Summary
ويرد طريقة بسيطة لاستخلاص والحفاظ الجذعية الظروف المناسبة وخطوط الخلايا السلف من الفئران البالغة هنا. الأسلوب يستخدم الخلايا المغذية القادمة من المقصورة الخلية الجسدية للخصية الفأر الكبار. هذه التقنية قابلة للتطبيق على سلالات الفئران شيوعا، بما في ذلك المعدلة وراثيا، خارج المغلوب، وتدق في الفئران.
Protocol
1. إعداد وحدة تغذية الخلايا
ملاحظة أنه ينبغي إعداد كل الكواشف هو موضح أدناه في الأزياء العقيمة (انظر الجدولين 1 و 2). هذا البروتوكول يعمل على خط خلية JK1 (خلية Biolabs، وشركة، وأنواع # CBA-315) مغذيات والذي هو مشتق من تحويل خلايا فأر بالغ الجسدية والخصية وقد وصفت في مكان آخر 3. نلاحظ أيضا أن يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية.
- يمكن الحفاظ على JK1 الخلايا في الثقافة واستخدمت بنجاح كما مغذيات حتى مرور 39. ثقافة JK1 خلايا في طبق 100 ملم زراعة الخلايا (BD الصقر، وأنواع # 353003) مع 10 مل من فلتر تعقيم المغذية المتوسطة النمو (DMEM تستكمل مع 10٪ الجنين مصل بقري [FBS]، 2 مم L-الجلوتامين والمضادات الحيوية). تقسيم عندما يصل التقاء الثقافة 95٪، ونسبة الخلايا 1:06 -1:10.
- إزالة المتوسطة من متموجة JK1 التغذية أحادية الخليةالطبقة.
- يغسل مرة واحدة مع طبقة الخلايا PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
- إضافة قبل تحسنت التربسين / EDTA، 1X (0.05٪ trypsin/0.53 ملي EDTA، كورنينج Cellgro، وأنواع # 25-051-CI)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
- تعطيل التربسين مع حجم مساو من النمو المتوسطة المغذية. جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق الخلايا في النمو المتوسطة المغذية.
- قبل معطف زراعة الخلايا متعددة وحات جيدة بما فيه الكفاية عن طريق إضافة محلول الجيلاتين 0.4٪ لتغطية البئر وإزالة بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- ~ 250 لوحة الخلايا في مم 2 في الخلية الجيلاتين المغلفة لوحة الثقافة (تنسيق مثل 48-جيدا أو 6 جيدا). احتضان الثقافة في C ° 37 من 16 إلى 24 ساعة.
- إزالة ثقافة المتوسط من الآبار. تنبيه: لتعطيل نمو الخلايا، إضافة إلى حل جديدة من ميتوميسين-C في 10 ميكروغرام / مل مخففة في DMEM إلى كل بئر (مثل 200 ميكرولتر / جيد لوحة 48 أيضا). ميتوميسين-C هي سامة. التعامل معها والتخلص منها بعناية. احتضان في37 ° C لمدة 4 ساعة.
- إزالة ميتوميسين-C حل من الخلايا. يغسل 3 مرات مع DMEM قبل الخلايا الجذعية الطلاء.
- إزالة الخلايا المغذية DMEM من الآبار وإضافة ما يكفي من الخلايا الجذعية متوسطة (100 ميكرولتر / جيد من 48 لوحة جيدا، وانظر الجدول 3) لمنع الجفاف من خلال الركض مغذيات. إضافة جان معايير الأمان في نفس اليوم، كما هو موضح أدناه في الأقسام 3.1 أو 3.4، استخدام أحجام المشار إليه يحتوي على مغذيات من الآبار.
2. تفكك نسيج الخصية ماوس للحصول على خلايا جرثومة المانحة
- الخصيتين الحصاد الماوس الكبار في عالم الأزياء العقيمة والتخزين المؤقت لالخصيتين في طبق بتري المغطاة (بدون أي سائل مضاف). يجب وضع الطبق على الفور على الجليد لمنع أصاب والحفاظ على بقاء الخلية.
