Summary
Простой метод для получения и поддержания сперматогониальные ствола и линии клеток-предшественников из взрослых мышей представлена здесь. Метод использует фидерных клеток, происходящих из отсека соматической клетки взрослой семенников мышей. Этот метод применим к общим линий мышей, в том числе трансгенных, нокаут, и забивные мышей.
Protocol
1. Подготовка фидерных клеток
Отметим, что все реагенты, описанные ниже, должны быть подготовлены в стерильной одежды (см. таблицы 1 и 2). Этот протокол использует JK1 клеточной линии (Cell Biolabs, Inc каталог # CBA-315) в качестве питателей, которая является производной превращается взрослой мыши яичка соматических клеток и была описана в другом месте 3. Отметим также, что все животные процедуры должны выполняться в соответствии с руководящими принципами институциональных и нормативных актов.
- JK1 клетки могут поддерживаться в культуре и успешно используются в качестве питателей до прохождения 39. Культура JK1 клеток в клетки 100 мм культуры блюдо (BD Falcon, каталог # 353003) с 10 мл фильтр стерилизовать среднего роста подачи (DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки [FBS], 2 мМ L-глутамин и антибиотики). Когда культура достигает 95% слияние, разделение клеток 1:06 -1:10 отношение.
- Удалить среды от сливной JK1 моно ячейки подачислоя.
- Вымойте клеточный слой один раз PBS без кальция и магния.
- Добавить подогретого трипсин / ЭДТА, 1x (0,05% trypsin/0.53 мМ EDTA; Corning Cellgro, каталог № 25-051-CI), и инкубировать при 37 ° С в течение 5-10 мин.
- Деактивировать трипсина с равным объемом подачи среднего роста. Сбор клеток и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в питатель среднего роста.
- Предварительное покрытие мульти-и клеточной культуры пластин, добавив достаточное 0,4% раствора желатина, чтобы покрыть также и удалить через 5 мин при комнатной температуре.
- Плита ~ 250 клеток на мм 2 в желатин покрытием пластин культуры клеток (например, 48-а и 6-а формат). Инкубируют культуры при 37 ° C в течение 16 до 24 часов.
- Удалить культуральной среды из скважин. ВНИМАНИЕ: Для инактивации рост клеток, добавить свежий раствор митомицином-C в концентрации 10 мкг / мл разбавляют в DMEM в каждую лунку (например, 200 мкл / лунку для 48-луночный планшет). Митомицин-C является токсичным. Аккуратное использование и утилизация его с осторожностью. Инкубировать при37 ° C в течение 4 часов.
- Удалить митомицином-C раствор из клетки. Промыть 3 раза с DMEM до клеток покрытие ствола.
- Удалить DMEM от фидерных клеток скважин и добавить достаточно стволовых клеток средней (100 мкл / лунку в 48-луночный планшет, см. таблицу 3), чтобы предотвратить высыхание фидеров во время пассажей. Добавить КСЭ в тот же день, как описано ниже в разделах 3.1 или 3.4, используя указанный размер лунки, содержащие фидеров.
2. Диссоциация ткани яичка мыши, чтобы получить донорских половых клеток
- Урожай семенников взрослых мышей в стерильных моды и временного хранения семенников в закрытом чашке Петри (без жидкости добавлен). Блюдо должно располагаться непосредственно на льду для предотвращения высыхания и поддержания жизнеспособности клеток.
- Использование стерильного пинцета штраф и штраф ножницами в капот культуре клеток, сделать поперечный надрез на белочной оболочки, не полностью, пересекающих яичка (например, сокращение ~ ½ - ¾ расстояние Четух) и используйте щипцы, чтобы выжать из семенных канальцев в угол пластины, оболочки выбросить и придает ткани. Храните пластины на льду в течение держать ткань охлажденная, тем самым сохраняя его целостность и предотвращения испарения.
- Быстро пропустить через мясорубку с мелкой канальцев ножницы весны по крайней мере 3 мин в яичках, сохраняя при этом пластину на льду.
- Сбор трубочку фрагментов в 50 мл коническую трубку и мыть в ~ 40 мл охлажденной PBS / 1% бычьего сывороточного альбумина.
- Центрифуга на 60 мкг в течение 10 мин, чтобы отделить трубочку фрагменты из сперматозоидов и мусора. Удалите супернатант.
- В 15 мл коническую трубку, ресуспендируют осадок в 3 мл на яичко предварительно нагретого диссоциации буфером (DMEM, 0,05% трипсина, 0,03% коллагеназы типа I, 80 U / мл ДНКазы I и 0,5% бычьего сывороточного альбумина, см. таблицу 2 для более конкретных деталей диссоциации буфера).
- Установите коническую трубку горизонтально в стойку в шейкере до 150 мин при 37 ° С в течение 15 мин, чтобы максимизироватьgitation.
- Спином вниз на уровне 60 мкг в течение 10 мин для разделения одной клетки от недиссоциированной куски.
- Сохранить осадок, содержащий куски до следующего шага. Сбор супернатант с шага 2,8 и добавляют 3 мл DMEM/10% эмбриональной телячьей сыворотки, чтобы нейтрализовать диссоциации буфера. Поместите пробирку на льду временно.
- Повторите шаг от 2,6 до 2,7 с сохраненными гранул, начиная с шага 2,9 до повторного дайджест куски оставшиеся после шага 2.8.
- Добавить равный объем DMEM/10% FBS, чтобы нейтрализовать диссоциации буфера.
- Рекомбинируют отстранение от шага 2,11 с сохраненной клеточной суспензии с шагом 2,9. Центрифуга течение 5 мин при 300 х г.
- Ресуспендируют гранул в области стволовых клеток среды в объеме 16 мл на пару яичек (см. таблицу 3).
3. Покрытие из яичек клеточной суспензии
- Plate 2 мл клеточной суспензии на лунку в 6-луночный планшет, содержащий клетки подачи митотически инактивированные митомицином-C и место в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 &град, С в 5% СО 2.
- После 48 часов, аспират среды, добавляют 2 мл свежей среды и вернуться в инкубаторе.
- После 48 часов, добавляют 0,5 мл свежей среды стволовых клеток в каждую лунку и вернуться в инкубаторе.
- После 48 часов, затем кормить клетки три раза в неделю после этого, как следует, пока большая, сдержанный колоний (> 50 клеток) появляются (в пределах от 7 до 21 дней). Для первой и второй кормления каждую неделю (например, понедельник и среда) удалить ~ 50% от среднего и добавить туда 50% по объему свежей среды. Для Третью подкормку (например, пятницу), аспирации всех средних и заменить 2 мл свежей среды. Этот подход основан на обоснование, что отказ от полного среднего изменения минимизирует колебания в концентрации паракринной сигналов, которые выделяются в культуральной среде 9.
4. Колония для комплектования первого прохода
- Удалить среды от лунки, содержащие колонии для пассировать и добавить свежую среду стволовых клеток.
- Определить колонии использовании 10x цели. С микроскопом немного де-ориентированной, SSC колонии на краю также будет выглядеть как однородная яркие сгустки, состоящие из многих 11-12 мкм в диаметре клетки, в которых трудно или невозможно различить отдельные границы ячейки, так как клетки появляются сливаются (рис. 1А). Non-SSC колонии могут появиться темные, более детальный, или менее однородным, с заметной границы (рис. 1А, вставка).
- С помощью 200 мкл кончика пипетки, с pipetteman набор до 50 мкл, в первую занимают средние из колодца и высылать к влажному чаевых. Затем, мягко подтолкнуть колонии с кончика до быстрого снятия 50 мкл среднего выбить колонии путем всасывания в наконечник (рис. 1б).
