Summary
Здесь мы опишем уникальную стратегию для создания биосовместимых, слоистые матрицы с непрерывным интерфейсы между различными слоями для тканевой инженерии. Такие леса могли бы обеспечить идеальную настраиваемую среду для модуляции поведения клеток различных биологических, химических или механических сигналов
Abstract
Комплекс культуры тканей матрицы, в которой типы и концентрации биологических раздражителей (например, факторы роста, ингибиторы, или малых молекул) или матричной структуры (например, состава, концентрации и жесткости матрицы) изменяются в пространстве, позволит широкому кругу исследований о том, как эти переменные влияют на клеточную дифференцировку, миграцию и другие явления. Основной проблемой в создании слоистых матриц поддержания структурной целостности слоя интерфейсы без диффузии отдельных компонентов друг от слоя 1. Современная методология для достижения этой цели включает photopatterning 2-3, литографии 4, последовательное functionalization5, сублимационной сушки 6, микрофлюидики 7, или центрифугирования 8, многие из которых требуют сложных приборов и технических навыков. Другие полагаются на последовательное присоединение отдельных слоев, которые могут привести к расслоению слоев 9
DGMP преодолевает эти проблемы с помощью инертного модификатора плотности, таких как иодиксанол создавать слои различной плотности 10. Поскольку плотность модификатора может быть смешано с любым форполимера или биологически активные молекулы, DGMP позволяет каждому слою эшафот, чтобы быть настроены. Просто различной концентрации модификатора плотности предотвращает смешивание соседних слоев, пока они остаются водный. После одной стадии полимеризации приводит к структурно непрерывной многослойной леса, в котором каждый слой имеет различные химические и механические свойства. Плотность модификатора могут быть легко удалены с достаточным количеством воды без возмущения отдельных слоев или их компонентов. Эта методика поэтому хорошо подходит для создания гидрогелей различных размеров, форм и материалов.
Протокол для изготовления 2D-полиэтиленгликоля (PEG) гель, в котором чередующиеся слои включают Rgds-350, приводится ниже. Мы используем PEG бecause это биосовместимых и инертным. Rgds, клеточной адгезии пептидов 11, используется для демонстрации пространственных ограничений биологического кия, и сопряжение флуорофора (Alexa Fluor 350) позволяет визуально различать различные слои. Эта процедура может быть адаптирован и для других материалов (например, коллаген, гиалуроновая кислота и т.д.) и может быть расширен для изготовления 3D гели с некоторыми изменениями 10.
Protocol
1. Синтез флуоресцентно меченые акрилоил-PEG-Rgds
- Реакция Rgds пептида с акрилоил-PEG-сукцинимидил карбоксиметил эфира (aPEG-SCM, PEG МВт: 3400 г / моль) и Н. Н. диизопропилэтиламина (DIPEA) в 1.2:1:2 молярные соотношения в диметилсульфоксид (ДМСО) в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение ночи.
- Подтвердите сопряжение матрицы-активированной лазерной десорбции / ионизации времени пролета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Добавить 1 мкл aPEG-Rgds реакционного раствора на образец пятно на целевую MALDI и сухой. Подготовка насыщенным раствором универсального MALDI матрицы в тетрагидрофуране (ТГФ) и вихря в течение 1 мин. Добавить ~ 1 мкл этого раствора на том же месте образца. Повторите процедуру для aPEG-SCM для сравнения. Загрузите и анализировать. Молекулярная масса aPEG-Rgds должно быть больше, чем aPEG-SCM (рис. 2).
- Для сопряженных флуорофора, добавить эквимолярного количества Alexa Fluor 350 карбоновой кислоты (succinimydyl эфир), растворенныйв минимальном объеме ДМСО, в aPEG-Rgds реакционного раствора с 1,1 и реагируют в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение ночи.
- Очищают aPEG-Rgds-350 от диализа (MW 3500 Да) против DI-H 2 O при температуре 4 ° С в течение 48 ч при объемном соотношении 1000:1, обмен диализата по крайней мере, дважды в день.
- Замораживание сухой очищенный aPEG-Rgds-350 в Labconco Freezone Plus или эквивалент сухого замораживания системы и хранят при температуре -20 ° C.
2. Подготовка 2D форм и изготовление 2D гель ПЭГ с переменным Rgds-350 Слои
- Подготовьте предметные стекла гидрофобной. Поместите чистые предметные стекла в стеклянной посуде в вакуумной печи. Нагреть до 80 ° С в течение 30 мин до полного высыхания поверхности. Место блюдо с горки в вытяжном шкафу и добавить 250 мкл Sigmacote для каждого слайда, осторожно покачивая в течение 30 секунд, чтобы покрыть всю поверхность. Тщательно промойте покрытием слайды со 100% метанола, с последующей промывкой в дистиллированной воде, впитывая в два раза в течение 5 мин в лизингт 10 мл.