- باستخدام ملقط معقم وغرامة غرامة مقص في خلية ثقافة هود، وجعل شق عرضي في الغلالة البيضاء الغلالة دون transecting تماما الخصية (أي قطع ½ ~ - ¾ المسافة عبتيough) واستخدام ملقط للضغط على الأنابيب المنوية في زاوية من اللوحة؛ الغلالة تجاهل والأنسجة المرفقة. تبقي لوحة على الجليد في جميع أنحاء الأنسجة للحفاظ على مبرد، مما يحافظ على سلامتها ومنع التبخر.
- اللحم المفروم بسرعة الأنابيب مع مقص الربيع غرامة لا تقل عن 3 دقائق في الخصية، مع الحفاظ على لوحة الجليد.
- جمع شظايا أنبوب صغير في أنبوب مخروطي 50 مل مل ويغسل في 40 ~ من المصل البقري المبرد PBS / 1٪ الألبومين.
- أجهزة الطرد المركزي في 60 x ج لمدة 10 دقيقة لفصل أجزاء من الحيوانات المنوية أنبوب صغير والحطام. تجاهل طاف.
- في أنبوب 15 مل المخروطية، وإعادة تعليق بيليه في 3 مل لكل من الخصية العازلة التفكك قبل تحسنت (DMEM، التربسين 0.05٪، 0.03٪ كولاجيناز نوع I، 80 U / مل من الدناز I و 0.5٪ مصل بقري الزلال، وانظر الجدول (2) لتفاصيل أكثر تحديدا من التفكك العازلة).
- وضع أنبوب مخروطي الشكل أفقيا في رفوف في مجموعة شاكر إلى 150 دورة في الدقيقة في C ° 37 لمدة 15 دقيقة لتحقيق أقصى قدر منgitation.
- تدور باستمرار في 60 x ج لمدة 10 دقيقة واحدة للخلايا منفصلة عن قطع undissociated.
- حفظ أجزاء تحتوي على بيليه حتى الخطوة التالية. جمع طاف من الخطوة 2.8 وإضافة 3 مل DMEM/10٪ مصل بقري جنيني لتحييد التفكك العازلة. وضع أنبوب على الجليد مؤقتا.
- كرر الخطوة 2،6 حتي 2،7 مع بيليه حفظ من الخطوة 2.9 إلى إعادة هضم قطع المتبقية بعد الخطوة 2.8.
- إضافة حجم مساو من FBS DMEM/10٪ لتحييد التفكك العازلة.
- التعليق أعد تجميع من الخطوة 2،11 مع التعليق الخلية حفظ من الخطوة 2.9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 300.
- إعادة تعليق بيليه في وسط الخلايا الجذعية في حجم من 16 مل لكل زوج من الخصيتين (انظر الجدول 3).
3. الطلاء من تعليق الخلية الخصية
- لوحة 2 مل من تعليق خلية لكل بئر في 6 خلايا لوحة المغذية بشكل جيد تحتوي على ميتوتيكلي] المعطل مع C-ميتوميسين ومكان في خلية حاضنة الثقافة في 37 ودرجة؛ C في 5٪ CO 2.
- بعد 48 المتوسطة، والموارد البشرية الرشفة، إضافة 2 مل الطازجة المتوسطة والعودة إلى الحاضنة.
- بعد 48 ساعة، إضافة 0.5 مل الخلايا الجذعية متوسطة جديدة إلى كل بئر والعودة إلى الحاضنة.
- بعد 48 ساعة، في وقت لاحق تغذية الخلايا ثلاث مرات في الأسبوع بعد ذلك على النحو التالي حتى كبيرة، والمستعمرات سرية (> 50 خلية) تظهر (في غضون 7 إلى 21 يوما). ل(الاثنين والأربعاء مثلا) الأولى والثانية تغذية إزالة كل أسبوع ~ 50٪ من المتوسط وإضافة إلى الوراء 50٪ من حجم متوسط الطازجة. للتغذية الثالثة (على سبيل المثال الجمعة)، نضح المتوسطة واستبدال جميع مع متوسط 2 مل الطازجة. ويستند هذا النهج على الأساس المنطقي أن تجنب التغييرات المتوسطة كاملة يقلل التقلبات في تركيزات إشارات نظير الصماوي أن تفرز في ثقافة المتوسط 9.
