Summary
Här beskriver vi en unik strategi för att skapa biokompatibla, skiktade matriser med kontinuerliga gränssnitt mellan olika skikt för tissue engineering. En sådan ställning kan ge en perfekt anpassningsbar miljö för att modulera cellbeteende av olika biologiska, kemiska eller mekaniska signaler
Abstract
Komplexa vävnadsodlingsplattor matriser, i vilka typer och koncentrationer av biologiska stimuli (t.ex. tillväxtfaktorer, inhibitorer, eller små molekyler) eller matris struktur (t.ex. komposition, koncentration, eller styvheten hos matrisen) varierar över rymden, skulle möjliggöra en rad undersökningar om hur dessa variabler påverkar celldifferentiering, migration och andra fenomen. Den stora utmaningen i att skapa skiktade matriser bibehåller den strukturella integriteten hos skiktet gränssnitt utan diffusion av enskilda komponenter från varje skikt 1. Aktuella metoder för att uppnå detta inkluderar photopatterning 2-3, litografi 4, sekventiell functionalization5, frystorkning 6, mikrofluidik 7, eller centrifugering 8, av vilka många kräver sofistikerade instrument och tekniska färdigheter. Andra förlitar sig på sekventiell fastsättning av enskilda skikt, vilket kan leda till delaminering av skikten 9
DGMP övervinner dessa frågor med hjälp av en inert densitet modifierare som jodixanol att skapa lager av varierande densitet 10. Eftersom densiteten modifieringsmedel kan blandas med prepolymeren eller bioaktiv molekyl, tillåter dGMP varje byggnadsställning skikt som skall anpassas. Helt enkelt variera koncentrationen av densiteten modifieringsmedlet förhindrar blandning av intilliggande skikt medan de förblir vattenhaltig. Efterföljande enda steg polymerisation ger upphov till en strukturellt kontinuerlig flerskiktad byggnadsställning, i vilken varje skikt har distinkt kemiska och mekaniska egenskaper. Densiteten modifieraren kan lätt tas bort med tillräckligt sköljning utan störning av de enskilda skikten eller deras komponenter. Denna teknik är därför väl lämpad för att skapa hydrogeler av olika storlekar, former och material.
Ett protokoll för framställning av en 2D-polyetylenglykol (PEG)-gel, i vilken alternerande skikt innefattar RGDS-350, beskrivs nedan. Vi använder PEG Because det är biokompatibelt och inert. RGDS, en celladhesion peptid 11, används för att demonstrera rumslig begränsning av en biologisk kö, och konjugering av en fluorofor (Alexa Fluor 350) ger oss möjlighet att visuellt särskilja olika skikt. Detta förfarande kan anpassas för andra material (t.ex. kollagen, hyaluronan, etc.) och kan förlängas för att tillverka 3D geler med vissa modifieringar 10.
Protocol
1. Syntes av fluorescensmärkt Acryloyl-PEG-RGDS
- Reagera den RGDS-peptiden med akryloyl-PEG-succinimidyl karboximetylester (aPEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) och NN diisopropyletylamin (DIPEA) vid 1.2:1:2 molförhållanden i dimetylsulfoxid (DMSO) under argon vid rumstemperatur natten.
- Bekräfta konjugering av matris-assisterad laser desorption / jonisering flygtid (MALDI-TOF) masspektrometri. Tillsätt 1 pl aPEG-RGDS reaktionslösningen till ett urval plats på MALDI målet och torr. Bered en mättad lösning av Universal MALDI Matrix i tetrahydrofuran (THF) och skaka i 1 minut. Lägg ~ 1 pl av denna lösning till samma prov plats. Upprepa proceduren för aPEG-SCM för jämförelse. Ladda och analysera. Molekylvikten för aPEG-RGDS skulle vara större än aPEG-SCM (figur 2).
- Att konjugera fluoroforen, tillsätt en ekvimolär mängd av Alexa Fluor 350 karboxylsyra (succinimydyl ester), upplösti en minimal volym av DMSO till aPEG-RGDS-reaktionslösningen från 1,1 och reagerar under argon vid rumstemperatur över natten.
- Rena aPEG-RGDS-350 genom att dialysera (MW 3500 Da) mot DI-H-2 O vid 4 ° C under 48 h vid 1000:1 volymförhållande, utbyte dialysat åtminstone två gånger per dag.
- Frys torka renade aPEG-RGDS-350 i en Labconco Freezone Plus eller motsvarande frysning torrt system och förvara vid -20 ° C.
2. Beredning av en 2D Mögel och tillverkning av ett 2D PEG Gel med omväxlande RGDS-350 Lager
- Förbered hydrofoba glasskivor. Placera rena glasskivor i en glasskål i en vakuumugn. Värm till 80 ° C under 30 minuter för att fullständigt torka ytorna. Placera skålen med bilder i ett dragskåp och tillsätt 250 ul Sigmacote till varje bild, försiktigt gunga under 30 sek för att belägga hela ytan. Skölj de belagda objektglasen med 100% metanol, följt av tvättning i destillerat vatten, blötläggning två gånger under 5 minuter i vid leasingt 10 ml.
