Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Seriell Anrikning av spermatogoniala stam-och stamfaderceller (SSC) i Kultur för Härledning av långfristiga SSC vuxen mus Lines

Published: February 25, 2013 doi: 10.3791/50017

Summary

En enkel metod för att härleda och bibehålla spermatogoniala stam och progenitor cellinjer från vuxna möss presenteras här. Metoden utnyttjar matarceller ursprung från den somatiska cellavdelningen av vuxen mus testiklar. Denna teknik kan tillämpas på vanliga musstammar, inklusive transgena, knock-out, och knock-i möss.

Abstract

Spermatogoniala stam-och stamfaderceller (SSC) av testiklarna representerar ett klassiskt exempel av vuxna däggdjur stamceller och bevara fertiliteten för nästan livstid djuret. Medan de exakta mekanismerna som styr självförnyelse och differentiering in vivo utmanande att studien har olika system utvecklats tidigare för att sprida murina SSC in vitro med hjälp av en kombination av specialiserade odlingsmedier och celler feeder 1-3.

De flesta in vitro plundringståg in biologi SSC har härledda cellinjer från nyfödda, eventuellt på grund av svårigheten att erhålla vuxna cellinjer 4. Emellertid fortsätter testiklarna att mogna fram ~ 5 veckors ålder i de flesta musstammar. I början postnatala perioden, dramatiska förändringar i arkitekturen av testiklar och biologi både somatiska och spermatogenescykler celler, inklusive förändringar i uttrycksnivåer av många stamceller-relateradegener. Därför kan neonatally-härledda SSC linjer inte helt rekapitulera biologi vuxna SSC som kvarstår efter den vuxna testikeln har nått ett stabilt tillstånd.

Flera faktorer har hindrat produktionen av vuxna SSC linjer historiskt. Först, kan andelen av funktionella stamceller minskar under vuxenlivet, antingen på grund av inre eller yttre faktorer 5,6. Dessutom, som med andra vuxna stamceller, har det varit svårt att berika SSC tillräckligt från totala vuxna testikelceller utan att använda en kombination av immunoselektion eller andra strategier sortering 7. Vanligen använda strategier innefattar användning av kryptorchida möss som en källa för donatorceller på grund av en högre förhållande av stamceller till andra celltyper 8. Baserat på hypotesen att borttagande av somatiska celler från den ursprungliga kulturen stör interaktion med stamceller nisch som är väsentliga för SSC överlevnad, utvecklade vi tidigare metoder för att härleda Vuxen Lines som inte kräver immunoselektion eller kryptorchida givare utan använder seriell anrikning av SSC: er i kultur, nedan kallade SESC 2,3.

Metoden som beskrivs nedan innebär ett enkelt förfarande för att härleda vuxna SSC linjer genom dissociering vuxen donator sädeskanalerna, följt av utstrykning av celler på matare består av en testikel stromal cellinje (JK1) 3. Genom seriepassage, starkt vidhäftande, kontaminerande icke-könsceller töms från kulturen med samtidig anrikning av SSC: er. Kulturer som produceras på detta sätt innehåller en blandning av spermatogonier i olika stadier av differentiering, som innehåller SSC, baserat på långsiktiga självförnyelse förmåga. Den springande punkten i SESC metoden är att den möjliggör SSC att göra den svåra övergången från självförnyelse in vivo till långsiktig självförnyelse in vitro i ett radikalt annorlunda mikromiljö, producerar långa SSC linjer, fri från förorenandesomatiska celler, och därigenom möjliggör efterföljande experimentell manipulation av SSC: er.

Protocol

1. Framställning av matarceller

Observera att alla reagenser som beskrivs nedan bör förberedas i sterilt sätt (se tabell 1 och 2). Detta protokoll använder JK1 cellinjen (cell Biolabs, Inc., katalog # CBA-315) som matare som är en transformerad derivat av vuxen mus testikulära somatiska celler och har beskrivits på annat håll 3. Notera också att alla djurförsök bör utföras i enlighet med de institutionella riktlinjer och regler.