- Выгнать среду, содержащую колонии в одну лунку 48-луночных планшет, содержащий инактивированные клетки питатель с 100 мкл стволовых клеток среде (рис. 1С).
- Повторите шаг4,3 и добавить до 8 колоний к тому же и без превышающей 500 мкл на лунку.
- Повторите шаги с 4,3 до 4,5 для получения дополнительных скважин из 48-луночный планшет с прохождением один колонии SSC.
- Wells будут готовы разделить на 7-14 дней или после большого скопления до 500 клеток появились (рис. 1D).
5. Последующее расширение и Пассирование КСЭ растиранием
- Клетки при прохождении нужно быть субкультивируют на свежие фидеров после до 14 дней при расколе соотношении 1:2 в течение первых 3 проходов, а затем 1:4 до 1:6 (каждые 7 дней) после этого следующим образом. Аккуратно растереть колонии с полу-сливной ямы (например, ~ 300,000 КСЭ / лунку 6-луночный планшет) с 1 мл пипетки промывкой средних по ячейкам. Колонии можно увидеть отсоединения. Слишком много сил с потоком жидкости может вызвать нежелательные клетки подачи оторваться тоже.
- Сбор растертых клеток в конической трубе и центрифуги при 300 х г в течение5 мин. Примечание: трипсинизации шаг может быть безопасно добавить, по желанию исследователя.
- Супернатант и вновь приостановить в свежую среду стволовых клеток тщательным пипетки вверх и вниз, чтобы сорвать колонии.
- Плита КСЭ на свежеприготовленных фидерных клеток инактивированные митомицином-C, как описано в разделе 1.
- Поток клетки три раза в неделю следующим образом. За первое и второе кормление (например, понедельник и среда) добавить 50% по объему свежей среды. Для Третью подкормку (например, пятницу), аспирации всех средних и заменить 2 мл свежей среды. Плиты станет вырожденной в 7-10 дней. Культура должна состоять из> 98% половых клеток (например, <1% загрязняющих соматических клеток) после 5-7 проходов, на основе иммунной (например, с помощью мышиной зародышевой клетки маркером GCNA), чтобы отличить половых клеток от соматических клеток 10. Примечание: Эти методы были разработаны в соответствии с правилами и требованиями, установленными учреждениеАль уходу и использованию животных комитета на Weill Cornell Medical College.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Появление прохождения нуля дикого типа, взрослый SSC колонии через 7 дней показано на рисунке 1. Трехмерная колонии состоят из слоя плоских клеток, прикрепленных к фидеров или подчиненного внеклеточного матрикса, сданный на хранение фидеров с несколькими слоями КСЭ, растущий на вершине. В то время как здоровые КСЭ ярко и равномерно рефрактильных 11-12 мкм в диаметре, границы ячеек трудно отличить и размер колоний может быть весьма переменная, как внутри, так и между скважинами получают из различных мышей. Визуализация колоний способствовали фазового микроскопа с цифровым дисплеем и немного де-ориентированных фокальной плоскости, что усиливает контраст между высокой однородности колонии SSC и загрязняющих соматические клетки, которые присутствуют в начале проход (0-2) культур и делают не образуют плотно упакованные колоний (см. Рисунок 1а вставка). Обратите внимание, что морфология фидерных клеток будет постепенно меняться AFтер перехода от DMEM/10%, чтобы остановить среду клеточной культуры после инактивации митомицином-C.It Также важно отметить, что начальная клеточной суспензии не фильтруется или напряженными, потому что остаточные скопления соматических клеток, как полагают, для повышения выживаемости в КСЭ время первоначального покрытия и не должны быть удалены, пока SSC колониях установлены. Серийные пассажи (> 5-7 раз) требует, чтобы очистить половых клеток почти до однородности (> 98%) и истощать остаточной соматических клеток. Если дальнейшие эксперименты будут конкретно требуют обогащения стволовых клеток из общей численности населения зародышевых клеток в культуре, то клетка выделение с помощью иммуномагнитной бисером или проточной цитометрии могут быть использованы для дальнейшей очистки, например, стволовые клетки обогащения может быть получена с использованием антител против Thy1 , CD9, α6 интегрина и др. 11. Личность КСЭ должны быть впоследствии подтверждена с помощью иммунофенотипирование, экспрессия генов, а путем трансплантации, так как трансплантатионный анализ является единственным средством, чтобы окончательно оценить количество подлинных, функциональных стволовых клеток 12,13.
