गया है के रूप में JK1 सेल लाइन (सेल Biolabs, इंक, सूची # CBA 315) कार्यरत हैं. नोट भी है कि सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
- JK1 कोशिकाओं संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है और सफलतापूर्वक के रूप में इस्तेमाल किया भक्षण 39 पारित करने के लिए. फिल्टर निष्फल फीडर मध्यम विकास के 10 मिलीलीटर के साथ एक 100 मिमी सेल संस्कृति डिश (बी फाल्कन, 353003 # सूची) में JK1 कोशिकाओं संस्कृति (DMEM के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS], 2 मिमी एल glutamine और एंटीबायोटिक). जब संस्कृति 95% संगम तक पहुँचता है, कोशिकाओं 1:06 -1:10 अनुपात विभाजित.
- संगामी JK1 फीडर सेल मोनो से मध्यम निकालेंपरत.
- सेल परत एक बार पीबीएस के साथ कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना धो लें.
- पूर्व गर्म trypsin / EDTA, 1x (0.05% trypsin/0.53 मिमी EDTA, Corning Cellgro, सूची 25-051-CI #), और 37 डिग्री पर 5-10 मिनट के लिए सी सेते हैं.
- फीडर मध्यम विकास की एक समान मात्रा के साथ trypsin निष्क्रिय. कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 5 मिनट के लिए 300 XG अपकेंद्रित्र. फीडर मध्यम विकास में कोशिकाओं को स्थगित कर देते हैं.
- पूर्व कोट पर्याप्त 0.4% जेलाटीन समाधान जोड़ने के लिए अच्छी तरह से कवर और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के बाद हटा बहु - अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटें.
- ~ प्लेट जिलेटिन लेपित सेल संस्कृति प्लेट में 2 मिमी प्रति 250 कोशिकाओं (उदाहरण के लिए 48-अच्छी तरह से या 6-अच्छी तरह से प्रारूप). 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 से 24 घंटे के लिए संस्कृति सेते हैं.
- कुओं से संस्कृति के माध्यम से निकालें. चेतावनी: सेल के विकास को निष्क्रिय करने के लिए, 10 ग्राम / मिलीलीटर mitomycin सी की ताजा समाधान DMEM में पतला जोड़ने प्रत्येक अच्छी तरह से (जैसे 200 μl / अच्छी तरह से एक 48 अच्छी तरह से थाली के लिए). Mitomycin सी विषैला होता है. संभाल और देखभाल के साथ इसे के निपटान के. पर सेते37 डिग्री सेल्सियस 4 घंटा के लिए.
- कोशिकाओं से mitomycin - सी समाधान निकालें. DMEM साथ 3 बार से पहले धो चढ़ाना स्टेम कोशिकाओं.
- फीडर कोशिकाओं कुओं से DMEM निकालें और पर्याप्त passaging दौरान भक्षण के शुष्क्ीकरण को रोकने के लिए स्टेम सेल मध्यम (100 μl / अच्छी तरह से एक 48 अच्छी तरह से थाली, 3 टेबल देखें) को जोड़ने के लिए. SSCs उसी दिन जोड़ें, के रूप में 3.1 या 3.4 वर्गों में नीचे वर्णित है, भक्षण युक्त कुओं का संकेत आकार का उपयोग.
2. माउस वृषण ऊतक के पृथक्करण दाता जर्म कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए
- बाँझ फैशन में हार्वेस्ट वयस्क माउस testes और अस्थायी रूप से एक कवर पेट्री डिश (किसी तरल पदार्थ के बिना जोड़ा) में testes की दुकान है. पकवान तुरंत बर्फ पर रखा dessication को रोकने के लिए और सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने चाहिए.
- ¾ दूरी thr - बाँझ ठीक संदंश और एक सेल संस्कृति हुड में एक ठीक कैंची से काटना, पूरी तरह से वृषण (यानी, कट साढ़े ~ transecting बिना ट्युनिका धवल में एक अनुप्रस्थ चीराough) और संदंश का उपयोग करने के लिए थाली के एक कोने में बीजदार tubules निचोड़, त्यागें ट्युनिका और संलग्न ऊतक. भर में ऊतक ठंडा रखने के लिए, जिससे इसकी अखंडता को बनाए रखने और वाष्पीकरण को रोकने के लिए बर्फ पर थाली रखें.