  1. JK1 celler kan upprätthållas i kultur och användes framgångsrikt som matare upp till passagen 39. Kultur JK1 celler i en 100 mm cell odlingsskål (BD Falcon, katalognummer # 353.003) med 10 ml filtersteriliserad matare tillväxtmedium (DMEM med 10% fetalt bovint serum [FBS], 2 mM L-glutamin och antibiotika). När kulturen når 95% sammanflöde, dela cellerna 1:06 -1:10 förhållande.
  2. Avlägsna medium från konfluent JK1 feeder-cell-monoskikt.
  3. Tvätta cellskikt gång med PBS utan kalcium och magnesium.
  4. Lägg förvärmd trypsin / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, katalog # 25-051-CI), och inkubera vid 37 ° C under 5-10 min.
  5. Inaktivera trypsin med en lika stor volym av feeder tillväxtmedium. Samla cellerna och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter. Återsuspendera celler i mataren odlingsmedium.
  6. Förbeläggning flera brunnar cell odlingsplattor genom tillsats av tillräckligt 0,4% gelatinlösning för att täcka väl och bort efter 5 min vid rumstemperatur.
  7. Platta ~ 250 celler per mm 2 i gelatinbelagda cellkultur plåt (t.ex. 48-brunnars eller 6-brunnsformat). Inkubera kulturen vid 37 ° C under 16 till 24 timmar.
  8. Ta odlingsmedium från brunnar. VARNING: För att inaktivera celltillväxt, tillsätt en färsk lösning av mitomycin-C vid 10 pg / ml utspädd i DMEM till varje brunn (t.ex. 200 | il / brunn för en 48 brunnsplatta). Mitomycin-C är giftig. Hantera och kassera den med omsorg. Inkubera vid37 ° C under 4 timmar.
  9. Avlägsna mitomycin-C-lösning från celler. Tvätta 3 gånger med DMEM före celler pläteringsprocesser stamceller.
  10. Avlägsna DMEM från matarceller brunnar och tillsätt tillräckligt medelhög stamceller (100 pl / brunn av en 48 brunnars platta, se tabell 3) för att förhindra uttorkning av matarna under passage. Lägg SSC samma dag, som beskrivs nedan i avsnitten 3,1 och 3,4, med angivna storlekar brunnar innehåller matare.

2. Dissociation av mus Testikel Tissue Skaffa celler Donor Germ

  1. Harvest vuxen mus testiklar i steril mode och temporärt lagra testiklarna i en övertäckt petriskål (utan vätska tillsätts). Skålen måste placeras omedelbart på is för att förhindra uttorkning och bibehålla cellviabiliteten.
  2. Användning av sterila fin pincett och en fin sax i en cellkultur huva, göra en tvärgående snitt i tunica albuginea utan helt transecting testiklarna (dvs. snitt ~ ½ - ¾ avstånd thrgrundlig) och använd tång för att pressa ut sädeskanalerna i ett hörn av plattan, kasta tunika och bifogade vävnad. Håll plattan på is hela för att hålla vävnad kyld, och därigenom bibehålla dess integritet och förhindra avdunstning.
  3. Snabbt finhacka tubuli med fina våren sax minst 3 min per testikel, samtidigt platta på is.
  4. Samla tubuli fragmenten i en 50 ml koniskt rör och tvätta i ~ 40 ml kyld PBS / 1% bovint serumalbumin.
  5. Centrifugera vid 60 OOOxg under 10 min för att separera njurtubuliceller fragment från spermier och skräp. Släng supernatanten.
  6. I en 15 ml koniskt rör, återsuspendera pelleten i 3 ml per testikel av förvärmd dissociationsbuffert (DMEM, 0,05% trypsin, 0,03% kollagenas typ I, 80 U / ml DNas I och 0,5% bovint serumalbumin; se tabell 2 för mer specifika detaljer om dissociation buffert).
  7. Placera den koniska röret horisontellt i ett ställ i en skakapparat till 150 rpm vid 37 ° C under 15 min för att maximera engitation.
  8. Centrifugera ner vid 60 OOOxg under 10 min för att separera enstaka celler från odissocierad bitar.
  9. Spara pelleten innehållande bitar till nästa steg. Supernatanten från steg 2,8 och tillsätt 3 ml DMEM/10% fetalt bovint serum för att neutralisera dissociation-buffert. Placera röret på is tillfälligt.
  10. Upprepa steg från 2,6 till 2,7 med den sparade pelleten från steg 2,9 till nytt smälta bitar återstår efter steg 2,8.
  11. Tillsätt en motsvarande volym av DMEM/10% FBS för att neutralisera dissociation-buffert.
  12. Rekombinerar avstängning från steg 2,11 med sparade cellsuspension från steg 2,9. Centrifugera i 5 minuter vid 300 x g..
  13. Återsuspendera pelleten i stamceller medium i en volym av 16 ml per par testiklar (se tabell 3).