- Skär silikon distanser (0,8 mm tjock) med 10 mm biopsi stansar.
- Autoklavera silikon distansorgan och Sigmacote-behandlade objektglas glas.
- Formulera lösningar för respektive skikt i individuella mikrofugrör genom blandning PEG-diakrylat (PEGda) prekursor (slutlig koncentration 15% vikt / volym) med olika mängder av jodixanol (60% stamlösning i vatten) för att ge varierande slutkoncentrationer (t.ex. 40%, 30%, 20% och 10%), som kompletterar den återstående volymen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att erhålla lösningar av graderade densiteter. På ett liknande sätt, för att alternerande skikt, att blanda aPEG-RGDS-350 (slutlig koncentration 8 mM) med jodixanol och PBS ger olika koncentrationer (t.ex. 35%, 25%, och 15%).
- Lägg fotoinitiator (2-hydroxi-4'-(2-hydroxietoxi)-2-metylpropiofenon, 333mg/ml lager i N-vinylpyrrolidon) till varje lösning för olika skikt (10 pl stamlösning per ml av varje skikt lösning). Fotoinitiator is tillsätts sist för att förhindra polymerisation före skiktning av gelerna i formen, eftersom den är känslig för ljus.
- Efterföljande steg i detta protokoll kommer att utföras i ett biosäkerhet skåp för att säkerställa sterilitet.
- Filter-sterilisera varje lösning med användning av en steril 1 ml spruta och 0,2 fim filter. Montera formen installationen genom sandwich distansen mellan två Sigmacore-behandlade objektglas och säkra med klämmor placering som visas i figur 1.
- Kasta de skiktade geler genom tillsats av tätaste lösningen (t.ex. PEGda med 40% jodixanol) först, följt av en mindre tät lösning (t.ex. aPEG-RGDS-350 med 35% jodixanol). Upprepa den alternativa skiktning för att åstadkomma flera skikt av önskad sammansättning och densiteter, såsom visas i figur 1.
- Bestråla formen med 365 nm ljus under 3 minuter med användning av en bärbar UVR-9000 lampa. Låt de polymeriserade gelerna att härda under 5 minuter. Ta bort klämmorna, lyft sedan försiktigt upp glasetrutschbana och formen, de skiktade dGMP gelerna kommer att finnas kvar på bilderna. Med hjälp av en steril spatel, försiktigt placera gelerna i ett 50 ml rör innehållande steril PBS eller odlingsmedium för tvättning.
- Tvätta de polymeriserade gelerna i PBS vid 1000:1 volymförhållande, byta ut bufferten minst två gånger per dag för att avlägsna densitet modifieringsmedlet, fotoinitiator, och oreagerad polymer. Alternativt, kan PBS utbytas med cellodlingsmedium. Lagra dGMP gelerna i PBS eller tillväxtmediet för cellodling experimentet beskrivs i steg 3.
- För att visualisera alternerande skikt, ordna dGMP gel (dessa geler kommer inte att användas för cellodling) längs en linjal på provet facket en VersaDoc gel dokumentation enhet. Exponera gelerna i 350 nm, exponeringstiden kommer att variera beroende på koncentrationen av fluoroforen. Alternerande mörka och blå band i dGMP hydrogelen visar bildning av diskreta skikt av distinkt kemisk sammansättning (figur 3).
- För geler innehåller RGDS-peptid, använd adhesionsberoende celler, såsom C2C12 myoblaster.
- Försiktigt in dGMP geler (lagrad i PBS) till brunnarna i 48-brunnars cellodlingsplattor användning av en steril cellskrapa i en biosäkerhet skåp.
- Pre-varm tillväxtmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium eller DMEM kompletterat med 10% volym / volym fetalt bovint serum och 1% volym / volym 100x penicillin-streptomycin-lösning) och PBS i en inställd vattenbad vid 37 ° C.
- Tvätta en 60% konfluent platta (10 mm) av C2C12-celler tre gånger med PBS. Aspirera av PBS och cellerna skörda genom att tillsätta 1 ml av 0,25% trypsin-EDTA och inkubering vid 37 ° C under 2 minuter. Återsuspendera cellerna i tillväxtmedium och celler räknas. Frö dGMP gel-innehållande cellkultur väl med C2C12 myoblaster (20.000 celler / cm 2). Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% COj 2/95% relativ fuktighet. Försiktigt utbyte medium efter 4 timmar, noga med att inte reflytta svagt vidhäftade celler.
- Efter 24 timmar, kan fastsättningen av C2C12 myoblaster på RGDS-innehållande skikt av dGMP geler bekräftas genom epifluorescens och faskontrast mikroskopi (Zeiss Axiovert 200).
