Summary
여기 조직 공학을위한 개 층 사이의 끊임없는 인터페이스와 biocompatible, 다층 매트릭스를 만들기위한 독특한 전략을 설명합니다. 이러한 비계는 다양한 생물학적, 화학적 또는 기계적 신호에 의해 세포 행동을 조절하기 위해 이상적인 사용자 정의 환경을 제공 할 수
Abstract
유형 및 생물학적 자극 (예 : 성장 요인 억제제, 작은 분자) 또는 매트릭스 구조의 농도는 (매트릭스의 예 조성, 농도, 또는 강성) 공간을 통해 다양하고있는 복합 조직 문화 매트릭스는 조사의 다양한 사용 것 이 변수는 셀 차별화, 마이그레이션 및 기타 현상에 미치는 영향에 관한. 계층 매트릭스를 생성의 주요 과제는 각 레이어 1에서 개별 구성 요소의 확산없이 레이어 인터페이스의 구조 무결성을 유지하고 있습니다. 이를 위해 현재 방법론은 photopatterning 2-3, 리소그래피 4 연속 functionalization5, 6 건조 동결, microfluidics 7 또는 어떤 많은 복잡한 장비 및 기술 능력을 필요로 원심 분리 8이 포함되어 있습니다. 기타 층 9 박리가 발생할 수 있습니다 개별 레이어의 연속 첨부 파일에 의존
DGMP는 밀도 10 달러를 변화의 레이어를 만들 수 같은 iodixanol 같은 불활성 밀도 변형을 사용하여 이러한 문제를 극복. 밀도 수정은 어떤 성 예비 중합체 또는 bioactive 분자와 혼합 될 수 있기 때문에, DGMP는 각 비계 층이 사용자 정의 할 수 있습니다. 그들은 수성 유지하면서 단순히 밀도 변형의 농도를 변화하는 것은 인접한 레이어의 혼합 방지 할 수 있습니다. 후속 단일 단계 중합은 각 층은 독특한 화학적, 기계적 성질을 가지고있는 구조적 연속 multilayered 발판에 상승을 제공합니다. 밀도 수정은 쉽게 개별 레이어 또는 구성 요소의 섭동없이 린스 충분한와 함께 제거 할 수 있습니다. 이 기술은 따라서 잘 다양한 크기, 형태, 및 자료의 hydrogels를 만들 적합합니다.
번갈아 가며 층 RGDS-350 통합하는 2D-폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 젤, 제조를위한 프로토콜은 아래 설명되어 있습니다. 우리는 PEG B를 사용이 biocompatible 및 불활성입니다 ecause. RGDS, 세포 접착 펩타이드 11, 생물학적 단서의 공간 제한을 설명하는 데 사용, 그리고 형광 (알렉사 형석 350)의 활용은 우리가 시각적으로 다양한 레이어를 구별 할 수 있습니다. 이 절차는 다른 재료에 적용 할 수 있습니다 (예 : 콜라겐, hyaluronan 등) 10 일부 수정 3D 젤을 제조하도록 확장 할 수 있습니다.
Protocol
1. 휘황 레이블 Acryloyl-PEG-RGDS의 합성
- 상온에서 아르곤에 따라 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 1.2:1:2 몰 비율에서와 NN diisopropylethylamine (DIPEA) : acryloyl-PEG-succinimidyl 카르복시 메틸 에스테르 (3천4백그램 / 몰 aPEG-SCM, PEG MW)로 RGDS 펩타이드를 반응 하룻밤.
- 비행 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 이온화 시간 (든 - TOF) 질량 분광법에 의해 활용을 확인합니다. 든 대상과 드라이에 샘플 명소로 aPEG - RGDS 반응 용액 1 μl를 추가합니다. 유니버설 든 tetrahydrofuran의 매트릭스 (THF) 및 1 분에 소용돌이 포화 용액을 준비합니다. 동일한 샘플 지점이 솔루션의 ~ 1 μl를 추가합니다. 비교를 위해 aPEG-SCM 절차를 반복합니다. 로드 분석 할 수 있습니다. aPEG - RGDS의 분자 무게 aPEG-SCM (그림 2)보다 커야합니다.
- 형광을 결합한하려면 용해 알렉사 형석 350 카르 복실 산 (succinimydyl 에스테르)의 몰 금액을 추가DMSO의 최소 볼륨에서, 1.1에서 aPEG-RGDS 반응 솔루션과 하룻밤 실온에서 아르곤에 따라 반응한다.
- 하루에 적어도 두 번 dialysate 교환, 1,000:1 용적 비율 48 시간에 대해 4 ° C에서 DI-H 2 O에 대해 (MW 3500 다) dialyzing에 의해 aPEG-RGDS-350 정화.
- 정화 Labconco Freezone 플러스 또는 이에 상응하는 동결 건조 시스템에서 aPEG-RGDS을 350 및 -20 ° C.에 상점을 건조 고정
2. RGDS-350 레이어를 교대로 2D PEG 젤의 2D 몰드와 제작의 작성
- 소수성 유리 슬라이드를 준비합니다. 진공 오븐에 유리 그릇에 깨끗한 유리 슬라이드를 놓습니다. 80 열 ° C 30 분에 완전히 표면을 건조합니다. 장소 퓸 후드에 슬라이드를 즐길 수있는 요리와 부드럽게 코트 전체 표면에 30 초에 흔들 각 슬라이드에 250 μl Sigmacote를 추가합니다. 철저히 leas에서의 5 분에 두 번 몸을 담근 채, 증류수에 세척 한 다음, 100 % 메탄올로 코팅 된 슬라이드를 헹굼t 10 ML.
- 10mm 생검으로 주먹을 실리콘 스페이서 (두께 0.8 mm)을 자른다.
- 실리콘 스페이서와 Sigmacote - 처리 유리 슬라이드를 압력솥.
- 혼합 PEG diacrylate (PEGda)에 의해 개별 microfuge 튜브의 각 각 레이어에 대한 솔루션을 공식화 전구체 (최종 농도 15% w / V) 다양한 최종 농도 (예를 들면 40 %를, 얻을 수있는 iodixanol의 다른 양 (물에 60 %의 재고 솔루션)와 30 %, 20 %, 10 %), 인산과 나머지 볼륨을 보충하는 것은 등급 밀도의 솔루션을 얻기 위해 (PBS) 염분 버퍼. 비슷한 방법으로 레이어를 번갈아 가며 들어, iodixanol 및 PBS와 혼합 aPEG-RGDS-350 (최종 농도 8 MM)는 다양한 농도 (예를 들면 35%, 25 %, 15 %) 얻을 수 있습니다.
- 다양한 층 (각 층 솔루션의 ML 당 재고 솔루션의 10 μl)에 대한 각 솔루션에 (2 - 히드 록시 4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone, N-비닐 pyrrolidone의 333mg/ml 주식) photoinitiator을 추가합니다. Photoinitiator 전S는 빛에 민감하므로, 금형의 젤의 레이어링하기 전에 중합을 방지하기 위해 마지막으로 추가되었습니다.
- 이 프로토콜의 후속 단계는 불임을 보장하기 위해 바이오 안전성 캐비닛에서 수행됩니다.
- 멸균 한 ML의 주사기와 0.2 μm 필터를 사용하여 각 솔루션을 필터 소독. 이 Sigmacore - 처리 유리 슬라이드와 그림 1에 묘사 된대로 배치 클램프와 보안 사이의 공백을 sandwiching하여 금형 설정을 조립.
- 적은 고밀도 솔루션 (35 % iodixanol있는 예 aPEG-RGDS-350)에 이어 가장 고밀도 솔루션 (40 % iodixanol있는 예 PEGda) 첫을 추가하여 계층 젤을 던져. 그림 1과 같이 원하는 구성과 밀도의 여러 레이어를 달성하기 위해 다른 레이어링를 반복합니다.
- 휴대용 UVR-9000 램프를 사용하여 3 분에 365 nm의 빛으로 금형을 비추다. polymerized 젤은 5 분 동안 치료 할 수 있습니다. 클램프를 제거하고 부드럽게 상단 유리를 들어슬라이드와 곰팡이, 층상 DGMP의 젤은 슬라이드에 남아있게됩니다. 멸균 주걱을 사용하여 조심스럽게 무균 PBS 또는 세척을위한 문화 매체를 포함하는 50 ML 튜브에 젤을 배치합니다.
- 밀도 수정, photoinitiator 및 unreacted 폴리머를 제거하는 하루에 적어도 두 번 버퍼를 교환, 1,000:1 용적 비율로 PBS에 polymerized 젤을 씻는다. 또한 PBS는 세포의 성장 매체로 교환 할 수 있습니다. PBS 또는 3 단계에서 설명한 세포 배양 실험의 성장 매체에 DGMP 젤을 저장합니다.
- 교대 레이어를 시각화하려면 VersaDoc 젤 문서 단위의 샘플 트레이에 자 함께 DGMP 젤을 (이 젤은 세포 배양에 사용할 수 없습니다) 주선합니다. 350 nm 정도의 젤을 노출, 노출 시간은 형광의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. DGMP 히드로 겔에 어두운 파란색 밴드를 교체하는 것은 별개의 화학 성분 (그림 3)의 분리 층의 형성을 보여줍니다.
- RGDS의 펩타이드를 통합 젤 들어, C2C12 myoblasts 등의 접착에 의존 세포를 사용합니다.
- 부드럽게 바이오 안전성 캐비닛에 무균 세포 스크레이퍼를 사용하여 48도 세포 배양 플레이트의 우물에 DGMP 젤을 (PBS에 저장) 삽입합니다.
- 사전 따뜻한 성장 매체 (Dulbecco의 수정 이글 배지 또는 DMEM 10 % V / V 태아 소 혈청과 1% 브이 / v 100x 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션과 보충)과 37 번 설정 물 목욕에 PBS ° C.
- PBS로 C2C12 세포 세 번이나 60 % 합류 플레이트 (10mm)를 씻으십시오. 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML를 추가하고 2 분에 37 ° C에서 잠복기에 의해 PBS와 수확 세포를 대기음. 성장 매체와 카운트 세포에서 세포를 Resuspend. 종자 DGMP 젤이 포함 된 C2C12 myoblasts (20,000 세포 / cm 2)과 잘 세포 배양합니다. 5 % CO 95분의 2 % 상대 습도에서 37 ° C에서 세포를 배양. 주의 4 시간 후 부드럽게 교환 매체를 다시하지 않기가볍게 준수 세포를 이동합니다.
- 24 시간 후, DGMP 젤의 RGDS 함유 층에 C2C12 myoblasts의 첨부 파일은 epifluorescence과 위상 대비 현미경 (Zeiss Axiovert 200)을 통해 확인 할 수 있습니다.
Representative Results
든 - TOF 분석 acryloyl-PEG에 RGDS의 펩타이드 (그림 2)의 결합을 확인합니다. 젤 영상은 photopolymerization (그림 3A) 이후 RGDS-350 (파란색) 레이어를 번갈아 가며 보여준다. 그림 3a에 도시 된 바와 같이, 2D DGMP 젤 크기는 실리콘 금형 (왼쪽 10mm,, 8mm, 오른쪽)의 직경에 따라 다양 할 수 있으며, 따라서 여러 assays에 사용하기 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다 -이 경우에 맞게 48 잘 세포 배양 플레이트 (그림 3B). Epifluorescence과 DGMP 젤을 배양 C2C12 myoblasts의 위상 대비 현미경가 선택적 첨부 파일을 보여줍니다 RGDS-350이 포함 된 셀 접착 펩타이드 (RGDS)의 compartmentalization을 보여주는 PEG 레이어를 (그림 4).
1 그림. 분자 무게는든 - TOF는 RGDS의 펩타이드의 결합 후 얻은 aPEG - RGDS에 aPEG-SCM을 비교하여 HT 분석.
그림 2. DGMP 겔 제조의 개략도. 그라데이션이 층을 한 후에 그들이 photopolymerization 다음 단계적 인터페이스를 만들 시간 기간 (t들) 변화에 정착 할 수 할 수 있습니다. 층상 DGMP의 젤 쉽게 더 사용을위한 금형에서 추출 할 수 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. photopolymerization 후 얻은 A) 2D multilayered 젤은 350 nm의와 마찬가지의 하얀 빛 채널을 사용하여 이미징닥터 겔 문서 단위입니다. 이 이미지는. B) DGMP 젤의 삽입 48도 세포 배양 요리에 흰색으로 RGDS를 포함하는 레이어를 번갈아 가며 나타 그레이 스케일.
