העשרה סידורית של גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) בתרבות לגזירת קווי SSC מאוסים למבוגרים לזמן ארוך

Summary

שיטה פשוטה לגזור ולשמור גזע spermatogonial ושורות תאי אב מעכברים בוגרים מוצגת כאן. השיטה מנצלת תאים מזינים שמקורם מתא תא סומטי מאשכי העכברים הבוגרים. טכניקה זו היא ישימה זנים נפוצים, כוללים עכבר מהונדס מוחץ, ולדפוק בעכברים.

Abstract

גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) של האשך מייצגים דוגמה קלסית לתאי גזע של יונקי בוגרים ולשמר פוריות לכמעט כל החיים של בעלי החיים. בעוד המנגנון המדויק ששולט בהתחדשות עצמית ובידול in vivo מאתגר למחקר, מערכות שונות שפותחו בעבר כדי להפיץ SSCs Murine במבחנה באמצעות שילוב של אמצעי תקשורת תרבות מיוחד ותאים מזינים ^1-3.

רוב הגיחות במבחנה לביולוגיה של SSCs שנבעו משורות תאי ילודים, אולי בשל הקושי בהשגת שורות תאי בוגרים ^4. עם זאת, האשך ממשיך להבשיל עד ~ 5 שבועות של גיל ברוב הזנים של עכברים. בתקופה הראשונה שלאחר הלידה, שינויים דרמטיים בארכיטקטורה של האשך ובביולוגיה של תאים והן גופניים spermatogenic, כוללים שינויים ברמות הביטוי של גזע רב הקשור לתאגנים. לכן, קווי SSC נגזרים-neonatally לא יכולים לסכם באופן מלא את הביולוגיה של SSCs המבוגר כי נמשך לאחר האשך המבוגר הגיע למצב יציב.

מספר גורמים שעכבו את הייצור של קווי מבוגרי SSC מבחינה הסטורית. ראשית, חלקם של תאי גזע פונקציונליים עשוי לרדת במהלך הבגרות, או בשל גורמים פנימיים או חיצוניים ^5,6. יתר על כן, כמו בתאי גזע בוגרים אחרים, זה כבר קשה להעשיר SSCs מספיק תאים מאשכים בוגרים כלל ללא שימוש בשילוב של אסטרטגיות מיון immunoselection או אחרות ^7. אסטרטגיות מועסק נפוץ כוללות שימוש בעכברים טמירים כמקור לתאי תורם בשל יחס גבוה יותר של תאי גזע לתאים מסוגים אחרים ^8. בהתבסס על ההשערה כי הסרת תאים הסומטיים מהתרבות הראשונית משבשת אינטראקציות עם נישת תאי הגזע שהם חיוניים להישרדות SSC, פתחו שיטות עבר כדי להפיק ליטר מבוגראינס, שאינו דורש immunoselection או תורמים טמירים אלא להעסיק העשרה סידורית של SSCs בתרבות, המכונה להלן כSESC ^2,3.

השיטה המתוארת להלן כרוכה הליך פשוט לגזירת קווי SSC במבוגרי dissociating תורם המבוגר seminiferous tubules, ואחריו ציפוי של תאים במתקני ההאכלה המורכבות משורת אשכי סטרומה תא (JK1) ^3. דרך סידורי passaging, חזק נדבק, לזהם תאי ניבט שאינו מתרוקנים מהתרבות עם העשרה קשורה של SSCs. תרבויות שנוצרו בדרך זו מכילות תערובת של spermatogonia בשלבים שונים של התמיינות, המכילות SSCs, המבוסס על יכולת התחדשות עצמית לטווח ארוך. עיקרה של שיטת SESC הוא שהוא מאפשר SSCs לבצע את המעבר הקשה מהתחדשות עצמית in vivo להתחדשות עצמית לטווח ארוך במבחנה בmicroenvironment שונה בתכלית, מייצר קווי SSC לטווח ארוך, ללא זיהוםתאים הסומטיים, ובכך מאפשר מניפולציה ניסויית הבאה של SSCs.

