Summary
全固态离子选择性电极（ASSISEs）的建造由导电聚合物（CP）传感器提供几个月的功能寿命在液体介质中。在这里，我们描述了在实验室上的一个芯片格式ASSISEs的制造和校准过程。证明ASSISE长时间储存后，在复杂的生物媒体一直保持着近能斯特斜率曲线。
Abstract
一个芯片上实验室（LOC）应用在环保，生物医药，农业，生物，航天科研需要的离子选择性电极（ISE），可以承受长时间储存在复杂的生物介质1-4。一种全固态离子选择性电极（ASSISE）是上述的应用特别有吸引力的。电极应具有以下良好的特性：施工方便，维护成本低，和（潜在的）的小型化，可以进行批量处理。甲微加工ASSISE的用于量化的Ca 2 +，H +，CO 3 2 -离子的构建。它由一个贵金属电极层（ 例如铂），转导层和一个离子选择膜（ISM）的层。的转导层的功能的转导的浓度依赖型的离子选择性膜的化学势成可测量的电信号。
Ť他一生的ASSISE被发现依赖于保持电位的导电性层/膜界面5-7。要延长工作寿命ASSISE，在界面层，从而保持稳定的潜力，我们利用银/氯化银（Ag / AgCl电极的导电聚合物（CP），聚（3,4 -亚乙基二氧噻吩）（PEDOT）7-9）作为振子层。我们构建了ASSISE在一个芯片上的实验室的格式，我们称之为多分析物的生物芯片（MAB）（ 图1）。
校准测试解决方案表明，人与生物圈计划可监测pH值（业务范围pH值4-9），CO 3 2 - （测量范围0.01毫米- 1毫米），和Ca 2 +（对数线性范围为0.01毫米至1毫米）。人与生物圈计划海藻介质，存储在近一个月后，pH值，提供了近能斯特斜率响应。的碳酸酯的生物芯片显示类似于常规的离子选择性电极的电位的配置文件。生理学一例出现的测量值来监视系统的模型，生物活性小球藻 。
人与生物圈计划传达尺寸，多功能的优势，复分析物的感应能力，使得它适用于许多密闭监控的情况下，地球上或空间。
生物芯片的设计与实验方法
生物芯片是10 x 11毫米的尺寸和有9 ASSISEs指定为工作电极（WES）和Ag / AgCl参考电极（RES）。每个工作电极（WE）的直径为240微米，平均间距为1.4毫米从RE的，直径为480微米的。这些电极连接到电接触垫的尺寸为0.5毫米×0.5毫米。的示意图如图2所示。
循环伏安法（CV）和恒电流沉积方法用于electropolymerize使用生物分析的PEDOT膜人系统公司（BASI）C3细胞支架（ 图3）。 PEDOT薄膜的反离子量身定制，以适应待测离子的利益。甲PEDOT与聚（苯乙烯磺酸）抗衡离子（PEDOT / PSS）是利用H +和CO 3 2 - ，，而硫酸钠（加入到该溶液中的CaSO 4）的是，利用的Ca 2 +。 PEDOT涂层的电化学性能，我们的分析中使用CVS氧化还原活性的解决方案（ 即 2毫米铁氰化钾（K 3的Fe（CN）6））。简历简介基于，兰德尔斯Sevcik分析被用来确定的有效表面积10。旋涂在1,500 rpm〜2微米厚的离子选择性膜（ISMS）的人与生物圈计划工作电极（WES）用于铸造。
人与生物圈被包含在一个微流体的流动池室充满了150微升体积的海藻介质接触垫电连接到的BASI系统（ 图如图4）。 小球藻光合活性的监测环境光线和黑暗条件下。
Protocol
1。聚（3,4 -乙撑二氧噻吩）：聚（4 -苯乙烯磺酸钠）（PEDOT：PSS）的电化学解的H +和CO 3 2 -离子的制备
- 加入70毫克聚（4 -苯乙烯磺酸钠）（Na +的PSS - ），直到完全分散（大约10秒）〜10毫升去离子（DI）水和涡。
- 10.7微升3,4-ethlyenedioxythiophene二氧噻吩（EDOT）加入到该溶液中，在1.1和旋涡，直到溶液完全混合。
2。制备聚（3,4 -乙撑二氧噻吩）：硫酸钙（PEDOT：的CaSO 4）的Ca 2 +离子的电化学解
- 添加136毫克的硫酸钙（ 硫酸钙）10毫升去离子水和旋涡;解决方案不会完全散去，并出现乳白色。
- 10.7微升EDOT 2.1和旋涡的解决方案，直到完全混合。
3。 PEDOT基于电化学导电聚合物
- 用于生物分析系统公司（BASI）C3细胞支架（ 图3）和EC小量电位/恒电流电化学形成电化学电池。将EDOT：PSS电聚合溶液的电化学电池中，氮气泡20分钟，以除去溶解的氧。
- 载入夹有铂的纱布在反电极的电化学电池的位置。然后夹在MAB面临的铂 - 纱布与工作电极在电化学电池在工作电极上的位置。调整人与生物圈深度这样只有被淹没的圆形电极PEDOT：PSS电化学的解决方案。避免溶液接触的平方的电接触垫。
- 放置一个BASI饱和银/氯化银（Ag / AgCl电极）电极与参比电极的电化学电池的位置。确保参比电极是不是在工作和逆流之间R电极。
- PEDOT：PSS沉积：泡泡电化学电池为20分钟，并使用EC小量电位/恒电流运行单个循环伏安从0V - 1.1V，扫描速率为20毫伏/秒在±100μA规模。
- 对于PEDOT： 硫酸钙沉积：泡20分钟的电化学电池中，并使用EC小量电位/恒电流运行在814 nA的30分钟计时。