- ठीक वसंत वृषण प्रति कम से कम 3 मिनट कैंची के साथ तेजी से tubules बोटी - बोटी करना, जबकि बर्फ पर थाली रखने.
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में छोटी नली टुकड़े एकत्र और ~ ठंडा / 1 पीबीएस% गोजातीय सीरम albumin की 40 मिलीलीटर में धो.
- शुक्राणु और मलबे से छोटी नली टुकड़े को अलग करने के लिए 10 मिनट के लिए 60 XG अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला त्यागें.
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, 3 पूर्व गर्म हदबंदी बफर के वृषण प्रति मिलीलीटर (DMEM, 0.05% ट्रिप्सिन, 0.03% Collagenase प्रकार मैं, 80 यू / मिलीलीटर की DNase मैं और 0.5% गोजातीय सीरम albumin में गोली resuspend, टेबल देखें हदबंदी बफर के अधिक विशिष्ट जानकारी के लिए) 2.
- शंक्वाकार ट्यूब क्षैतिज एक प्रकार के बरतन rpm 150 करने के लिए सेट में एक रैक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक को अधिकतम करने के लिए जगहgitation.
- 60 XG पर नीचे अलग undissociated विखंडू से एकल कक्षों के लिए 10 मिनट के लिए स्पिन.
- अगले कदम तक गोली युक्त विखंडू सहेजें. 2.8 कदम से सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए और 3 मिलीग्राम DMEM/10% भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ने हदबंदी बफर बेअसर. बर्फ ट्यूब पर अस्थायी रूप से रखें.
- दोहराएँ बचाया गोली के साथ 2.6 2.7 2.9 कदम से फिर से पचाने में 2.8 कदम के बाद शेष हिस्से को कदम.
- DMEM/10% FBS के एक बराबर मात्रा जोड़ें हदबंदी बफर बेअसर.
- 2.9 कदम से बचाया सेल निलंबन के साथ 2.11 कदम से recombine निलंबन. 300 x छ में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- Resuspend testes की जोड़ी प्रति 16 मिलीलीटर की मात्रा में स्टेम सेल मध्यम में गोली (3 तालिका देखें).
3. वृषण सेल सस्पेंशन चढ़ाना
- प्लेट सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर प्रति में अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से थाली युक्त फीडर कोशिकाओं में से 37 और और एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में mitomycin सी जगह के साथ mitotically निष्क्रियडिग्री सी, 5% सीओ 2.
- 48 घंटा, Aspirate मध्यम के बाद, 2 मिलीलीटर ताजा मध्यम जोड़ने और इनक्यूबेटर में लौटने.
- 48 घंटा के बाद, एक अच्छी तरह से 0.5 मिलीलीटर ताजा स्टेम सेल मध्यम जोड़ने और इनक्यूबेटर में लौटने.
- 48 घंटा के बाद, बाद में कोशिकाओं प्रति सप्ताह में तीन बार उसके बाद के रूप में बड़े, विचारशील कालोनियों (> 50 कोशिकाओं) दिखाई देते हैं (7 से 21 दिनों के भीतर) जब तक इस प्रकार है खिलाओ. 1 और 2 प्रत्येक सप्ताह खिला (जैसे सोमवार और बुधवार) के लिए माध्यम के 50% हटाने और वापस ताजा मध्यम की मात्रा से 50% जोड़ने. 3 खिलाने के लिए (शुक्रवार उदाहरण के लिए), सभी मध्यम aspirate और 2 मिलीलीटर ताजा मध्यम के साथ बदलें. यह तर्क है कि पूरा मध्यम परिवर्तन के परिहार paracrine संकेत है कि संस्कृति मध्यम 9 में स्रावित होते हैं की सांद्रता में उतार - चढ़ाव कम दृष्टिकोण पर आधारित है.
4. पहले पारित होने के लिए कॉलोनी उठा
- कुओं युक्त passaged कालोनियों से मध्यम निकालें और ताजा स्टेम सेल मध्यम जोड़ें.