그림 4. 통합 위상 대비, DGMP 젤 (스케일 바 50 μm)에서 성장 C2C12 myoblasts의 epifluorescence 이미지입니다.
그림 5. 2 NN 힘 트리거 12 이전에 설정 한 방법을 사용하여 가교 PEG 기판의 정적 샘플 겔 표면 탄성에 iodixanol의 효과. 원자 힘 현미경 측정. * P <0.05와 ** P <0.01.
Discussion
DGMP 비싼 장비에 의존하지 않는 multilayered 젤을 준비하기위한 간단한 전략이다. 이 프로토콜은 이러한 콜라겐과 hyaluronic 산성 등의 biocompatible 재료를 사용하여 공사장 공중 발판을 만들기위한 적응 할 수 있습니다. 층 사이 신호의 혼합 방지하기 위해 Bioactive 작은 분자, 예를 들어 셀이 부착이 - 홍보 RGDS의 펩타이드를 고분자 매트릭스에 닿는 할 수 있습니다. 그들은, 매트릭스 메쉬 크기에 따라, hydrogels ~ 10 무마 적은 경향이 같은 단백질은 화학 결합에 대한 필요없이 개 층에 캡슐화 할 수 있습니다. 여기 iodixanol (Nycoprep), 이전에 생균 응용 프로그램에 사용 된 불활성 밀도 변형을 사용 하였다. 이러한 자당 및 덱스 트로 오스와 같은 다른 밀도 조절도 사용할 수 있습니다. 정착 시간 (t들)을 변화시킴으로써, 하나는 필요에 따라 두 레이어 사이의 인터페이스 (이상 정착 시간이 부드럽게 전환 할 수 있습니다) 과격하거나 날카로운 전환을 생산 조정 할 수 있습니다 <> 10 논의하게 될 것입니다. 예를 들어, DGMP 젤 레이어 사이의 부드러운 전환 효과는 같은 chemotaxis와 같은 세포 과정을 연구 할 수있는 생물학적 신호의 연속 그라디언트를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
겔 강성의 밀도 수정의 효과가 15 % aPEGda 젤에 대한 그림 5에 표시됩니다, PEGda과 iodixanol 농도의 함수로 강성 및 다공성의 더 완전한 특성화 현재 평가되고 있습니다. 이 예에서 PEGda의 농도가 상대적으로 높은 반면, 우리는없는 젤에 비해 30 % iodixanol와 젤에 60 % 더 큰 탄성 계수를 관찰했다. 겔 강성의 변화는 변조 macromer 농도 또는 crosslinking 밀도가 비용을 조정할 수 있습니다.
우리는 또한 polyacrylamide와 PEG의 전구체 (10)을 사용하여 3D multilayered 젤을 만들 수있는 DGMP 기술을 적용했습니다. 농도 또는 성 예비 중합체의 crosslinking의 정도를 변화하는 것은 허용의 구조 변화3D로 양극화 성장 및 마이그레이션과 같은 세포 행동을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다 공사장 공중 발판.
요약, DGMP는 생물 의학 및 기초 연구 응용 프로그램의 광범위한 biocompatible 재료의 다양한 2D 및 3D 공사장 공중 발판을 제조에 적용 할 수있는 적응 기술이다.
Disclosures
저자는 공개 할 충돌 관심이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 NIH 원장의 새로운 혁신 상 (1DP2 OD006499-01 AA와 1DP2 AJE에 OD006460-01까지)에서 지원하고, 과학 기술 (Nanomedicine의 우수의 UC 샌디에고 센터)의 킹 Abdulaziz시 감사합니다. 우리는 원고에 대한 그녀의 중요한 의견 씨 제시카 무어 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 | |
| Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 | |
| Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 | |
| N,N- Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 | |
| N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 | |
| Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 | |
| Sigmacote | Sigma | SL2 | |
| Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 | |
| Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
|
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 | |
| Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| MALDI | Bruker | N/A | |
| UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 | |
| VersaDoc | Bio-Rad | N/A |
References
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