3. Plätering av Testikulär cellsuspension

  1. Platta 2 ml cellsuspension per brunn i en 6-brunnars platta innehållande celler feeder mitotiskt-inaktiveras med mitomycin-C och plats i en cellkultur inkubator vid 37 &grader, C i 5% CO 2.
  2. Efter 48 timmar, aspirera mediet, tillsätt 2 ml färskt medium och återgå till inkubatorn.
  3. Efter 48 timmar, tillsätt 0,5 ml färskt medium stamceller till varje brunn och återgå till inkubatorn.
  4. Efter 48 timmar, därefter mata cellerna tre gånger per vecka därefter enligt följande tills stora diskreta kolonier (> 50 celler) visas (inom 7 till 21 dagar). För första och andra utfodring varje vecka (t.ex. måndag och onsdag) ta bort ~ 50% av mediet och lägga tillbaka 50% av volymen färskt medium. För tredje matning (t.ex. fredag), aspirera alla medel och ersätta med 2 ml färskt medium. Detta tillvägagångssätt bygger på logik att undvika komplett medium förändringar minimerar fluktuationer i koncentrationer av parakrina signaler som utsöndras i odlingsmediet 9.

4. Koloni Picking för första passagen

  1. Ta medium från brunnar som innehåller kolonier som passeras och lägga nytt medium stamceller.
  2. Identifiera kolonier med en 10x objektiv. Med mikroskopet något de-fokuserade, kommer SSC kolonier vid kanten av brunnen visas som homogena ljusa klumpar, som består av många celler 11-12 ^ m diameter, där det är svårt eller omöjligt att urskilja de individuella cellkantlinjer, eftersom cellerna visas sammansmälta (Figur 1A). Icke-SSC kolonier kan verka mörkare, mer detaljerad, eller mindre homogen, med urskiljbara gränser (Figur 1A, infälld).
  3. Med användning av en 200 | il pipettspets, med pipetteman inställd till 50 pl, först ta upp mediet från brunnen och utvisa att väta spetsen. Sedan försiktigt knuffa kolonin med spetsen före snabbt dra 50 | il medium för att lösgöra kolonin genom sugning i spetsen (Figur 1B).
  4. Utvisa mediet innehållande kolonin till en brunn av en 48-brunnars platta innehållande inaktiverade matarceller med 100 pl stamcellmedium (figur 1C).
  5. Upprepa steg4,3 och lägga till upp till 8 kolonier till samma väl utan att överskrida 500 ul per brunn.
  6. Upprepa steg från 4,3 till 4,5 för att förbereda ytterligare brunnar i 48 brunnar med passage en SSC kolonier.
  7. Brunnar kommer att vara redo att delas upp i 7-14 dagar eller efter stora klumpar upp till 500 celler framkom har (figur 1D).