4. الإلتقاط المستعمرة لمرور الأول
- إزالة المستعمرات المتوسطة من الآبار التي تحتوي على أن passaged وإضافة جديدة المتوسطة الخلايا الجذعية.
- تحديد الهدف باستخدام المستعمرات 10X. مع المجهر قليلا دي مركزة، سوف المستعمرات SSC على حافة البئر تظهر كتل متجانسة مشرق، يتألف من العديد من الخلايا قطر 11-12 ميكرومتر، والتي من الصعب أو من المستحيل تمييز حدود الخلايا الفردية، لأن الخلايا تظهر تنصهر معا (الشكل 1A). يجوز لغير SSC المستعمرات تظهر أكثر قتامة وأكثر الحبيبية، أو متجانسة أقل، بحدود ملحوظ (الشكل 1A، أقحم).
- باستخدام ماصة تلميح إلي 200 ميكرولتر، مع مجموعة pipetteman إلى 50 ميكرولتر، واتخاذ أولا المتوسطة من البئر وطرد لترطيب الطرف. ثم، دفع بلطف مع طرف مستعمرة قبل الانسحاب بسرعة 50 ميكرولتر من المتوسط لطرد المستعمرة عن طريق الشفط في تلميح (1B الشكل).
- طرد المتوسطة التي تحتوي على مستعمرة واحدة من لوحة جيدا 48-المغذية بشكل جيد تحتوي على خلايا المعطل مع 100 ميكرولتر من الخلايا الجذعية متوسطة (الشكل 1C).
- كرر الخطوة4.3 و تضيف ما يصل إلى 8 المستعمرات إلى البئر نفسه دون تجاوز 500 ميكرولتر لكل بئر.
- كرر الخطوات 4،3 حتي 4،5 لإعداد آبار إضافية من لوحة 48 جيد مع مرور SSC المستعمرات واحد.
- وسوف تكون على استعداد لآبار تقسيم في 7-14 أيام أو بعد كتل كبيرة تصل إلى خلايا ظهرت دينا 500 (1D الشكل).
5. لاحقة التوسع والركض من جان معايير الأمان من سحن
- وينبغي subcultured الخلايا في إحدى الفقرات على مغذيات جديدة بعد تصل إلى 14 يوما في نسبة انقسام 01:02 لأول 3 مقاطع ومن ثم 1:04 حتي 01:06 (كل 7 أيام) بعد ذلك على النحو التالي. يسحن بلطف المستعمرات من بئر شبه متموجة (على سبيل المثال ~ 300،000 جان معايير الأمان / 6 جيدا جيدا لوحة) مع نصيحة 1 مل ماصة عن طريق الغسيل المتوسطة عبر الخلايا. ويمكن ملاحظة مستعمرات فصل. والكثير من القوة مع تيار من السائل يدفع الخلايا المغذية للخروج من الملعب غير المرغوب فيها أيضا.
- جمع الخلايا triturated في أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة5 دقائق. ملاحظة: قد يكون خطوة trypsinization أضاف بأمان هنا إذا رغبت من قبل المحقق.
- نضح طاف والمتوسطة في الخلية الجذعية الطازجة إعادة تعليق من جانب pipetting بدقة أعلى وأسفل لتعطيل المستعمرات.
- جان معايير الأمان على الخلايا المغذية لوحة الطازجة المعطل مع ميتوميسين-C كما هو موضح في القسم 1.
- تغذية الخلايا ثلاث مرات في الأسبوع على النحو التالي. للتغذية الأولى والثانية (على سبيل المثال الاثنين والأربعاء) إضافة 50٪ من حجم متوسط الطازجة. للتغذية الثالثة (على سبيل المثال الجمعة)، نضح المتوسطة واستبدال جميع مع متوسط 2 مل الطازجة. وسوف تصبح لوحات متموجة في 7-10 أيام. يجب أن تتألف من الثقافات> الخلايا الجرثومية 98٪ (أي <1٪ تلويث الخلايا الجسمية) بعد الممرات 5-7 و يعتمد على المناعية (على سبيل المثال باستخدام الخلايا الجرثومية الفئران علامة GCNA) لتمييز الخلايا الجرثومية من خلايا جسدية 10. ملاحظة: تم تطوير تلك الأساليب في الامتثال للأنظمة والشروط المنصوص عليها من قبل المؤسسةشركة رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام في كلية طب وايل كورنيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ظهور نوع صفر مرور البرية، يظهر الكبار المستعمرات SSC بعد 7 أيام في الشكل 1. وتتكون ثلاثية الأبعاد من المستعمرات طبقة من الخلايا المسطحة التي تعلق على مغذيات أو مصفوفة خارج الخلية تلميذه المودعة من قبل مغذيات مع طبقات متعددة من جان معايير الأمان المتزايد على القمة. في حين جان معايير الأمان الصحي وسهل الانكسار الزاهية وبشكل موحد 11-12 ميكرومتر قطرها، وحدود الخلية من الصعب تمييزها وحجم المستعمرات قد تكون متغيرة بصورة كبيرة، سواء داخل البئر وبين آبار أعدت من الفئران مختلفة. ويساعد التصور من المستعمرات بواسطة المجهر المرحلة مع العرض الرقمي وطائرة دي قليلا تركز على التنسيق، التي تعزز من التناقض بين المستعمرات SSC متجانسة للغاية وتلويث الخلايا الجسدية التي هي موجودة في وقت مبكر مرور (0-2) الثقافات والقيام لا تشكل مستعمرات معبأة بإحكام (انظر الشكل 1A الشكل). نلاحظ أن مورفولوجيا الخلايا المغذية سوف تتغير تدريجيا AFثالثا التحول من DMEM/10٪ لوقف خلية ثقافة المتوسط بعد تعطيل مع C.It-ميتوميسين المهم أيضا ملاحظة أنه لا يتم تصفية التعليق خلية أولية أو متوترة، وذلك لأن ويعتقد أن كتل المتبقية من الخلايا الجسدية لتعزيز بقاء جان معايير الأمان في يجب أن لا وقت الطلاء الأولي وإزالتها حتى يتم تأسيس المستعمرات SSC. مطلوب مسلسل الركض (> مرات 5-7) لتنقية الخلايا الجرثومية إلى التجانس بالقرب من (> 98٪) المتبقية واستنزاف الخلايا الجسدية. ويمكن الحصول على على سبيل المثال، وقف تخصيب الخلية باستخدام أجسام مضادة ضد Thy1، وإذا التجارب اللاحقة سوف يتطلب على وجه التحديد تخصيب الخلايا الجذعية من مجموع السكان من الخلايا الجرثومية في الثقافة، ثم تحديد الخلية باستخدام الخرز immunomagnetic أو يمكن استخدام التدفق الخلوي نحو المزيد من التنقية ، CD9، α6 إنتغرين و 11 آخرين. وينبغي على هوية جان معايير الأمان أكد في وقت لاحق باستخدام المناعي الظاهري، التعبير الجيني، وزراعة الأعضاء، منذ transplantatأيون التحليل هو الوسيلة الوحيدة لتقييم نهائي كمية أصيلة، والخلايا الجذعية الوظيفية 12،13.