4。循环伏安法在K的PEDOT基于高分子偶联3铁（CN）6
- 执行步骤3.1-3.3以上。
- 使用EC小量的电位/恒电流运行单一的循环伏安曲线与不同的扫描速率毫伏/秒（25，50，75，100，L25，150，175，200），在±10μA规模从-653 mV至853 mV的。
5。表面功能化协议
- 存款具体在步骤3中的离子导电聚合物共轭。
- 应用离子选择性膜，在步骤6中。
6。应用离子选择性膜
- 中心的人与生物圈计划在真空微调夹头。
- 存款100微升膜到人与生物圈计划和运行的中心。
- 离子选择性膜旋涂，旋涂机在1,500 rpm的转速下持续30秒，5秒斜坡向上和向下。
- 旋涂的人与生物圈真空30分钟，并在烘箱中于70℃下进行20分钟的烘烤芯片。
7。 PEDOT-PSS的共轭导电性高分子与pH和碳酸盐（CO 3 2 - ）离子选择性膜的校准
- 条件的人与生物圈计划在10微米小苏打（ 碳酸氢钠 ）和5毫米氯化钾（KCl）的藻类媒体过夜。
- 将人与生物圈计划到微流细胞芯片持有人。
- 注射5毫升试验溶液的初始pH值或浓度（ 例如，pH值为4或10μM，CO 3 2 - ）。删除小家伙从流动池的芯片座的劳动和就业统计局。
- 将芯片座到流动池的流动池的电夹具。
- EC小量软件打开并进入开路电位（OP）模式。将时间设定为300分钟，电压范围为±1V，和截止频率为10 kHz，并记录该值每2秒。
- 让稳定的人与生物圈计划，（看平线），然后继续与校准过程。
- 一旦，在MAB是稳定的，与试品溶液冲洗流动池，以进行校准，并注入下一个浓度（pH为5或25μMCO 3 2 - ）。确保无气泡被允许进入流通池。重复步骤7.5和7.6，在pH为6，7，8，和9或CO 3 2 -浓度为50，75，100，250，500，750，和1000μM。
- 最后的浓度已运行后，删除的人与生物圈计划和干用氮气空气。
- 将新鲜的空调解决方案，直到下次使用的人与生物圈计划放回。
硫酸钙氯化钙导电聚合物共轭
- 条件的人与生物圈计划在7毫升0.1 M的氯化钙和10μM纳米3过夜。
- 遵循类似步骤7.2 - 7.10。在步骤8.3中，将与初始浓度为0.01 mM的CaCl 2的碳酸试液。重复测试溶液的浓度为0.05，0.1，0.5，1和10毫米。
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Representative Results
的循环伏安图（CV）的PEDOT：PSS和其对应的还原峰电流（I P）与扫描速度（V 1/2）的一个例子示于图5a和5b分别。 PEDOT： 硫酸钙在不同的扫描率和它的还原峰电流将不会显示。使用兰德尔斯-Sevcik分析如图10所示，有效的表面区域的固体接触的PEDOT：PSS和PEDOT：离子选择性膜的CaSO 4没有被发现，分别为4.4×10 -11厘米2和5.8×10 -11厘米2。这些值都比较小，在比较先前报道的电极由于电极尺寸小于电极的大小报道从我们的研究组11〜130倍。需要注意的是人与生物圈电极的有效表面积可以提高通过表面改性，纳米材料11。
“基于离子选择性电极的PEDOT：PSS聚合物共轭物在pH范围从4到9藻介质中经过20天的储存藻媒体>校准结果示于图6。的斜率配置文件中的变化可能是由于复杂的生物介质（ATCC介质：1.0ł布里斯托尔的解决方案和1.0ĝ蛋白酶蛋白胨（BD诊断系统，火花，MD，USA），具有防污和能够影响测量的干扰盐化合物。工作的目的是测试的ASSISE能力获得测量实际的细胞培养环境。我们现在处理的校准结果的PEDOT：PSS在碳酸盐（CO 3 2 - ）溶液，其浓度为0.01 mM的范围内以1 mM的藻类生物培养基和藻类生物介质中，在pH = 8.5缓冲（ 图7）在两个。测量是在pH为7.8。插图显示浓度的变化，降低的斜率与缓冲的解决方案。结果表明，碳酸酯选择性电极的pH值的依赖。如果考虑碳酸不同物种中的溶解的形式存在，这些结果是有意义的，特别是H 2 CO 3（碳酸），HCO 3 - （碳酸氢盐）和CO 3 2 - （碳酸酯）。碳酸的碳酸氢盐的形式PK A1值是6.4，而碳酸氢盐碳酸盐PK A2值是10.4。当pH值大于的pKa值，品种在其去质子化的形式，而当pH值低于pKa值，物种在其质子化形式。由于测量是在pH为7.8，大多数物种中的碳酸氢盐的形式。电压的增量与增量中的碳酸盐物种。由于碳酸盐浓度的pH值的依赖，必须考虑生物介质中进行测量时，这种依赖。测量使用人与生物圈计划与PEDOT：PSS为基础图8中所示的ISE中加入150μl的藻在pH为7.8的培养基中微藻小球藻 。我们注意到30 mV变化，与十年变化碳酸盐浓度在光明与黑暗的交替条件。这些结果可以解释为，考虑微藻在光合作用过程中的生理活性。在黑暗的条件下藻类保持休眠状态，没有发生光合活性。这可以看出，图中的mV读数保持不变，接近初始基线读数。一旦藻类暴露于光，他们正在积极进行光合作用，因此减少，HCO 3 -和CO 3 2层观察到预期。的mV读数，这应该对应的电压增加，因为水平的HCO 3 -和CO 3 2水平下降。校准结果PEDOT：硫酸钙4的CaCl 2溶液的浓度范围从0.01毫米至1毫米， 如图9中所示。 PEDOT：的CaSO 4用于三维电极图案用于测量从蕨孢子蕨richardii的的钙水平的格式，这里没有提出这些结果。结果表明：30 mV每十年中Ca 2 +浓度的变化，几乎能斯特斜率的档案。校准结果将被用来测量在蕨类孢子萌发的钙电流水平。这些结果这里就不介绍了。
