Summary
Her beskriver vi en unik strategi for å skape biokompatible, lagdelte matriser med kontinuerlig grensesnitt mellom forskjellige lag for tissue engineering. Et slikt stillas kunne gi et ideelt tilpasses miljø for å modulere celle atferd av ulike biologiske, kjemiske og mekaniske signaler
Abstract
Komplekse vevskultur matriser, i hvilke typer og konsentrasjoner av biologiske stimuli (f.eks vekstfaktorer, inhibitorer, eller små molekyler) eller matrise struktur (f.eks sammensetning, konsentrasjon, eller stivhet av matrisen) varierer over plass, ville muliggjøre et bredt spekter av undersøkelser om hvordan disse variablene påvirker celledifferensiering, migrasjon og andre fenomener. Den store utfordringen i å skape lag matriser er å opprettholde den strukturelle integriteten lag grensesnitt uten diffusjon av enkeltkomponenter fra hvert lag en. Aktuelle metoder for å oppnå dette er photopatterning 2-3, litografi 4, sekvensiell functionalization5, frysetørking 6, MicroFluidics 7 eller 8 sentrifugering, mange av dem krever avansert instrumentering og tekniske ferdigheter. Andre er avhengige sekvensiell feste individuelle lag, som kan føre til delaminering av lagene 9
DGMP overvinner disse problemene ved hjelp av en inert tetthet modifier eksempel iodixanol å lage lag av varierende densiteter 10. Siden tettheten modifier kan blandes med noe prepolymer eller bioaktive molekyler, lar DGMP hver stillas lag som skal tilpasses. Simpelthen variere konsentrasjonen av tettheten modifier hindrer blanding av tilgrensende lag mens de forblir vandig. Etterfølgende enkelt trinn polymerisasjon gir opphav til en strukturelt kontinuerlig flerlags stillas, hvor hvert lag har distinkte kjemiske og mekaniske egenskaper. Tettheten modifier kan enkelt fjernes med tilstrekkelig skylling uten forstyrrelse av de enkelte lag eller deres komponenter. Denne teknikken er derfor velegnet for å lage hydrogeler i forskjellige størrelser, former og materialer.
En protokoll for fremstilling av en 2D-polyetylenglykol (PEG) gel, hvori vekslende lag innlemme RGDS-350, er angitt nedenfor. Vi bruker PEG because det er biokompatibelt og inert. RGDS, en celleadhesjon 11 peptid, blir brukt til å demonstrere romlig begrensning av en biologisk cue og konjugering av en fluorofor (Alexa Fluor 350) gjør det mulig å visuelt skille ulike lag. Denne prosedyren kan tilpasses for andre materialer (f.eks kollagen, hyaluronan, etc.) og kan utvides til å fabrikkere 3D geler med noen modifikasjoner 10.
Protocol
1. Syntese av fluorescensmerkede akryloyl-PEG-RGDS
- Reagere RGDS peptid med akryloyl-PEG-succinimidyl karboksymetyl ester (aPEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) og NN diisopropyletylamin (DIPEA) i 1.2:1:2 molforhold i dimetylsulfoksyd (DMSO) under argon ved romtemperatur over natten.
- Bekreft konjugering av Matrix-assistert laser desorpsjon / ionisering flukttiden (MALDI-TOF) massespektrometri. Tilsett 1 pl aPEG-RGDS reaksjonsløsning med fargekartet flekk på MALDI målet og tørr. Forbered en mettet oppløsning av Universal MALDI Matrix i tetrahydrofuran (THF) og virvle i 1 min. Legg ~ 1 pl av denne løsning til den samme prøven spot. Gjenta prosedyren for aPEG-SCM for sammenligning. Laste og analysere. Molekylvekten av aPEG-RGDS bør være større enn aPEG-SCM (figur 2).
- Å conjugate fluoroforen, legge en ekvimolar mengde av Alexa Fluor 350 karboksylsyre (succinimydyl ester), oppløsti en minimal mengde av DMSO, til aPEG-RGDS reaksjonsoppløsning fra 1,1 og reagerer under argon ved romtemperatur over natten.
- Rens aPEG-RGDS-350 ved dialyzing (MW 3500 Da) mot DI-H 2 O ved 4 ° C i 48 timer ved 1,000:1 volumetrisk forhold, utveksle dialysatet minst to ganger per dag.
- Frys tørke renset aPEG-RGDS-350 i en Labconco Freezone Plus eller tilsvarende fryse tørr system og oppbevar ved -20 ° C.
2. Utarbeidelse av en 2D Mold og Fabrikasjon av en 2D PEG Gel med Vekslende rgds-350 Layers
- Forbered hydrofobe glassplater. Plasser rene glassplater i et glassfat i et vakuum ovn. Varm opp til 80 ° C i 30 min for å tørke overflaten. Sted tallerken med lysbilder i en avtrekkshette og tilsett 250 ul Sigmacote til hvert lysbilde, forsiktig rocking i 30 sek til pels hele overflaten. Skyll de belagte lysbildene med 100% metanol, etterfulgt av vasking i destillert vann, to ganger for soaking 5 min i på least 10 ml.
- Skjær silikon avstandsstykker (0,8 mm tykk) med 10 mm biopsi slag.
- Autoklaveres silikon avstandsstykker og Sigmacote behandlet glass-slides.
- Formulere løsninger for hver respektive lag i individuelle mikrofugerør ved blanding PEG diacrylate (PEGda) forløper (sluttkonsentrasjon 15% w / v) med forskjellige mengder av iodixanol (60% stamløsning i vann) for å gi varierende sluttkonsentrasjoner (f.eks 40%, 30%, 20% og 10%), som supplerer den gjenstående volum med fosfatbufret saltvann (PBS) for å oppnå oppløsninger av gradert densitet. På lignende måte, for vekslende lag, å blande aPEG-RGDS-350 (sluttkonsentrasjon 8 mM) med iodixanol og PBS gi forskjellige konsentrasjoner (f.eks 35%, 25%, og 15%).
- Legg fotoinitiator (2-Hydroxy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-methylpropiophenone, 333mg/ml lager i N-vinylpyrrolidon) til hver løsning for forskjellige lag (10 ul av stamløsningen per ml av hvert lag løsning). Fotoinitiator ifiltre lagt sist å forhindre polymerisering før lagdeling av gelene i formen, fordi den er følsom for lys.
- Etterfølgende trinn i denne protokollen vil bli utført i en biosafety skap for å sikre sterilitet.
- Filter-sterilisere hver løsning ved hjelp av en steril 1 ml sprøyte og 0,2 mikrometer filter. Montere mold oppsettet ved sandwiching avstandsstykket mellom to Sigmacore behandlet glassplater og sikre med klemmer plassere som vist i Figur 1.
- Støpe lagdelte geler ved å legge den mest tette løsning (f.eks PEGda med 40% iodixanol) først, etterfulgt av en mindre tett løsning (f.eks aPEG-RGDS-350 med 35% iodixanol). Gjenta den alternative lagdeling for å oppnå flere lag av ønsket sammensetning og tettheter som vist i figur 1.
- Strålebehandling formen med 365 nm lys for 3 min ved hjelp av en bærbar UVR-9000 lampe. Tillat det polymeriserte gelene herde i 5 min. Fjern klemmene, deretter forsiktig løft den øverste glassetlysbilde og formen; de lagdelte DGMP gels vil forbli på lysbildene. Ved hjelp av en steril spatel, forsiktig plasserer geler i en 50 ml tube inneholder sterilt PBS eller kultur medium for vask.
- Vask de polymeriserte gelene i PBS ved 1,000:1 volumetrisk forhold, utveksle bufferen minst to ganger per dag for å fjerne tettheten modifikator fotoinitiator, og uomsatt polymer. Alternativt kan PBS byttes med cellevekst medium. Oppbevar DGMP gelene i PBS eller vekstmedium for cellekultur eksperimentet beskrevet i Trinn 3.
- For å visualisere vekslende lag, ordne DGMP gel (disse geler vil ikke være brukbar for cellekultur) langs en linjal på prøven skuffen en VersaDoc gel dokumentasjon enhet. Eksponer gelene i 350 nm; eksponeringstiden vil variere avhengig av konsentrasjonen av fluoroforen. Vekslende mørke og blå band i DGMP hydrogelen demonstrere dannelsen av diskrete lag adskilte kjemiske sammensetning (Figur 3).
- For geler som omfatter RGDS peptid, bruke adhesjons avhengige celler, for eksempel C2C12 myoblaster.
- Forsiktig inn DGMP gels (lagret i PBS) inn i brønnene av 48-brønners cellekulturer plater ved hjelp av en steril celle skrape i en biosikkerhet kabinett.
- Forvarme dyrkningsmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium eller DMEM supplert med 10% v / v føtalt bovint serum og 1% v / v 100x penicillin-streptomycin-løsning) og PBS i et vannbad innstilt på 37 ° C.
- Vask en 60% konfluent plate (10 mm) av C2C12 celler tre ganger med PBS. Aspirer avslag PBS og høste celler ved tilsetning av 1 ml av 0,25% trypsin-EDTA og inkubering ved 37 ° C i 2 min. Resuspender cellene i vekstmedium og telle celler. Seed den DGMP gel som inneholder cellekultur godt med C2C12 myoblasts (20.000 celler / cm 2). Inkuber cellene ved 37 ° C i 5% CO 2/95% relativ fuktighet. Forsiktig utveksling medium etter 4 timers, forsiktig for ikke å reflytte lett følges celler.
- Etter 24 timer, kan feste C2C12 myoblaster på RGDS-holdige lag med DGMP geler bekreftes ved epifluorescence og fasekontrast mikroskopi (Zeiss Axiovert 200).
Representative Results
MALDI-TOF-analyse bekrefter konjugering av RGDS peptid til akryloyl-PEG (figur 2). Gel bildebehandling avslører vekslende rgds-350 (blå) lag etter fotopolymerisasjon (figur 3A). Som vist i figur 3A, kan 2D DGMP gel størrelse varieres basert på diameteren av silikon støpeformer (10 mm, venstre, 8 mm, høyre), og derfor er lett tilpasses til bruk i forskjellige assays - i dette tilfellet til å passe en 48 godt cellekultur plate (figur 3B). Epifluorescence og fasekontrast mikroskopi av C2C12 myoblaster dyrket på en DGMP gel viser selektiv feste på RGDS-350-inneholdende PEG lag (fig. 4), som demonstrerer compartmentalization av celleadhesjon peptid (RGDS).
Figur 1. Molekylær weight analyse av MALDI-TOF sammenligne aPEG-SCM til aPEG-RGDS oppnås etter konjugering av RGDS peptid.
Figur 2. Skjematisk representasjon av DGMP gel fabrikasjon. Etter gradienter lagdelt, kan de bli tillatt å sedimentere i varierende tidsperioder (t s) for å opprette grensesnitt graderte, etterfulgt av fotopolymerisasjon. Lagdelte DGMP gels kan enkelt trekkes ut fra formen for videre bruk. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. A) 2D flerlags gels innhentet etter fotopolymerisasjon avbildes ved hjelp 350 nm og hvitt lys kanaler med VersaDoc gel dokumentasjon enhet. Den gråtonebilde avslører vekslende lag som inneholder RGDS i hvitt. B) Innsetting av DGMP gel inn 48-vel cellekultur retter.
Figur 4. Sammenslåtte fasekontrast og epifluorescence bilde av C2C12 myoblasts dyrket på DGMP gels (skala bar 50 mikrometer).
Figur 5. Effekt av iodixanol på gel overflaten elastisitet. Atomic force mikroskopi målinger av statiske prøver av tverrbundne PEG underlag ved hjelp tidligere etablerte metoder med en 2 nN kraft trigger 12. * P <0,05 og ** p <0,01.
Discussion
DGMP er en enkel strategi for å forberede flerlags geleer som ikke er avhengig av dyre instrumentering. Denne protokollen kan tilpasses for å skape stillaser bruker andre biokompatible materialer, slik som kollagen og hyaluronsyre. Bioaktive små molekyler, for eksempel celle adhesjon-fremme RGDS peptid, kan tjoret til polymermatriksen for å unngå sammenblanding av signaler mellom lag. Proteiner kan innkapsles i distinkte lag uten behov for kjemisk konjugering som de, avhengig matrisen maskevidde, er mindre tilbøyelige til å diffundere gjennom hydrogeler 10. Her har vi brukt iodixanol (Nycoprep), en inert tetthet modifier, som tidligere har vært brukt for levedyktige celle applikasjoner. Andre tetthet bestemmelsesord slik som sukrose og dekstrose kan også brukes. Ved å variere innsovningstid (t s), kan man finjustere grensesnittene mellom to lag for å produsere jevne eller skarpe overganger etter behov (lengre innsovningstid gir jevnere overganger) <sup> 10. For eksempel, kunne jevnere overganger mellom DGMP gel lag brukes til å generere en kontinuerlig gradient av en biologisk stikkordet å studere celleprosesser som kjemotaksis.
Effekten av tetthet modifier på gel stivhet er vist i figur 5 for en 15% aPEGda gel; en mer komplett karakterisering av stivhet og porøsitet som en funksjon av PEGda og iodixanol konsentrasjoner blir nå vurdert. Mens PEGda konsentrasjonen i dette eksempelet er relativt høy, observerte vi en 60% høyere elastisitetsmodul i geler med 30% sammenlignet med iodixanol geler uten. Endringen i gel stivhet kan justeres for ved å modulere makromer konsentrasjon eller tverrbinding tetthet.
Vi har også brukt DGMP teknikk for å lage 3D flerlags gels med polyakrylamid og PEG forløpere 10. Variere konsentrasjonen eller graden av tverrbinding av prepolymeren tillater strukturelle variasjon istillas, som kan brukes til å utforske celle atferd som polarisert vekst og migrasjon i 3D.
Oppsummert er DGMP en tilpasningsdyktig teknikk som kan brukes til å dikte 2D og 3D stillasene fra en rekke biokompatible materialer for et bredt spekter av biomedisinske og grunnleggende forskning.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende interesser å utlevere.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for støtten fra NIH regissørens nye Innovator Awards (1DP2 OD006499-01 til AA og 1DP2 OD006460-01 til Aje), og kong Abdulaziz City for Science and Technology (UC San Diego Center of Excellence i nanomedisin). Vi vil gjerne takke Ms Jessica Moore for hennes kritiske kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 | |
| Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 | |
| Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 | |
| N,N- Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 | |
| N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 | |
| Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 | |
| Sigmacote | Sigma | SL2 | |
| Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 | |
| Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
|
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 | |
| Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| MALDI | Bruker | N/A | |
| UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 | |
| VersaDoc | Bio-Rad | N/A |
References
- Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
- Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
- Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
- Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
- Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels. Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).
- Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
- Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
- Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
- Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).