- एक 10x उद्देश्य का उपयोग कालोनियों को पहचानें. खुर्दबीन के साथ थोड़ा - केंद्रित, सजातीय उज्ज्वल clumps, कई 11-12 सुक्ष्ममापी व्यास, कोशिकाओं में जो यह मुश्किल या व्यक्तिगत सेल बॉर्डर विचार असंभव है के शामिल के रूप में अच्छी तरह से किनारे पर एसएससी कालोनियों कोशिकाओं के बाद से दिखाई देगा आपस में जुड़े हुए (चित्रा 1 ए) दिखाई देते हैं. गैर - एसएससी कालोनियों गहरा, अधिक बारीक, या कम समरूप discernable सीमाओं (चित्रा 1 ए, इनसेट) के साथ दिखाई दे सकते हैं.
- 50 μl pipetteman सेट के साथ एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग करना, पहले अच्छी तरह से मध्यम लेने के लिए और टिप गीला को निष्कासित. फिर, धीरे से टिप के साथ तेजी से मध्यम के 50 μl वापस लेने से पहले टिप (चित्रा 1B) में चूषण द्वारा कॉलोनी स्थानच्युत करना कॉलोनी कुहनी से हलका धक्का.
- स्टेम सेल मध्यम (चित्रा 1C) के 100 μl के साथ एक 48-अच्छी तरह से निष्क्रिय फीडर कोशिकाओं से युक्त प्लेट की अच्छी तरह से एक में कॉलोनी युक्त मध्यम निष्कासित.
- दोहराएँ कदम4.3 और एक ही अच्छी तरह से 8 कालोनियों के लिए अच्छी तरह से प्रति 500 μl से अधिक के बिना जोड़.
- चरणों का 4.3 4.5 से पारित होने के एक एसएससी कालोनियों के साथ 48 अच्छी तरह से थाली के अतिरिक्त कुओं तैयार दोहराएँ.
- 7-14 दिनों में या 500 कोशिकाओं उभरा करने के लिए (चित्रा 1D) के बड़े clumps के बाद वेल्स को विभाजित करने के लिए तैयार हो जाएगा.
5. बाद और विचूर्णन द्वारा SSCs के विस्तार passaging
- एक मार्ग में कोशिकाओं के बाद ताजा भक्षण पर subcultured किया जाना चाहिए अप करने के लिए 14 दिनों के लिए पहले 3 मार्ग के लिए 1:2 के अनुपात में विभाजित और फिर 01:04 01:06 (हर 7 दिन) उसके बाद के रूप में इस प्रकार है. धीरे कोशिकाओं भर में मध्यम धोने से एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ कालोनियों एक अर्द्ध सहधारा अच्छी तरह से बंद (जैसे ~ 300.000 SSCs / 6 अच्छी तरह से थाली) महीन चुर्ण बनाना. कालोनियों detaching देखा जा सकता है. तरल के प्रवाह के साथ बहुत ज्यादा बल अवांछित फीडर कोशिकाओं से आने के लिए भी पैदा होगा.
- एक शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में triturated कोशिकाओं के लिए 300 XG लीजिए5 मिनट. नोट: एक trypsinization कदम सुरक्षित यहाँ जोड़ा जा सकता है अगर अन्वेषक द्वारा वांछित है.
- तैरनेवाला Aspirate और पूरी तरह pipetting और नीचे कालोनियों को बाधित करके ताजा स्टेम सेल माध्यम में फिर से को निलंबित.
- हौसले से तैयार फीडर mitomycin सी के साथ निष्क्रिय कोशिकाओं पर प्लेट SSCs के रूप में खंड 1 में वर्णित है.
- कोशिकाओं को तीन बार प्रति सप्ताह के रूप में इस प्रकार खिलाओ. पहले और दूसरे को खिलाने के लिए (उदाहरण के लिए सोमवार और बुधवार) ताजा मध्यम की मात्रा से 50% जोड़ने. 3 खिलाने के लिए (शुक्रवार उदाहरण के लिए), सभी मध्यम aspirate और 2 मिलीलीटर ताजा मध्यम के साथ बदलें. प्लेट्स 7-10 दिनों में सहधारा हो जाएगा. संस्कृति> 98% के बाद 5-7 मार्ग रोगाणु (यानी, <1% contaminating दैहिक कोशिकाओं) कोशिकाओं, immunostaining (जैसे murine रोगाणु सेल मार्कर का उपयोग कर GCNA) दैहिक 10 कोशिकाओं से रोगाणु कोशिकाओं को अलग आधार पर शामिल किया जाना चाहिए. नोट: इन विधियों इंस्टीट्यूशन द्वारा निर्धारित नियमों और आवश्यकताओं के साथ अनुपालन में विकसित किए गएअल पशु और वेल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज में उपयोग समिति की देखभाल.
