Summary
派生して、成体マウスの精子幹細胞や前駆細胞株を維持するために簡単な方法は、ここに提示されます。この方法は、成体マウスの精巣の体細胞コンパートメント由来するフィーダー細胞を利用しています。この技術は、トランスジェニック、ノックアウトを含む一般的なマウス系統に適用可能であり、ノックインマウス。
Abstract
精巣の精原幹細胞や前駆細胞（SSCS）は哺乳類成体幹細胞の典型的な例を表しており、動物のほぼ生涯のための妊孕性を温存。 生体内で自己複製と分化を支配する正確なメカニズムは研究に挑戦しているが、様々なシステムが特殊な培地と1-3フィーダー細胞の組み合わせを用いてin vitro でマウスのSSCを伝播するために以前に開発されてきた。
SSCの生物学へのin vitroでの進出で大部分が成人の細胞株4を得ることが困難であるため、おそらく新生児から細胞株を導出した。しかし、精巣は最もマウス系統で年齢の〜5週間まで成長し続けている。早期産後の期間では、劇的な変化は精巣のアーキテクチャでは、数多くの幹細胞関連の発現レベルの変化を含む体細胞および精子形成細胞の両方の生物学、発生する遺伝子。したがって、新生児由来のSSC線が完全に成体精巣が定常状態に達した後も持続成人SSCの生物を再現しない場合があります。
いくつかの要因は、歴史的に成人のSSCラインの生産を妨げてきた。まず、機能的な幹細胞の割合は、内因性又は外因性の要因5,6のために、どちらかの、成人期に低下することがあります。さらに、他の成体幹細胞と同様に、それは免疫選択または他のソート戦略7の組み合わせを使用することなく、合計成人精巣細胞から十分にSSCを豊かにすることは困難であった。一般的に用いられる戦略は、他の細胞型8〜幹細胞の比率が高いのため、ドナー細胞の供給源としての停留マウスの使用が含まれる。初期培養から体細胞の除去はSSCの生存のために不可欠である幹細胞ニッチとの相互作用を破壊するという仮説に基づいて、我々は以前に成人リットルを導出する方法を開発免疫選択または停留ドナーを必要とするのではなく、文化の中でのSSCのシリアル濃縮を採用していないアイネスは、証券取引等監視委員会2,3と称する。
以下に説明する方法は、精巣間質細胞株（JK1）3から成るフィーダ上の細胞のメッキに続いて成人ドナー精細管を、解離することによって大人のSSC線を導出するための簡単な手順を必要とする。シリアル継代を通じて、強固に癒着して、汚染非生殖細胞はSSCの併用で濃縮培養から枯渇している。このように製造された文化は、長期的な自己再生能力に基づいてSSCを、含まれている、分化の様々なステージで精原細胞の混合物を含んでいる。証券取引等監視委員会法の核心は、それが根本的に異なる微小環境におけるin vitroで長期自己複製に生体内で自己複製から困難な移行を行うためにSSCを可能にすることで、汚染の自由な、長期的なSSCの行が生成されます体細胞と、それによってSSCのその後の実験的操作を可能にします。
Protocol
1。フィーダー細胞の調製
以下に記述されているすべての試薬 は（ 表1＆2を参照）滅菌方法で準備されるべきであることに注意してください。このプロトコルは、成体マウス精巣の体細胞の形質転換された誘導体であり、他の場所で3記載されているフィーダーとしてJK1細胞株（セルバイオラボズ社、カタログ＃CBA-315）を採用しています。すべての動物の手続きは制度的ガイドラインと規則に従って行われるべきであることにも注意してください。
- JK1細胞は、培養中に維持し、最大通路39までの電路として正常に使用することができます。フィルター滅菌したフィーダー細胞増殖培地（DMEM、10％ウシ胎児血清[FBS]、2mMのL-グルタミンおよび抗生物質を添加した）の10ミリリットル、100mmの細胞培養ディッシュ（BDファルコン、カタログ＃353003）で培養JK1細胞。文化が95％コンフルエントに達すると、細胞を1時06 -1:10比を分割します。
- コンフルエントJK1フィーダー細胞モノから培地を除去層。
- カルシウムとマグネシウムを含まないPBSで一度細胞層を洗浄してください。
- あらかじめ温めておいたトリプシン/ EDTA、1×（0.05％trypsin/0.53 mMのEDTA、コーニングCellgro、カタログ＃25-051-CI）を追加し、37℃で5〜10分間インキュベートする。
- フィーダー増殖培地と等量のトリプシンを不活性化する。細胞を回収し、5分間300×gで遠心分離します。フィーダー増殖培地中で細胞を再懸濁する。