Protocol

1. הכנת תאי Feeder

שים לב שכל המגיבים המתוארים להלן צריכים להיות מוכנים בצורה סטרילית (ראה לוחות 1 ו 2). פרוטוקול זה מעסיק שורת תאי JK1 (Cell Biolabs, Inc, קטלוג # CBA-315) כמאכילים שהוא נגזר הפך לתאים בוגרים עכבר אשכים סומטיות וכבר תארו במקום אחר ^3. שימו לב גם שכל הליכי בעלי החיים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ותקנות מוסדיות.

1. JK1 תאים יכולים להישמר בתרבות ובשמשו בהצלחה כמאכילים עד חלוף 39. תרבות JK1 תאים בצלחת 100 מ"מ תא תרבות (BD פלקון, קטלוג # 353003) עם 10 מ"ל של מדיום גידול מזין מסנן מעוקר-(DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי [FBS], 2 מ"מ L-גלוטמין ואנטיביוטיקה). כשמגיעה למפגש התרבות 95%, לפצל את התאים 1:06 -1:10 יחס.
2. הסירו בינוני ממונו תא confluent JK1 מזיןשכבה.
3. שטוף את שכבת תאים פעם עם PBS בלי סידן ומגנזיום.
4. הוסף טריפסין מראש מחומם / EDTA, 1x (trypsin/0.53 mM EDTA 0.05%; קטלוג קורנינג Cellgro, # 25-051-CI), ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 5-10.
5. להשבית טריפסין עם נפח שווה של מדיום גידול מזין. איסוף תאים וסרכזת ב 300 XG למשך 5 דקות. Re-להשעות תאים במדיום גידול מזין.
6. טרום מעייל צלחות רבות גם תא תרבות על ידי הוספת 0.4% פתרון ג'לטין מספיק כדי לכסות היטב ומסירים אחרי 5 דקות בטמפרטורת חדר.
7. צלחת ~ 250 תאים למ"מ ² בצלחת תרבית תאי ג'לטין המצופה (למשל בפורמט 48 היטב או 6-היטב). דגירת תרבות על 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.
8. הסר תרבות בינונית מבארות. זהירות: כדי להשבית את גדילת תאים, להוסיף פתרון חדש של mitomycin-C ב 10 מיקרוגרם / מ"ל המדולל בDMEM לכל באר (200 μl למשל / גם לצלחת גם 48). Mitomycin-C היא רעילה. לטפל ולהיפטר ממנו בזהירות. לדגור על37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
9. הסר פתרון mitomycin-C מתאים. לשטוף 3 פעמים עם DMEM לפני ציפוי תאי גזע.
10. הסר DMEM מתאי מזין בארות ולהוסיף את המקור של תאי גזע (100 μl / גם של צלחת גם 48; ראה טבלה 3) מספיק כדי למנוע התייבשות של המאכילים במהלך passaging. הוסף SSCs באותו היום, כפי שיתואר להלן בסעיפי 3.1 או 3.4, באמצעות גדלים מצוינים של בארות המכילות מתקני האכלה.