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Representative Results
शून्य बीतने के जंगली प्रकार की उपस्थिति, 7 दिनों के बाद वयस्क एसएससी कालोनियों चित्र 1 में दिखाया गया है. तीन आयामी कालोनियों फ्लैट भक्षण या छोटा सा अफसर कोशिकी मैट्रिक्स शीर्ष पर बढ़ रही SSCs की कई परतों के साथ भक्षण द्वारा जमा जुड़ी कोशिकाओं की एक परत के शामिल हैं. जबकि स्वस्थ SSCs चमकीले refractile और समान रूप से 11-12 सुक्ष्ममापी व्यास, सेल सीमाओं भेद करने के लिए मुश्किल हैं और कालोनियों के आकार अत्यधिक चर दोनों अच्छी तरह से भीतर और विभिन्न चूहों से तैयार कुओं के बीच हो सकता है. कालोनियों के विज़ुअलाइज़ेशन एक डिजिटल प्रदर्शन और एक थोड़ा de केंद्रित नाभीय विमान है, जो अत्यधिक सजातीय एसएससी कालोनियों और contaminating दैहिक कोशिकाओं के बीच जो जल्दी (0-2) बीतने के संस्कृतियों में मौजूद हैं और इसके विपरीत बढ़ाता के साथ एक चरण खुर्दबीन द्वारा सहायता प्राप्त है फार्म नहीं कसकर बांध कालोनियों (इनसेट चित्रा 1A देखें). ध्यान दें कि फीडर कोशिकाओं के morphology धीरे - धीरे वायुसेना बदल जाएगाआतंकवाद DMEM/10% से स्विचन mitomycin C.It साथ निष्क्रियता के बाद सेल संस्कृति के माध्यम स्टेम भी ध्यान दें महत्वपूर्ण है कि प्रारंभिक सेल निलंबन फ़िल्टर्ड तनावपूर्ण है या नहीं, क्योंकि दैहिक कोशिकाओं के अवशिष्ट clumps में SSCs का अस्तित्व बढ़ाने के लिए लगा रहे हैं प्रारंभिक चढ़ाना और समय तक एसएससी कालोनियों की स्थापना कर रहे हैं नहीं हटाया जाना चाहिए. (5-7 बार) passaging सीरियल निकट एकरूपता (98%>) रोगाणु कोशिकाओं को शुद्ध और अवशिष्ट दैहिक कोशिकाओं खलाना करने के लिए आवश्यक है. यदि बाद के प्रयोगों को विशेष रूप से संस्कृति में रोगाणु कोशिकाओं की कुल जनसंख्या से स्टेम कोशिकाओं के संवर्धन की आवश्यकता होगी, तो सेल चयन immunomagnetic मोती का उपयोग कर या प्रवाह cytometry आगे शोधन के लिए नियोजित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, स्टेम सेल संवर्धन Thy1 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है , CD9 Integrin α6, और 11 अन्य. SSCs की पहचान होने के बाद immunophenotyping, जीन अभिव्यक्ति, और प्रत्यारोपण द्वारा का उपयोग कर पुष्टि transplantat के बाद से,आयन विश्लेषण निश्चित प्रामाणिक, कार्यात्मक स्टेम कोशिकाओं 12,13 की मात्रा का आकलन करने के लिए एक ही साधन है.