- うまくカバーし、室温で5分後に削除するために十分な0.4パーセントゼラチン溶液を添加することにより、プレコートは、マルチウェル細胞培養プレート。
- プレート〜ゼラチンコート細胞培養プレートで1mm 2当たり250細胞（ 例えば、48ウェルまたは6ウェルフォーマット）。 16から24時間37℃で培養をインキュベートする。
- 井戸から培地を取り除きます。注意：細胞増殖を不活性化するDMEM中で希釈された10μg/ mlのマイトマイシン-Cの新鮮な溶液を追加するには、各ウェル（ 例えば 200μl/ウェル、48ウェルプレート用）。マイトマイシン-Cは有毒である。ハンドルと注意して処分してください。でインキュベート37℃で4時間。
- 細胞からマイトマイシンC溶液を除去します。メッキ幹細胞の前にDMEMで3回洗浄する。
- 継代中にフィーダーの乾燥を防ぐために、フィーダー細胞の井戸からDMEMを外し、十分な幹細胞培地を追加します（ 表3を参照48ウェルプレートの100μl/ウェル）。フィーダを含むウェルの指示されたサイズを使用して、セクション3.1または3.4で後述するように、同じ日にSSCを追加します。
2。マウス精巣組織の解離は、ドナー生殖細胞を得るために
- 収穫成体マウス滅菌方法では、精巣および一時的に覆われたペトリ皿（どのような液体なしで追加された）で睾丸を格納します。皿はdessicationを防ぎ、細胞の生存を維持するために氷の上に置かなければなりません。
- ¾距離THR -滅菌微鉗子や細胞培養フードの微細はさみを使って、完全に精巣（ つまり 、カット〜½のtransectingずに白膜における横切開を加えるウワーッ）とプレートの隅に精細管を絞り出すためにピンセットを使用し、廃棄ニカと添付組織。それによって、その整合性を維持し、蒸発を防ぎ、組織を維持するために冷やした氷の上でプレート全体に保管してください。
- 氷の上に板を維持しながら、迅速に睾丸あたり少なくとも3分間は、晴れた春のはさみで細管をミンチ。
- 50 mlコニカルチューブ内の尿細管の断片を収集し、アルブミン冷PBS / 1％ウシ血清の約40ミリリットルで洗う。
- 精子や破片から細管断片を分離するために10分間60×gで遠心分離します。上清を捨てる。
- 15 mlコニカルチューブでは、あらかじめ温めておいた解離緩衝液（DMEM、0.05％トリプシン、0.03％コラゲナーゼI型、DNアーゼIの80 U / mlとウシ血清アルブミン、0.5％の精巣あたり3 mlにペレットを再懸濁し、 表を参照してください。解離緩衝液のより具体的な詳細については、2）。
- 最大化するために15分間37℃で150 rpmのシェーカーセット内のラックに水平コニカルチューブを置きますgitation。
- 解離していないチャンクから単一細胞を分離するために10分間60 xgでスピンダウンします。
- 次のステップまでペレットを含むチャンクを保存します。ステップ2.8から上清を回収し、解離緩衝剤を中和するために3ミリリットルDMEM/10％ウシ胎児血清を追加します。一時的にチューブを氷上に置きます。
- ステップ2.8の後に残っ再度ダイジェストチャンクへのステップ2.9から保存されたペレットと2.6から2.7の手順を繰り返します。
- 解離緩衝剤を中和するDMEM/10％FBSの等量を追加します。
- ステップ2.9から保存した細胞懸濁液を持つステップ2.11から再結合するサスペンション。 300×gで5分間遠心します。
- 精巣のペアあたり16ミリリットルの容積の幹細胞培地中でペレットを再懸濁します（ 表3を参照）。
3。精巣細胞懸濁液のめっき
- 37＆で細胞培養インキュベーター中でマイトマイシン-Cおよび場所で有糸分裂で不活化フィーダー細胞を含む6ウェルプレートのウェルあたりの細胞懸濁液をプレート2ミリリットル度、C、5％CO 2中。
- 48時間、吸引培地後、2 mlの新鮮な培地を追加して、インキュベーターに戻ります。
- 48時間後、各ウェルに0.5 mlの新鮮な幹細胞培地を追加して、インキュベーターに戻ります。
- 48時間後、続いて細胞を週3回、その後、大、控えめなコロニーは（> 50セル）（7〜21日以内）に表示されるまで、次のように食べます。毎週供給第一及び第二の場合（ 例えば 、月曜日と水曜日）培地の約50％を除去し、新鮮な培地の体積でバック50％を追加します。第3の供給（ 例えば金曜日）には、すべての培地を吸引し、2 mlの新鮮な培地と交換してください。このアプローチは、完全培地の変更の回避は培地9に分泌されるパラクリン信号の濃度の変動を最小限に抑えることの理論的根拠に基づいています。