- Вырезать силиконовые прокладки (0,8 мм) с 10 мм удары биопсии.
- Автоклав силиконовые прокладки и Sigmacote обработанных предметные стекла.
- Формулировка решения для каждого соответствующего слоя в отдельных труб микроцентрифуге путем смешивания PEG диакрилат (PEGda) предшественника (конечная концентрация 15% вес / объем) с различным количеством иодиксанол (60% раствор в воде) с получением различных конечных концентраций (например, 40%, 30%, 20% и 10%), дополняя остальные тома с фосфатным буферным раствором (PBS) для получения решения градуированных плотности. Аналогичным образом, для чередующихся слоев, смешать aPEG-Rgds-350 (конечная концентрация 8 мМ) с иодиксанол и PBS для получения различных концентраций (например, 35%, 25% и 15%).
- Добавить фотоинициатора (2-гидрокси-4'-(2-гидрокси)-2-methylpropiophenone, 333mg/ml складе в N-винилпирролидон) для каждого решения для различных слоев (10 мкл раствора в мл каждого слоя раствора). Фотоинициатора яс добавлен последним для предотвращения полимеризации до слоев гелей в форме, так как он чувствителен к свету.
- Последующие этапы этого протокола будет выполнена в шкафу биобезопасности для обеспечения стерильности.
- Фильтр-стерилизовать каждого решения с помощью стерильного шприца 1 мл и 0,2 мкм. Соберите установку по форме сэндвич прокладку между двумя Sigmacore обработанных стеклах и безопасную зажимы размещения, как показано на рисунке 1.
- В ролях слоистых гелей, добавив самой густой раствор (например, PEGda с 40% иодиксанол) первым, а затем менее плотный раствор (например aPEG-Rgds-350 с 35% иодиксанол). Повторите дополнительное иерархическое для достижения нескольких слоев требуемого состава и плотности, как показано на рисунке 1.
- Облучать формы с 365 нм свет в течение 3 минут с помощью портативного UVR-9000 ламп. Разрешить полимеризоваться гели для лечения в течение 5 мин. Снимите зажимы, затем осторожно поднимите верхнее стеклослайдов и плесени; стратифицированную гели DGMP останется на слайдах. С помощью стерильного шпателя, осторожно поместите гелей в 50 мл пробирку, содержащую стерильный ФСБ или культуральной среды для стирки.
- Вымойте полимеризованный гелей в PBS в объемном соотношении 1000:1, обмен буфер по крайней мере, два раза в день, чтобы удалить плотность модификатора, фотоинициатор, и непрореагировавших полимеров. Кроме того, PBS может быть обменен с клеточной среде роста. Хранить DGMP гелей в PBS или питательной среды для эксперимента культуры клеток, изложенных в пункте 3.
- Для визуализации чередующихся слоев, организовать DGMP гель (эти гели не будут использоваться для культивирования клеток) вдоль линейки на образец лоток документации блока гель VersaDoc. Expose гелей в 350 нм, время экспозиции будет варьироваться в зависимости от концентрации флуорофора. Чередующихся темных и синих полос в DGMP гидрогель продемонстрировать формирования отдельных слоев различных химического состава (рис. 3).
- Для включения гели Rgds пептид, использовать сцепление зависимых клеток, таких как C2C12 миобластов.
- Аккуратно вставьте DGMP гели (хранится в PBS) в лунки 48-луночных культуре клеток пластины, используя стерильные скребком ячейки в кабинет биобезопасности.
- Предварительно теплой питательной среды (среда Игла, модифицированной Eagle или DMEM с добавлением 10% об / об эмбриональной телячьей сыворотки и 1% V / V 100x пенициллина-стрептомицина раствора) и PBS в водяную баню при температуре 37 ° C.
- Вымойте 60% сливной пластины (10 мм) C2C12 клеток в три раза с PBS. Аспирируйте с PBS и урожай клеток путем добавления 1 мл 0,25% трипсина-EDTA и инкубации при температуре 37 ° С в течение 2 мин. Ресуспендируют клеток в среде, рост и количество клеток. Семенной DGMP гель-содержащих клеточных культур хорошо с C2C12 миобластов (20.000 клеток / см 2). Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% CO 2/95% относительной влажности. Аккуратно обмен среду после 4 часов, осторожно, чтобы не повторнодвигаться легко придерживаться клеток.
- После 24 часов, крепление C2C12 миобластов на Rgds содержащих слои DGMP гели могут быть подтверждены эпифлуоресцентной и фазового контраста микроскопии (Zeiss Axiovert 200).