对于所有的测量，测量线性范围定制，以适应应用程序所需的范围内。
图1。多分析物的生物芯片 ，生物芯片（MAB）。由多个工作电极和参考电极。
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图2。人与生物圈计划设计原理，人与生物圈计划是一个10×11毫米的生物芯片，其中包括电极（ 直径 = 240微米）拟ISE工作电极（WES）和5点（ 直径 480微米）电极为参比电极（RES打算）。由三个电极组成的两组共用参比电极（RE），而剩下的3有他们自己的可再生能源。用于电位测量三个WES共享资源套，其余的则用于电流测量。 Wes和其相应的RE等距间隔在1.4毫米。铂接触垫（0.5×0.5毫米），在生物芯片的一端连接到这些电极。
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图3。 BASI细胞支架的三电极电位/恒电流系统。BASI被电连接到微流体的流动池室和记录电压测量的实时。
图4。微流体的流动池室的注射器推测量流体在生物芯片上的微流体腔室的入口和出口的连接。
图5。 （一）在各种扫描速率循环伏安曲线及（b）相应的阴极巅峰对决的扫描速率兰德尔斯Sevcik电极的有效表面积分析。在兰德尔斯Sevcik分析，被计算为4.4×10 -11厘米2和5.8×10 -11厘米2 PEDOT：PSS和PEDOT： 硫酸钙， 点击这里查看更大的数字 。
图6。人与生物圈计划的校准轮廓ISES基于PEDOT：PSS在溶液中的pH值增加为4种不同的测量进行了28天的过程相同的生物芯片，结果显示误差较大范围波动产生的H +离子在pH 4检测下限。
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图7。人与生物圈计划ISES校准轮廓的基础上PEDOT：PSS CaCO 3的溶液浓度的增加，CO 3 2 -既海藻介质和缓冲海藻介质，在pH值为8.5，结果表明，pH值对CO 3 2 -感应由于在不同的离解常数（pKa值）的值可用的一些碳酸盐物种- H 2 CO 3（碳酸），HCO 3 - （碳酸氢盐）和CO 3 2 - （碳酸酯）。由于单克隆抗体是在天然样品进行测量，校准是由与缓冲藻媒体，示出在CO 3 2 -的浓度斜率为-30 mV每十倍频程的变化。
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图8。 CO 3 2 -浓度测定用生物模型小球藻在环境光线下和黑暗的条件下，示出了30 mV变化。这〜30 mV变化十年变化，CO 3 2 -的浓度相关联。与只有藻媒体的显示没有任何反应，指示功能生物芯片的控制。
图9所示。人与生物圈计划的校准轮廓ISES基于PEDOT：PSS在氯化钙溶液浓度的增加，结果表明近二价阳离子以30 mV每十年Ca 2 +浓度的变化能斯特斜率曲线。
表1中。离子选择性膜的化学组成。所有的膜组合物溶解在溶剂（环己酮）中，在10％重量/体积。对于所有的膜组合物中，加入4.3毫克四氯化硅（Sigma Aldrich公司，产品目录号：215120），100毫克的干组分。
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Discussion
MAB生物芯片由的ASSISEs顶上基于PEDOT-CP的共轭转导层上的Pt电极的组合，其中一个可测量的电信号传导的离子浓度还从ISM构造。甲稳定的电极电位是指由CP层和ISM层。这两个层也决定MAB和质量的测量的电信号（噪声，漂移）的工作寿命。
PEDOT作为传导层由于其离子和电子的属性（在它的氧化形式）是特别有吸引力的。 PEDOT具有高氧化还原电容的能力，以尽量减少导电电极极化效应，我们已经在153毫伏±6比Ag / AgCl电极测量其稳定的氧化还原电位。此特性是必要的ISE，它使用了坚实的内部接点12的电势稳定性。 PEDOT：PSS CP共轭SMA的换能器用作会的一价阳离子（ 例如 H +）和二价阴离子（CO 3 2 - ）。碳酸盐选择性电极的非线性斜坡的档案是由于其对pH的依赖性。对于微藻测量，同时测量，必须为H +和CO 3 2 -离子。为CO 3 2 -的测量的结果是类似的常规电极13和类似的平面电极，14的尺寸要大得多。因此，在这里报告的电极几何形状不改变电位的特性。此外，当该溶液在pH = 8.5缓冲，斜率为10年变化的档案中的CO 3 2 -的浓度降低为-30〜-17毫伏。这可以解释的H 2 CO 3，HCO 3 - ，CO 3 2 - ，和溶解的CO 2，在水溶液中共存的事实，这equilibriu米取决于pH值。需要更多的研究来探索这方面的碳酸根离子的结果。对于二价阳离子的测量中，我们用的PSS的抗衡离子的CaSO 4的盐，在PEDOT：聚合物缀合物的CaSO 4。我们相信，过量的二价的Ca 2 +阳离子防止结合测得的Ca 2 +从样品溶液从溶解的聚合物共轭内的CaSO 4。