4。初通過のためのコロニーピッキング
- 継代するコロニーを含むウェルから培地を除去し、新鮮な幹細胞培地を加える。
- 10倍の対物レンズを用いてコロニーを同定する。少し脱焦点顕微鏡を用いて、ウェルのエッジでのSSCコロニーが細胞ので、それは個々のセルの枠線を識別することが困難または不可能である多くの11から12μmの直径の細胞から成る均質明るい塊、、として表示されます（ 図1A）一緒に融合現れる。非SSCのコロニーが識別可能な境界線（ 図1A、はめ込み）で、暗く、よりきめ細かな、多かれ少なかれ均質な表示されることがあります。
- 50μlにpipettemanセットで、200μlのピペットチップを用いて、第1ウェルから培地を取り、先端を濡らし追い出す。その後、静かに急速に先端（ 図1B）に吸引によってコロニーを取り除くために、50μlの培地を引き抜く前に、先端でコロニーをナッジ。
- 幹細胞培地（ 図1C）100μlで不活化したフィーダー細胞を含む48ウェルプレートのウェル1にコロニーを含む培地を追放。
- ステップを繰り返し4.3およびウェルあたり500μLを超えることなく、同一のウェルに8コロニーまで追加。
- 通路1 SSCのコロニーを48ウェルプレートの追加のウェルを準備するために4.3から4.5の手順を繰り返します。
- ウェルズは（1D図 ）7〜14日で、または500細胞までの大きな塊が出てきた後に分割できるようになります。
5。粉砕によってSSCのその後の展開と継
- 1時06分（7日ごと）に、最初の3継代のための1:2の分割比の14日への通路1でセルアップ後に新鮮な餌箱の上に継代されるべきであり、1:4その後、以下のとおりです。優しくセルにわたって洗浄媒体によって1ミリリットルピペットチップで半コンフルエント裕福コロニー（ 例えば 〜300,000のSSC / 6ウェルプレートの）粉薬。コロニーは取り外し見ることができます。液体の流れとあまりにも力が不要なフィーダー細胞があまりにも外れてしまいます。
- 、300×gでコニカルチューブと遠心分離機中で磨砕し、細胞を回収5分。注：調査員が希望する場合、トリプシン処理ステップが無事にここに追加することができます。
- 上清を吸引除去し、徹底的にコロニーを破壊するために上下にピペッティングして新鮮な幹細胞培地中に再懸濁する。
- マイトマイシンCで不活性化し、新たに調製したフィーダー細胞上にプレートSSCは、セクション1で説明した。
- 次のように細胞を1週間に3回を養う。第一及び第二の授乳のために（ 例えば 、月曜日と水曜日）新鮮な培地の体積で50％を追加します。第3の供給（ 例えば金曜日）には、すべての培地を吸引し、2 mlの新鮮な培地と交換してください。プレートは7-10日にコンフルエントになるでしょう。培養は、体細胞10から生殖細胞を区別するために（ 例えば、マウス生殖細胞マーカーGCNAを使用）免疫染色に基づいて5から7までの継代後> 98％の生殖細胞（ すなわち 、<1％混入した体細胞）から構成されるべきである。注：これらのメソッドは、機関によって定められた規制や要件に準拠して開発されたワイルコーネル医科大学のアル動物のケアと使用委員会。
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Representative Results
7日後に通過ゼロ野生型、成人SSCコロニーの外観を図1に示します。三次元のコロニーが上に成長しているSSCの複数のレイヤーを持つフィーダーにより堆積フィーダまたは下っ端細胞外マトリックスに接続されている平らな細胞の層で構成されています。健康SSCは明るく屈折性と均一に11から12μmの直径ですが、セルの枠線を区別するのは困難であり、コロニーの大きさがウェル内に、別のマウスから調製したウェル間の両方、非常に可変であってもよい。コロニーの可視化は、デジタルディスプレイと早期成立（0-2）文化に存在しているとやる高度に均質なSSCのコロニーと汚染の体細胞との間のコントラストを向上させ、わずかに脱合焦点面との位相差顕微鏡によって支援される（ 図1（a）はイラストを参照）すし詰め状態のコロニーを形成しない。