चित्रा 1. जल्दी एसएससी कालोनियों, वृषण stromal कोशिकाओं और भक्षण की आकारिकी., ~ 5 दिनों के बाद प्रारंभिक चढ़ाना नवजात एसएससी कालोनियों के रूप. इनसेट एक मार्ग शून्य संस्कृति में monocyte तरह दैहिक कोशिकाओं contaminating बी, और 48-अच्छी तरह प्लेटें में पहली मार्ग (~ 14 दिन) के लिए अलग - अलग कालोनियों के उठा के चयन से पता चलता है. काले संरचना विंदुक टिप सी, निष्क्रिय JK1 फीडर कोशिकाओं की उपस्थिति है. डी, बड़े दिनचर्या subculturing से पहले कालोनियों. तीर एसएससी कालोनियों से संकेत मिलता है. एक में स्केल पट्टी 100 सुक्ष्ममापी (इनसेट, 50 सुक्ष्ममापी) और बी.डी. में 200 मीटर है.
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Discussion
वयस्क SSCs वयस्क वृषण व्युत्पन्न फीडर कोशिकाओं का उपयोग कर पाने के लिए इस विधि मजबूत है और सफल जब आम आनुवंशिक (FVB जैसे, C57BL6 और 129SV/C57Bl/6 मिश्रित) पृष्ठभूमि और विभिन्न उत्परिवर्ती उपभेदों 2,3,7,14 कार्यरत थे. 7 वास्तव में, संस्कृति प्रणाली के द्वारा बनाई गई microenvironment vivo में वयस्क SSCs (- / जानवरों के plzf के मामले में उदाहरण के लिए) को बनाए रखने के लिए आनुवंशिक बाधाओं के उबरने के लिए कुछ करने के लिए पर्याप्त है. जब तक हम फीडर के रूप JK1 कोशिकाओं को रोजगार, गैर तब्दील वयस्क वृषण दैहिक कोशिकाओं भी JK1 2,3 कोशिकाओं के रूप में बराबर प्रभावोत्पादकता के साथ कर सकते हैं इस्तेमाल किया जा.
SESC कुशलता से लंबी अवधि के वयस्क एसएससी लाइनों प्राप्त करने के लिए डिजाइन किया गया था. दुर्भाग्य से, उच्च दक्षता निम्न कारण के लिए व्यापार बंद के साथ हासिल की है. प्रक्रिया का एक उल्लेखनीय सीमा है कि प्रारंभिक चढ़ाना के समय में एक कदम फ़िल्टरिंग या तनाव की चूक और हेरफेर है कि procedurई शामिल है, जो सेल अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं, सेल नंबर में पर्याप्त परिवर्तनशीलता अच्छी तरह से अच्छी तरह से चढ़ाया है, जो प्रारंभिक कॉलोनी गठन के स्तर पर प्रभावी quantitation precludes का कारण हो सकता है. हालांकि, मात्रात्मक assays थोड़ा बाद में पारित होने संस्कृतियों है जो समय पर एक ही सेल निलंबन आसानी मानक trypsinization (5-7 बीतने के>) द्वारा तैयार किया जा सकता है के साथ किया जा सकता है.
क्योंकि संस्कृति में वयस्क SSCs और विस्तारित किया जा सकता है और लगभग अनिश्चित काल से बनाए रखा है, इस प्रोटोकॉल सेल लाइनों है कि एक समान फैशन में बाद में कर सकते हैं अन्य स्थापित प्राथमिक संस्कृतियों या सेल लाइनों (यानी जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण या अस्थानिक अभिव्यक्ति करने के लिए प्रयोग किया जाता के कुशल उत्पादन में सक्षम बनाता है ब्याज की एक जीन). बहरहाल, यह अंत में सोने के मानक या किसी अन्य मान्य एसएससी क्लस्टर गठन 12,15 परख के रूप में किराए की परख, के रूप में प्रत्यारोपण विश्लेषण का उपयोग कर परिणाम की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है.
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Disclosures
एमएस एक लाइसेंस के माध्यम से वेल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज से रॉयल्टी प्राप्त सेल Biolabs इंक, JK1 कोशिकाओं को वितरित.
Acknowledgments
यह काम नई स्वास्थ्य के न्यूयॉर्क राज्य विभाग (C026878) द्वारा समर्थित किया गया. एमएस एक न्यूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन द्रुकेनमिलर फैलो था. अनुसंधान अनुदान नं 5 - FY11-571 ऑफ डाइम्स फाउंडेशन के मार्च से पार्ट में समर्थित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
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- Seandel, M., et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 449, 346-350 (2007).
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