Representative Results
MALDI-TOF-analysen bekräftar konjugeringen av RGDS peptid till akryloyl-PEG (Figur 2). Gel avbildning avslöjar alternerande RGDS-350 (blå) skikt efter fotopolymerisation (figur 3A). Såsom visas i figur 3A, kan 2D-gel dGMP storlek varieras baserat på diametern av silikon formarna (10 mm, vänster, 8 mm, höger), och därför är lätt anpassningsbara för användning i multipla analyser - i detta fall för att passa en 48 väl cell-odlingsplatta (figur 3B). Epifluorescens och faskontrast mikroskopi av C2C12 myoblaster odlade på en dGMP gel visar selektiv bindning på RGDS-350-innehållande PEG skikten (Figur 4), vilket visar uppdelning av celladhesion peptiden (RGDS).
Figur 1. Molekylär Weigsht analys genom MALDI-TOF jämföra aPEG-SCM till aPEG-RGDS erhållna efter konjugering av RGDS-peptid.
Figur 2. Schematisk representation av dGMP gel tillverkning. Efter gradienterna är skiktade, kan de få nöja varierande tidsperioder (t s) för att skapa graderade gränssnitt, följt av fotopolymerisation. Skiktade dGMP geler kan lätt ur formen för vidare användning. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. A) 2D flerskiktade geler som erhållits efter fotopolymerisation avbildas med 350 nm och vitt ljus kanaler för VersaDoc gel dokumentation enhet. Gråskalebilden avslöjar alternerande skikt innehåller RGDS i vitt. B) Införande av dGMP gel i 48-brunnar cellodling.
Figur 4. Sammanslagna faskontrast och epifluorescens bild av C2C12 myoblaster odlas på dGMP geler (skalstock 50 um).
Figur 5. Effekt av jodixanol på gelytan elasticitet. Atomkraftsmikroskopi mätningar av statiska prov av tvärbundna PEG substrat med tidigare etablerade metoder med 2 nN kraft trigger 12. * P <0,05 och ** p <0,01.
Discussion
DGMP är en enkel strategi för att förbereda flerskiktade geler som inte förlitar sig på dyra instrument. Detta protokoll kan anpassas för att skapa byggnadsställningar med andra biokompatibla material, såsom kollagen och hyaluronsyra. Bioaktiva små molekyler, t ex cell-vidhäftningsbefrämjande RGDS peptid, kan bundna till polymermatrisen för att förhindra blandning av signaler mellan skikten. Proteiner kan inkapslas i distinkta skikt utan behov av kemisk konjugering som de, beroende på matrisen maskstorlek, är mindre benägna att diffundera genom hydrogeler 10. Här har vi använt jodixanol (Nycoprep), en inert densitet modifieringsmedel, som tidigare har använts för viabla celler applikationer. Andra densitet modifieringsmedel såsom sackaros och dextros kan också användas. Genom att variera inställningstid (t s), kan en finjustera gränssnitten mellan två lager för att producera jämna eller skarpa övergångar som behövs (längre inställningstid ger mjukare övergångar) <sup> 10. Till exempel kan mjukare övergångar mellan dGMP gelskikt användas för att generera en kontinuerlig gradient av en biologisk kö för att studera cellprocesser såsom kemotaxi.
Effekten av densitet modifieringsmedel på gel styvhet visas i fig 5 för en 15% aPEGda gel, en mer fullständig karakterisering av styvhet och porositet såsom en funktion av PEGda och iodixanol koncentrationer närvarande utvärderas. Medan PEGda koncentrationen i detta exempel är relativt hög, observerade vi en 60% större elasticitetsmodul i geler med 30% jodixanol jämfört med geler utan. Förändringen i gel styvhet kan justeras för genom att modulera makromeren koncentrationen eller tvärbindningsdensitet.
Vi har också tillämpat dGMP teknik för att skapa 3D flerskiktade geler med polyakrylamid och prekursorer PEG 10. Variation av koncentrationen eller graden av tvärbindning av prepolymeren medger strukturell variation iställningar, som kan användas för att undersöka cell beteende såsom polariserade tillväxt och migration i 3D.
Sammanfattningsvis är dGMP en anpassningsbar teknik som kan tillämpas för att tillverka 2D-och 3D byggnadsställningar från olika biokompatibla material för ett brett spektrum av biomedicinska och grundforskning applikationer.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för stöd från NIH direktörens Nya Innovatör Awards (1DP2 OD006499-01 till AA och 1DP2 OD006460-01 till AJE) och King Abdulaziz City för vetenskap och teknik (UC San Diego Center of Excellence i nanomedicin). Vi vill tacka Ms Jessica Moore för hennes kritiska synpunkter på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 | |
| Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 | |
| Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 | |
| N,N- Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 | |
| N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 | |
| Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 | |
| Sigmacote | Sigma | SL2 | |
| Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 | |
| Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
|
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 | |
| Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| MALDI | Bruker | N/A | |
| UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 | |
| VersaDoc | Bio-Rad | N/A |
References
- Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
- Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
- Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
- Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
- Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels. Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).
- Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
- Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
- Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
- Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).