フィーダー細胞の形態が徐々にAFを変更することに注意してください体細胞の残留塊がでSSCの生存率を高めると考えられているため、TERスイッチングマイトマイシンC.Itで不活化後の細胞培養培地を食い止めるためにDMEM/10％からは、初期の細胞懸濁液を濾過したり緊張されていないことに注意することも重要ですSSCのコロニーが確立されるまで、初期のメッキとの時間は、除去されるべきではない。 （> 5-7回）継シリアルはほぼ均一（> 98％）に生殖細胞を浄化し、残留した体細胞を枯渇させるために必要とされる。その後の実験では、具体的に文化の中で生殖細胞の総人口から幹細胞を濃縮することが必要となる場合には、免疫磁気ビーズまたはフローサイトメトリーを用いた細胞の選択は、さらに精製するために用いることができ、例えば、幹細胞濃縮はTHY1に対する抗体を用いて得ることができる、CD9、α6インテグリンなど11。 SSCのアイデンティティはその後transplantatので、免疫表現型、遺伝子発現、及び移植によるを使って確認すべきであるイオン分析は決定的12,13本物の、機能的な幹細胞の量を評価するための唯一の手段です。
図1。初期のSSCのコロニー、精巣間質細胞およびフィーダーの形態。、〜5日初期めっき後の新生SSCのコロニーの外観。パッセージゼロ文化に単球様体細胞を汚染挿入図B、48ウェルプレートへの最初の通路のための個々のコロニーの選択とピッキング（〜14日）。黒い構造がピペットチップです。C、不活化JK1フィーダー細胞の外観。 D、ルーチン継代する前に大きなコロニー。矢印はSSCのコロニーを示す。中のスケールバーは100μm（差込み、50μm）であるとBDで200μmである。
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Discussion
成体精巣由来のフィーダー細胞を用いた成人のSSCを導出するためのこの方法は、堅牢であり、共通の遺伝的背景（ 例えば FVB、C57BL6および混合129SV/C57Bl/6）と、さまざまな変異株は2,3,7,14を用いた場合に成功しました。 7実際には、培養系で作成された微小環境は、 生体内での成人のSSCを（ - / -動物PLZFの場合など ）を維持することへの遺伝的障壁のいくつかを克服するのに十分である。我々は餌としてJK1細胞を使用しながら、非形質転換成人精巣の体細胞はまた、JK1細胞2,3と同等の効果を使用することができます。
証券取引等監視委員会は、効率的、長期的な大人のSSCの行を取得するために設計されました。残念なことに、高効率は、以下の理由のためにトレードオフで達成される。手続きの顕著な制限は、初期のメッキ時のフィルタリングやいきみ工程を省略し、その操作procedureは細胞の生存に影響を与えることができる、関与、初期のコロニー形成の段階で効果的な定量性を排除するだけでなく、井戸から播種した細胞数の大幅な変動を引き起こす可能性があります。しかし、定量的なアッセイは、単一細胞懸濁液は簡単に標準トリプシン処理（>通路5-7）することにより調製することができる、その時点で少し遅れて通路文化で実行することができます。
文化の中で成人のSSCが拡大し、ほぼ無期限に維持することができるので、このプロトコルは、他の確立された初代培養や細胞株（ すなわち遺伝子とタンパク質発現解析やの異所性発現と同様の方法で続いて使用することができる細胞株の効率的な生産を可能にする目的の遺伝子）。それにもかかわらず、それは究極的には金本位制や、SSCのクラスター形成アッセイ12,15などの別の検証代理アッセイとして移植分析を使用して結果を確認するために不可欠です。
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Disclosures
MSはJK1細胞を分配するには、Cell Biolabs社、株式会社にライセンスを通じてワイルコーネル医科大学からロイヤルティーを受け取る。
Acknowledgments
この作品は、ニューヨーク州保健局（C026878）によってサポートされていました。 MSはニューヨーク幹細胞財団Druckenmillerフェローだった。ダイム財団の月からの研究助成金番号5-FY11-571によって部分的にサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
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