Рисунок 1. Морфология колонии рано SSC, яичка стромальные клетки и кормушки., Внешний вид зарождающихся колоний SSC ~ 5 дней после первого покрытия. На врезке показано загрязняющих моноцитов, как соматических клеток в культуре нуля проход. B, выбор и сбор отдельных колоний для первого прохода (~ 14 дней) в 48-луночных планшетах. Черная структура пипетки. C, внешний вид инактивированных клеток JK1 подачи. D, Большие колонии до рутинной пересева. Стрелки указывают SSC колонии. Шкала бар составляет 100 мкм (вставка, 50 мкм) и BD составляет 200 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот способ для получения взрослого КСЭ использовании семенников взрослых клеток, полученных из питателя является надежной и удалось, когда общий генетический фон (например, FVB, C57BL6 и смешанных 129SV/C57Bl/6) и различные мутантные штаммы были заняты 2,3,7,14. В самом деле, микросреда создан системе культуры достаточно, чтобы преодолеть некоторые генетические барьеры для поддержания взрослого КСЭ в естественных условиях (например, в случае PLZF - / - животных) 7. В то время как мы используем JK1 клетки, кормушки, нетрансформированных взрослых яичка соматических клеток также может быть использована с одинаковой эффективностью как JK1 клеток 2,3.
СУНЦ был разработан, чтобы эффективно получать долгосрочные взрослых SSC линий. К сожалению, высокая эффективность достигается компромисс по следующей причине. Заметное ограничение процедуры является то, что бездействие фильтрации или напряжение шаг на момент первоначального покрытия и манипуляции, что procedurэлектронной предполагает, что может повлиять на выживаемость клеток, может привести к существенной изменчивости количества клеток покрытием от скважины к скважине, что исключает возможность эффективной количественной на стадии начального формирования колонии. Тем не менее, количественный анализы могут быть выполнены с чуть позже прохождения культур в это время суспензии отдельных клеток могут быть легко получены стандартными трипсинизации (> проход 5-7).
Потому что взрослые КСЭ в культуре может быть расширен и поддерживается почти бесконечно, этот протокол обеспечивает эффективное производство клеточных линий, которые могут быть использованы в дальнейшем таким же образом в других установленных первичных культур или клеточных линий (т. е. генов и экспрессии белка анализы или эктопическая экспрессия интересующего гена). Тем не менее, важно, чтобы в конечном итоге подтвердить результаты с помощью трансплантации анализа в качестве золотого стандарта или другого подтверждено суррогатной анализа, таких как формирование кластера SSC анализа 12,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MS получает отчисления из колледжа Weill Cornell Medical через лицензию на сотовый Biolabs, Inc распространять JK1 клеток.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана штата Нью-Йорк Департамент здравоохранения (C026878). MS был в Нью-Йорке Stem Cell Foundation-Дракенмиллер Fellow. При частичной поддержке исследовательского гранта № 5-FY11-571 с марта Dimes Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).
- Seandel, M., et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 449, 346-350 (2007).
- Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells. Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).
- Ogawa, T., et al. Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines. Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).
- Schmidt, J. A., et al. In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function. Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).
- Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. Aging of male germ line stem cells in mice. Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).
- Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1. Cell. 142, 468-479 (2010).
- Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).
- Csaszar, E., et al. Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling. Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).
- Enders, G. C., May, J. J. Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female. 163, 331-340 (1994).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).
- Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).
- Arnold, K., et al. Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice. Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).
- Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).