Representative Results
MALDI-TOF анализ подтверждает сопряжения Rgds пептида акрилоил-PEG (рис. 2). Гель изображений показывает переменного Rgds-350 (синий) слоев после фотополимеризации (рис. 3А). Как показано на рисунке 3А, 2D DGMP гель размер может быть изменен на основе диаметра силиконовые формы (10 мм, левое, 8 мм, справа), и, следовательно, легко настраиваемый для использования в нескольких анализах - в этом случае, чтобы соответствовать 48 хорошо пластина культуры клеток (рис. 3В). Эпифлуоресцентной и фазового контраста микроскопии C2C12 миобластов культивировали на DGMP гель показывает выборочный крепления на Rgds-350-содержащих ПЭГ слоев (рис. 4), что свидетельствует расчлененность пептида клеточной адгезии (Rgds).
Рисунок 1. Молекулярная weigHT анализа MALDI-TOF сравнения aPEG-СКМ aPEG-Rgds, полученные после конъюгации пептидов Rgds.
Рисунок 2. Схематическое изображение изготовлению DGMP гель. После градиенты слоистым, они могут осесть в течение различных периодов времени (T S) для создания градуированной интерфейсов, а затем фотополимеризации. Стратифицированных гели DGMP можно легко извлечь из формы для дальнейшего использования. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3.) 2D многослойный гель, полученный после фотополимеризации отображаемого использованием 350 нм и белый свет каналов VersaDoc гель документации устройства. Черно-белое изображение показывает чередующиеся слои содержащие Rgds в белый цвет. B) Введение геля DGMP в 48-луночных планшетах культуре клеток.
Рисунок 4. Объединенные фазового контраста и эпифлуоресцентной образ C2C12 миобластов, выращенных на DGMP гели (шкалы 50 мкм).
Рисунок 5. Влияние иодиксанол на гель упругости поверхности. Атомно-силовой микроскопии измерения статических образцов сшитого PEG подложках с использованием ранее установленных методов с 2 NN силу триггера 12. * Р <0,05 и ** р <0,01.
Discussion
DGMP является простой стратегией для подготовки многослойные гели, которые не полагаются на дорогой аппаратуры. Этот протокол может быть адаптирован для создания лесов, используя другие биосовместимые материалы, такие как коллаген и гиалуроновая кислота. Биологически активные маленькие молекулы, например, клеточной адгезии способствующих Rgds пептида, могут быть привязаны к полимерной матрице для предотвращения смешивания сигналов между слоями. Белки могут быть заключены в отдельные слои без необходимости химического сопряжения, как они, в зависимости от размера сетки матрицы, являются менее склонными к диффундировать через гидрогелей 10. Здесь мы использовали иодиксанол (Nycoprep), инертные модификатора плотности, который ранее использовался для жизнеспособного приложений клетки. Другие модификаторы плотности, такие как сахароза и глюкоза также может быть использован. Изменяя время установления (T S), можно точно настроить интерфейс между двумя слоями производить плавным или резким переходам по мере необходимости (больше времени установления дает плавные переходы) <SUP> 10. Например, плавные переходы между слоями геля DGMP может быть использован для создания непрерывного градиента биологических Кий для изучения клеточных процессов, таких как хемотаксис.
Эффект плотности модификатор геля жесткости показано на рисунке 5 для 15% aPEGda гель; более полную характеристику жесткости и пористости в зависимости от PEGda и иодиксанол концентрации в настоящее время оценивается. В то время как концентрация PEGda в этом примере является относительно высокой, мы наблюдали 60% больше упругости в гелях с 30% иодиксанол по сравнению с гелями без. Изменения в гель жесткость можно регулировать путем модуляции для концентрации макромера или плотность сшивки.
Мы также применили DGMP технику для создания 3D многослойный гель использованием полиакриламида и PEG прекурсоров 10. Варьируя концентрации или степень сшивания форполимера позволяет структурные изменения влеса, который может быть использован для изучения поведения клеток, таких как поляризованные рост и миграцию в 3D.
Таким образом, DGMP является адаптируемой метод, который можно применять для изготовления 2D и 3D леса из различных биосовместимых материалов для широкого спектра биомедицинских и основных исследовательских задач.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарны за поддержку новых наград NIH директора Новатор (1DP2 OD006499-01 А. А. и 1DP2 OD006460-01 в AJE) и короля Абдель Азиза науки и техники (UC San Diego Центра передового опыта в Наномедицина). Мы хотели бы поблагодарить г-жа Джессика Мур за ее критические замечания по рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 | |
| Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 | |
| Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 | |
| N,N- Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 | |
| N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 | |
| Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 | |
| Sigmacote | Sigma | SL2 | |
| Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 | |
| Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
|
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 | |
| Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| MALDI | Bruker | N/A | |
| UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 | |
| VersaDoc | Bio-Rad | N/A |
References
- Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
- Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
- Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
- Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
- Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels. Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).
- Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
- Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
- Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
- Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).