电化学方法（循环伏安法和恒流）定制的的PEDOT基于聚合物共轭的物理和电化学性能。这些电化学方法沉积为快速建设ASSISEs有用。离子传感器中的应用并不限于ASSISEs CP的结合物，可与生物分子和官能化的MAB可以作为生物传感器的作用。人与生物圈计划是由于长期的功能表现与H +离子与离子选择性电极的工作寿命，适合初学者学习表的应用，需要在一个复杂的生物液体介质环境长期监测。因此，它有可能是有用的在被检体内的生物医学研究和长期监测在药物筛选中的离子。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们想感谢美国宇航局天体生物学科学和技术仪器发展（ASTID）计划的资金支持（授权号码103498和103692），大风洛克伍德的大学Birck Nantechnology的中心在美国普渡大学人与生物圈设备的引线键合，和亨俊园CAD图纸的流动池室。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,4-Ethylenedioxythiophene | Sigma-Aldrich | 483028 | |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate) | Sigma-Aldrich | 243051 | |
| EC epsilon galvanostat/potentiostat | Bioanalytical Systems Inc. | e2P | |
| Saturated Ag/AgCl reference electrode | Bioanalytical Systems Inc. | MF-2052 | |
| Pt gauze | Alfa Aesar | 10283 | |
| Potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
| Potassium nitrate | J.T. Baker | 3190-01 | |
| Sodium bicarbonate | Mallinckrodt/ Macron | 7412-12 | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S-7127 | |
| Calcium chloride | J.T. Baker | 1311-01 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Calcium sulphate | Sigma-Aldrich | 237132 | |
| C3 cell stand | Bioanalytical Systems Inc. | EF-1085 | |
| Flow-cell chip holder | Custom, courtesy of NASA Ames | ||
| Flow-cell electrical fixture | Custom, courtesy of NASA Ames | ||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Migdalski, J., Bas, B., Blaz, T., Golimowski, J., Lewenstam, A. A Miniaturized and Integrated Galvanic Cell for the Potentiometric Measurement of Ions in Biological Liquids. J. Solid State Electrochem. 13, 149-155 (2009).
- Designing a Water-quality Monitor with Ion-selective-electrodes. Buehler, M. G., Kounaves, S. P., Martin, D. P. Proceedings of the IEEE Aerospace Conference, 1, 331-338 (2001).
- Adamchuk, V. I., Lund, E. D., Sethuramasamyraja, B., Morgan, M. T., Doberman, A., Marx, D. B. Direct Measurement of Soil Chemical Properties on-the-go using Ion-selective-electrodes. Journal Computers and Electronics in Agriculture. 48 (3), 272-294 (2005).