الشكل 1. مورفولوجية المستعمرات SSC في وقت مبكر، والخلايا اللحمية الخصية مغذيات. A، المظهر من المستعمرات SSC الوليدة ~ 5 أيام بعد الطلاء الأولي. أقحم يظهر تلويث الوحيدات مثل الخلايا الجسدية في ممر الثقافة الصفر. B، اختيار وانتقاء من المستعمرات الفردية للمرور الأول (~ 14 يوما) في 48-وحات جيدة. هيكل الأسود هو غيض ماصة. C، ظهور الخلايا المغذية JK1 المعطل. D، مستعمرات كبيرة قبل subculturing الروتينية. تشير الأسهم المستعمرات SSC. شريط النطاق في A هو 100 ميكرون (أقحم، 50 ميكرومتر) وBD هو 200 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الأسلوب لاشتقاق الكبار جان معايير الأمان باستخدام الخلايا المغذية للخصية الكبار المستمدة قوية ونجحت عندما كانوا يعملون الخلفيات الوراثية الشائعة (مثل FVB، وC57Bl6 129SV/C57Bl/6 مختلطة) وسلالات متحولة مختلفة 2،3،7،14. في الواقع، فإن المكروية التي أنشأتها الثقافة هي نظام كافية للتغلب على بعض الحواجز الوراثية للحفاظ على الكبار جان معايير الأمان في الجسم الحي (على سبيل المثال في حالة plzf - / - الحيوانات) 7. بينما نحن توظيف JK1 الخلايا كما مغذيات، ويمكن أيضا تحويل غير البالغين الخصية الخلايا الجسمية استخدامها مع فعالية متساوية مع JK1 خلايا 2،3.
تم تصميم SESC للحصول على كفاءة على المدى الطويل البالغين خطوط SSC. للأسف، يتم تحقيق كفاءة عالية مع المفاضلة للسبب التالي. وجود قيود ملحوظة من هذا الإجراء هو أن إغفال خطوة تصفية أو توتر في وقت الطلاء الأولي وتلاعب ان الاجراءه ينطوي، التي يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية، قد تسبب تقلبات كبيرة في أعداد الخلايا مطلي بشكل جيد لمن حسنا، ما يحول دون تحديد الكميات فعالة في مرحلة تشكيل مستعمرة الأولي. ومع ذلك، يمكن إجراء فحوصات الكمية في وقت لاحق مع مرور الثقافات قليلا في الوقت الذي يمكن تعليق خلية واحدة مستعدة بسهولة عن طريق trypsinization القياسية (> مرور 5-7).
لأنه يمكن توسيع جان معايير الأمان الكبار في الثقافة والمحافظة عليها إلى ما لا نهاية تقريبا، هذا البروتوكول يتيح للكفاءة الإنتاج من خطوط الخلايا التي يمكن استخدامها في وقت لاحق بطريقة مماثلة على الثقافات الأخرى الأساسية التي أنشئت أو خطوط الخلايا (أي تحليلات التعبير الجيني والبروتين أو التعبير خارج الرحم من جين من الفائدة). ومع ذلك، فإنه من الضروري لتأكيد النتائج في نهاية المطاف باستخدام التحليل زرع كمعيار الذهب أو لآخر فحص بديل التحقق من صحة، مثل تشكيل كتلة SSC الفحص 12،15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MS يتلقى الإتاوات من كلية طب وايل كورنيل من خلال الترخيص لشركة الخليوي، Biolabs لتوزيع JK1 الخلايا.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل إدارة ولاية نيويورك للصحة (C026878). كان لMS الخلايا الجذعية الجديدة يورك مؤسسة، Druckenmiller زميل. بدعم جزئي من البحوث منحة رقم 5 FY11-571 من مارس من الدايمات مؤسسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).
- Seandel, M., et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 449, 346-350 (2007).
- Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells. Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).
- Ogawa, T., et al. Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines. Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).
- Schmidt, J. A., et al. In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function. Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).
- Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. Aging of male germ line stem cells in mice. Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).
- Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1. Cell. 142, 468-479 (2010).
- Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).
- Csaszar, E., et al. Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling. Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).
- Enders, G. C., May, J. J. Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female. 163, 331-340 (1994).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).
- Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).
- Arnold, K., et al. Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice. Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).
- Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).