5. Efterföljande expansion och passage av SSC: er genom triturering

  1. Celler vid passage en bör subkultiveras på färskt matare efter upp till 14 dagar vid en delad på 1:2 för de första 3 passager och sedan 1:04 till 01:06 (var 7 dagar) därefter enligt följande. Försiktigt triturera kolonier utanför en semi-konfluent väl (t.ex. ~ 300.000 SSC: er / brunn av 6-brunnsplatta) med en 1 ml pipettspets genom att tvätta mediet över cellerna. Kolonier kan ses loss. För mycket kraft med strömmen av vätska orsakar oönskade matarceller att lossna också.
  2. Samla finfördelades celler i ett koniskt rör och centrifugera vid 300 xg under5 minuter. Observera: En trypsinisering steg kan säkert läggas här om så önskas av prövaren.
  3. Sug supernatanten och återsuspendera i färskt stamceller medium genom noggrant pipettera upp och ner för att störa kolonier.
  4. Plate SSC på nylagade matarceller inaktiverats med mitomycin-C som beskrivs i avsnitt 1.
  5. Mata cellerna tre gånger per vecka enligt följande. För första och andra utfodring (t.ex. måndag och onsdag) tillsätt 50 volym% färskt medium. För tredje matning (t.ex. fredag), aspirera alla medel och ersätta med 2 ml färskt medium. Plattorna blir sammanflytande i 7-10 dagar. Kulturer bör bestå av> 98% könsceller (dvs <1% förorenande somatiska celler) efter 5-7 passager, baserat på immunfärgning (t.ex. med hjälp av murina könscell markör GCNA) för att skilja könsceller från somatiska celler 10. Obs: Dessa metoder har utvecklats i enlighet med regler och krav som anges av institutionenal Animal Care och användning kommittén vid Weill Cornell Medical College.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utseendet av passagen noll vildtyp, är vuxna SSC kolonier efter 7 dagar som visas i figur 1. Tredimensionella kolonier består av ett skikt av platta celler fästa vid matare eller underhuggare extracellulär matris som deponerats av matarna med flera skikt av SSC: er som växer på toppen. Medan friska SSC är ljust ljusbrytande och likformigt 11-12 ^ m diameter, cellkanterna är svåra att särskilja och storleken av kolonierna kan vara mycket varierande, både inom brunn och mellan brunnar framställda från olika möss. Visualisering av kolonierna underlättas av en fas-mikroskop med en digital display och en något de-fokuserad fokalplanet, vilket förstärker kontrasten mellan höggradigt homogena SSC kolonier och kontaminerande somatiska celler som är närvarande i tidig passage (0-2) kulturer och gör inte bildar tätt packade kolonier (se figur 1A infälld). Observera att morfologin hos matarceller kommer förändras gradvis afTER omkoppling från DMEM/10% att hejda cellodlingsmedium efter inaktivering med mitomycin-C.It är också viktigt att notera att den ursprungliga cellsuspensionen inte filtreras eller ansträngda, eftersom kvarvarande klumpar av somatiska celler tros öka överlevnaden av SSC: er vid av den ursprungliga plätering och bör inte tas bort förrän SSC kolonier är etablerade. Seriepassage (> 5-7 gånger) för att rena könsceller till nära homogenitet (> 98%) och bryter kvarvarande somatiska celler. Om efterföljande experiment kommer särskilt att kräva anrikning av stamceller från den totala populationen av könsceller i kulturen, då celler val med immunomagnetiska pärlor eller flödescytometri kan användas för ytterligare rening, till exempel stamceller anrikning kan erhållas med hjälp av antikroppar mot Thy1 , CD9, α6 integrin och andra 11. Identitet SSC bör därefter bekräftas med immunfenotypning, genuttryck, och transplantation, eftersom transplantatjon-analys är det enda sättet att slutgiltigt bedöma mängden autentiska, funktionella stamceller 12,13.

Figur 1
Figur 1. Morfologi av tidiga SSC kolonier, testikulära stromaceller och matare. A, utseende begynnande SSC kolonier ~ 5 dagar efter initial plätering. Infällda bilden visar kontaminerande monocyt-liknande somatiska celler i en passage noll kultur. B, urval och plockning av individuella kolonier för första passagen (~ 14 dagar) till 48-brunnars plattor. Den svart struktur är pipettspetsen. C. Utseende av inaktiverade JK1 matarceller. D, Stora kolonier före rutinmässig subodling. Pilar indikerar SSC kolonier. Skala bar i A är 100 nm (infällda, 50 um) och i BD är 200 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna metod för att härleda vuxna SSC med vuxna testikel-härledda matarceller är robust och har lyckats när gemensamma genetiska bakgrund (t.ex. FVB, C57BL6 och blandade 129SV/C57Bl/6) och olika muterade stammar användes 2,3,7,14. I själva verket är mikromiljön som skapas av den kultur-systemet tillräckligt för att övervinna några av de genetiska hinder för att upprätthålla vuxna SSC in vivo (t.ex. i fråga om plzf - / - djur) 7. Medan vi använder JK1 celler som matare, kan icke-transformerade adulta testikel somatiska celler också kan användas med samma effektivitet som JK1 celler 2,3.