- Oelβner, W., Hermann, S., Kaden, H. Electrochemical Sensors and Sensor Module for Studying Biological Systems in Space Vehicles. Aerospace Science and Technology. 1, 291-296 (1997).
- Bobacka, J. Conducting Polymer-based Solid-state Ion-selective Electrodes. Electroanalysis. 18 (1), 7-18 (2006).
- Buck, R. Ion Selective Electrodes in Analytical Chemistry. , Plenum Press. New York. (1980).
- Nam, H., Cha, G. S. Chapter 18. Biosensors and their Applications. Yang, V. C., Ngo, T. T. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. N.Y. (2000).
- Anatova-Ivanova, S., Mattinen, U., Radu, A., Bobacka, J., Lewenstem, A., Migdalski, J., Danielewski, M., Diamond, D. Development of Miniature All-solid-state Potentiometric Sensing System. Sensors and Actuators B. 146, 199-205 (2010).
- Michalska, A., Galuszkiewicz, A., Ogonowska, M., Ocypa, M., Maksymiuk, K. PEDOT Films: Multifunctional Membranes for Electrochemical Ion sensing. J. Solid State Electrochem. 8, 381-389 (2004).
- Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. ed, 2nd , 2nd ed, Wiley. New York. (2000).
- Claussen, J. C., Artiles, M. S., McLamore, E. S., Mohanty, S., Shi, J., Rickus, J., Fisher, T. S., Porterfield, D. M. Electrochemical Glutamate Biosensing with Naanocube and Nanosphere Augmented Single-walled Carbon Nanotube Networks: A Comparative Study. J. Mater. Chem. 21, 11224-11231 (2011).
- Bobacka, J. Potential Stability of All-solid-state Ion-selective Electrodes using Conducting Polymers as Ion-to-electron Transducers. Anal. Chem. 71, 4932-4937 (1999).
- Lee, J. H., Yoon, I. J., Yoo, C. L., Pyun, H. J., Cha, G. S., Nam, H. Potentiometric Evaluation of Solvent Polymeric Carbonate-selective Membranes based on Molecular Tweezer-type Neutral Carriers. Anal. Chem. 72, 4694-4699 (2000).
- Song, F., Ha, J., Park, B., Kwak, T. H., Kim, I. T., Nam, H., Cha, G. S. All-solid-state Carbonate Selective Electrode based on a Molecular Tweezer-type Neutral Carrier with Solvent-soluble Conducting Polymer Solid Contact. Talanta. 57, 263-270 (2002).