2. התפרקות של רקמות אשך מאוס להשיג תאי ניבט תורם

1. אשכי קציר מבוגרי עכבר בצורה סטרילית ולאחסן באופן זמני את האשכים בצלחת פטרי מכוסית (ללא נוזל הוסיף). המנה חייבת הניחה מייד על קרח כדי למנוע dessication ולשמור על כדאיויות תא.
2. שימוש במלקחיים עדינים סטריליים ומספרי קנס בברדס תרבית תאים, לעשות חתך רוחבי בalbuginea Tunica ללא חוצה את האשך (כלומר, לחתוך ~ ½ לחלוטין - ¾ מרחק through) ולהשתמש במלקחיים כדי לסחוט tubules seminiferous לפינה של הצלחת; Tunica נזרק ורקמות מצורפות. שמור על צלחת על קרח לאורך לשמור על רקמה מצוננת, ובכך השמירה על שלמותה ומניעת אידוי.
3. מהירות לרכך tubules עם מספריים נאים של האביב לפחות 3 דקות לאשכים, תוך שמירה על צלחת על קרח.
4. לאסוף את שהברים אבובית בצינור חרוטים 50 מ"ל ולשטוף ב~ 40 מ"ל של סרום שור% PBS / 1 מצונן אלבומין.
5. צנטריפוגה XG ב 60 למשך 10 דקות כדי להפריד ברים אבובית מתאי זרע ופסולת. בטל supernatant.
6. בצינור 15 מיליליטר חרוטים, resuspend גלול ב 3 מ"ל לאשך של דיסוציאציה החיץ מראש התחמם (DMEM, טריפסין 0.05%, 0.03% סוג collagenase אני, שור אלבומין 80 U / מ"ל של DNAse אני ו0.5% בסרום; ראה טבלה 2 לפרטים יותר ספציפיים של דיסוציאציה חיץ).
7. הנח את צינור החרוטים אופקיים במתלה בסט שייקר עד 150 סל"ד על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות על מנת למקסםgitation.
8. ספין למטה XG ב 60 למשך 10 דקות לתאים יחידים נפרדים מגושי undissociated.
9. שמור את הגלולה המכילים נתחים עד לשלב הבא. איסוף supernatant מהשלב 2.8 ולהוסיף DMEM/10% סרום 3 מיליליטר עוברים מבקרים לנטרל חיץ דיסוציאציה. הנח צינור על קרח באופן זמני.
10. חזור על השלב 2.6-2.7 עם הגלולה הצילה מצעד 2.9 לנתחים מחדש לעכל שנותרו לאחר השלב 2.8.
11. הוסף נפח שווה של DMEM/10% FBS לנטרל חיץ דיסוציאציה.
12. השעית recombine מצעד 2.11 עם השעית תא הציל מצעד 2.9. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
13. Resuspend גלולה במדיום בתאי גזע בנפח של 16 מ"ל לזוג אשכים (ראה טבלה 3).

3. ציפוי של השעית תא אשכים

1. 2 מיליליטר צלחת של השעית תא להיטב בתאים מזינים 6-כן צלחת המכיל mitotically-להיכבות עם mitomycin-C ומקום בתא תרבות חממה ב 37 &מעלות; C ב 5% CO _2.
2. לאחר 48 שעות בינוניות, aspirate, להוסיף 2 מ"ל בינוני טרי ולחזור לחממה.
3. אחרי 48 שעות, להוסיף 0.5 מ"ל בינוני טריה בתאי גזע לכל באר ולחזור לחממה.
4. לאחר 48 שעות, לאחר מכן להאכיל את התאים שלוש פעמים בשבוע לאחר מכן, כמפורט להלן עד מושבות גדולות, דיסקרטיות (> 50 תאים) מופיעות (תוך 7 עד 21 ימים). להאכלה ראשון והשני בכל שבוע (למשל יום שני ויום רביעי) להסיר ~ 50% הבינוניים ולהוסיף 50% בחזרה על ידי נפח בינוני טריה. להאכלה שלישית (לדוגמא יום שישי), לשאוב כל המדיום ולהחליף עם 2 מ"ל בינוני טריה. גישה זו מבוססת על הנימוק שהימנעות משינויים בינוניים מלאים ממזערת תנודות בריכוזים של אותות paracrine שמופרשים למדיום התרבות ^9.

4. קטיף מושבה למעבר ראשון

1. הסר בינוני ממושבות בארות המכילות להיות passaged ולהוסיף את מקור תאי גזע טרי.
2. זהה את המושבות באמצעות אובייקטיבי 10x. עם מיקרוסקופ מעט דה ממוקדת, מושבות SSC בקצה גם תופענה כגושים בהירים הומוגניים, מורכבים מהרבה תאי 11-12 קוטר מיקרומטר, שבם קשה או בלתי אפשרי להבחין בגבולות התא הבודדים, שכן התאים מופיע התמזג יחד (איור 1 א). מושבות ללא SSC עשויות להופיע כהות יותר, מפורטות יותר, או פחות הומוגני, ניתן להבחין בגבולות (איור 1 א, הבלעה).
3. באמצעות קצה פיפטה 200 μl, עם סט pipetteman עד 50 μl, לקחת 1 עד בינוני מהבאר ולגרש להרטיב את הקצה. ואז, בעדינות לדחוף את המושבה עם הקצה לפני הנסיגה של 50 μl בינוני במהירות כדי לסלק את המושבה על ידי יניקה לקצה (1B איור).
4. לגרש את המדיום המכיל את המושבה לאחת גם בצלחת 48-גם מזין המכילה תאים מומתים עם 100 μl של מדיום תאי גזע (האיור 1C).
5. חזור על שלב4.3 ולהוסיף עד 8 מושבות לאותו גם בלי העולה על 500 μl לטוב.
6. חזור על שלבים 4.3-4.5 להכין בארות נוספות של הצלחת גם 48 עם מושבות קטע אחד SSC.
7. הוולס יהיה מוכן לפצל ב7-14 ימים או אחרי גושים גדולים של עד 500 תאים צמחו (1D איור).

5. לאחר ההרחבה וPassaging של SSCs ידי טחינה דקה

1. תאים בקטע אחד יש subcultured על מתקני האכלה טריים לאחר עד 14 יום בביחס פיצול של 01:02 ל3 הקטעים הראשונים ולאחר מכן 1:04-01:06 (כל 7 ימים) לאחר מכן כדלקמן. עדינות triturate מושבות off היטב למחצה confluent (למשל ~ 300.000 SSCs / היטב צלחת 6-היטב) עם טיפ 1 מיליליטר פיפטה ידי שטיפה בינונית על פני התאים. מושבות ניתן לראות ניתוק. יותר מדי כוח עם הזרם של נוזל יגרום לתאים מזינים בלתי רצויים לבוא גם ממנו.
2. איסוף תאים נכתשו בצינור וצנטריפוגה חרוטים ב 300 XG עבור5 דקות. הערה: צעד trypsinization ניתן להוסיף בבטחה כאן אם רצוי על ידי החוקר.
3. לשאוב supernatant מחדש להשעות במדיום תאי גזע טרי על ידי pipetting יסודיות למעלה ולמטה כדי לשבש מושבות.
4. SSCs צלחת על תאים מזינים טרייה מומתים עם mitomycin-C כמתואר בסעיף 1.
5. להאכיל את התאים שלוש פעמים בשבוע, כמפורט להלן. להאכלה ראשונה ושנייה (לדוגמא יום שני ורביעים) להוסיף 50% לפי נפח בינוני טריה. להאכלה שלישית (לדוגמא יום שישי), לשאוב כל המדיום ולהחליף עם 2 מ"ל בינוני טריה. צלחות תהפוכנה confluent כעבור 7-10 ימים. תרבויות צריכות להיות מורכבות מתאים> 98% ניבט (כלומר, תאים <1% מזהמים גופניים) אחרי 5-7 קטעים, המבוססים על immunostaining (למשל באמצעות העכברי ניבטו תא סמן GCNA) כדי להבדיל תאי ניבט מתאים הסומטיים ^10. הערה: שיטות אלו פותחו בעמידה בתקנות ובדרישות שנקבעו על ידי המכוןטיפול בבעלי חיים ואל הוועדה השתמש ב-Weill Cornell Medical College.

Representative Results

הופעתו של זן בר חלוף אפס, מושבות בוגרות SSC לאחר 7 ימים מוצגת באיור 1. מושבות תלת ממדיות מורכבות משכבה של תאים שטוחים המחוברים למתקני ההאכלה או המטריצה ​​זוטרה תאית שהפקידו את מתקני ההאכלה בשכבות מרובות של SSCs גידול בראש. בעוד SSCs הבריא הם בהיר ואחיד refractile 11-12 קוטר מיקרומטר, את גבולות התא הם קשים להבחין והגודל של המושבות עשוי להיות שונה מאוד, היא בתוך הבאר ובין בארות שהוכנו מעכברים שונים. ויזואליזציה של המושבות נעזרה במיקרוסקופ שלב עם תצוגה דיגיטלית ומוקד מטוס מעט דה ממוקדת, המעצים את הניגוד בין מושבות הומוגניות מאוד SSC ותאים סומטיים מזהמים אשר נמצאות במעבר מוקדם (0-2) תרבויות ולעשות לא ליצור מושבות צפופות (ראה איור 1 א הבלעה). שים לב שהמורפולוגיה של התאים המזינים תשתנה בהדרגת after עובר מDMEM/10% כדי לבלום בינוני תרבית תאים לאחר איון עם mitomycin-C.It חשוב גם לציין כי השעית התא הראשונית אינה מסוננת או מתוח, כי גושי שייר של תאים הסומטיים הם חשבו כדי לשפר את ההישרדות של SSCs ב הזמן של ציפוי וראשוני אין להסירו עד מושבות SSC מבוססות. סידורי passaging (> זמני 5-7) נדרש כדי לטהר את תאי ניבט להומוגניות קרובה (> 98%) וימוצה תאים הסומטיים שיורית. אם הניסויים באים באופן ספציפי ידרשו העשרה של תאי גזע מהאוכלוסייה של תאי ניבט בתרבות, ולאחר מכן בחירת תא באמצעות חרוזי immunomagnetic או cytometry זרימה יכול להיות מועסק לטיהור נוספת, למשל, נובעת העשרת תא ניתן להשיג באמצעות נוגדנים נגד Thy1 , CD9, α6 integrin ואחרים ^11. זהותו של SSCs צריכה להיות אשרה לאחר מכן באמצעות immunophenotyping, ביטוי גנים, ועל ידי השתלה, מאז transplantatניתוח היון הוא האמצעי היחיד בודאות כדי להעריך את כמות תאי גזע פונקציונליים אותנטיים, ^12,13.

איור 1. מורפולוגיה של המושבות הראשונות SSC, תאי סטרומה אשכים ומזינים., מראה של מושבות SSC מתהוות ~ 5 ימים לאחר ציפוי ראשוני. מופעי הבלעה מזהמת תאים הסומטיים monocyte דמויים בתרבות אפס מעבר. ב ', בחירה וקטיף של מושבות בודדות עבור המעבר ראשון (~ 14 יום) לצלחות 48-כן. המבנה השחור הוא קצה פיפטה. C, מראה של JK1 תאים מזינים מומתים. , מושבות גדולות D לפני subculturing שגרה. חיצים מעידים מושבות SSC. סרגל קנה מידה בהוא 100 מיקרומטר (הבלעה, 50 מיקרומטר) ובBD הוא 200 מיקרומטר.

Discussion

שיטה זו להפקת SSCs המבוגר באמצעות תאים מזינים המופקים מאשך למבוגרים היא חזקה והצליחה כאשר רקע גנטי משותף (למשל FVB, C57Bl6 ו129SV/C57Bl/6 המעורב) וזנים מוטנטים שונים הועסקו ^2,3,7,14. למעשה, microenvironment נוצר על ידי מערכת התרבות הוא מספיק כדי להתגבר על כמה מהמחסומים הגנטיים לשמירת SSCs המבוגר in vivo (למשל, במקרה של plzf ^{- / -} חיות) ^7. בעוד אנו מעסיקים JK1 תאים כניזונים, תאים שאינם הופכים למבוגרים בלבד, אשכים גופניים יכולים לשמש גם עם יעילות שווה כJK1 תאי ^2,3.

SESC נועד להשיג יעילות קווי SSC מבוגרים לטווח ארוך. לרוע מזל, היעילות הגבוהה מושגת עם תחלופה מהסיבה הבאה. מגבלה בולטת של ההליך היא שהמחדל של שלב סינון או מתאמץ בזמן הציפוי ראשוני והמניפולציה שprocedurדואר כרוך, אשר יכול להשפיע על הישרדות תא, עלול לגרום לשונות משמעותיות במספר תאים המצופים מבאר לבאר, שפשוט מונעות quantitation היעיל בשלב של יצירת מושבות הראשונה. עם זאת, מבחנים הכמותיים ניתן לבצע עם תרבויות מעבר מאוחרות יותר במקצת שבזמן השעית תא בודדה ניתן להכין בקלות על ידי trypsinization הסטנדרטי (> מעבר 5-7).

בגלל SSCs המבוגר בתרבות ניתן להרחיב ומתוחזק כמעט לנצח, פרוטוקול זה מאפשר ייצור היעיל של שורות תאים, שניתן להשתמש לאחר מכן באופן דומה לתרבויות אחרות שהוקמו עיקריות או קווים סלולריים (כלומר ניתוח ביטוי גנים וחלבונים או ביטוי חוץ רחמים של גן של עניין). עם זאת, סופו של דבר זה חיוני כדי לאשר את התוצאות באמצעות ניתוח השתלה כתקן זהב או בדיקה אחרת תוקפת פונדקאית, כגון assay היווצרות אשכול SSC ^12,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	-
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercapt–thanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
Table 3. Stem cell medium
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.