SESC har utformats för att effektivt få långfristiga vuxna SSC linjer. Tyvärr är hög effektivitet uppnås med en kompromiss av följande skäl. En anmärkningsvärd begränsning av förfarandet är att utelämnandet av en filtrering eller ansträngande steg vid första plätering och manipulation som GÅNGe innebär, vilket kan påverka cellöverlevnad, kan orsaka betydande variation i cellantal pläterade från brunn till brunn, vilket utesluter en effektiv kvantifiering i det skede av inledande kolonibildning. Emellertid kan kvantitativa analyser utföras med något senare passage kulturer vid vilken tidpunkt en enkelcellsuspension kan lätt framställas genom vanlig trypsinisering (> passagen 5-7).

Eftersom vuxna SSC i kultur kan byggas ut och underhållas nästan oändliga, gör detta protokoll effektiv produktion av cellinjer som kan användas senare i ett liknande sätt som andra etablerade primära kulturer eller cellinjer (dvs. gen-och proteinuttryck analyser eller ektopisk uttryck för en gen av intresse). Ändå är det viktigt att i slutändan bekräfta resultat med transplantation analys som guldmyntfoten eller annan validerad surrogat analys, såsom SSC klusterbildning analys 12,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MS erhåller royalties från Weill Cornell Medical College genom en licens till Cell Biolabs, Inc. att distribuera JK1 celler.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av New York State Department of Health (C026878). MS var en New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Delvis stöd i forskningsbidrag nr 5-FY11-571 från March of Dimes Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013 Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA Mediatech 25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34) Life Technologies 10639-011 Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements various see Table 3 Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells Cell Biolabs, Inc. CBA-315 Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION) Sigma-Aldrich M4287 Toxic; Handle with care.
Gelatin Sigma-Aldrich G1890 0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope Advanced Microscopy Group -
Table 1. Specific reagents and equipment.
*See Table 3
DMEM Corning 10-013 Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250) Life Technologies 27250-018 Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml Worthington CLS1 235 Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I Sigma-Aldrich DN25 Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin ICP Bio ABRE-100g Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM Life Technologies 10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement Life Technologies 10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids Sigma-Aldrich M7145 1X
MEM Vitamin solution Life Technologies 11120-052 1X
L-glutamine Mediatech 25-005 2 mM
bovine serum albumin ICP Bio ABRE 0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution Mediatech 30-004-CI 1X
D(+)glucose Sigma-Aldrich G8769 6 mg/ml
β-estradiol Sigma-Aldrich E2758 30 ng/ml
progesterone Calbiochem 5341 60 ng/ml
fetal bovine serum variable n/a 1%
bovine holo-transferrin Sigma-Aldrich T1283 100 μg/ml
insulin Gemini Bio-Products 700-112P 25 μg/ml
human GDNF Life Technologies PHC7041 10 ng/ml
human bFGF Life Technologies PHG0023 10 ng/ml
mouse EGF Life Technologies PHG0313 20 ng/ml
putrescine Research Organics 0778P 60 μM
sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261 30 nM
pyruvic acid Alfa Aesar A13875 30 μg/ml
DL-lactic acid J.T. Baker 0196-04 1 μg/ml
β-mercapt–thanol Life Technologies 21985-023 50 μM
ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 100 μM
D-biotin Sigma-Aldrich B4639 10 μg/ml
Table 3. Stem cell medium
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).
  2. Seandel, M., et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 449, 346-350 (2007).
  3. Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells. Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).
  4. Ogawa, T., et al. Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines. Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).
  5. Schmidt, J. A., et al. In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function. Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).
  6. Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. Aging of male germ line stem cells in mice. Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).
  7. Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1. Cell. 142, 468-479 (2010).
  8. Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).
  9. Csaszar, E., et al. Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling. Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).
  10. Enders, G. C., May, J. J. Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female. 163, 331-340 (1994).
  11. Oatley, J. M., Brinster, R. L. Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).
  12. Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).
  13. Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).
  14. Arnold, K., et al. Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice. Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).
  15. Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).

Tags

Stamcellsbiologi molekylärbiologi Cellulär biologi medicin genetik utvecklingsbiologi anatomi kirurgi spermatogoniala stamceller stamceller celler feeder könsceller testiklarna cellodling mikromiljö stamceller nisch progenitorceller möss transgena möss djurmodell
Seriell Anrikning av spermatogoniala stam-och stamfaderceller (SSC) i Kultur för Härledning av långfristiga SSC vuxen mus Lines
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, L. A., Seandel, M. SerialMore

Martin, L. A., Seandel, M. Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines. J. Vis. Exp. (72), e50017, doi:10.3791/50017 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter