Summary
Elettrodi ione-selettivi All-a stato solido (Assise) costruiti da un polimero conduttivo trasduttore (CP) forniscono diversi mesi di vita funzionale in mezzi liquidi. Qui, descriviamo il processo di fabbricazione e la taratura di Assise in un formato lab-on-a-chip. L'ASSISE è dimostrato di aver mantenuto un profilo pendio vicino-Nernst dopo stoccaggio prolungato in mezzi biologici complessi.
Abstract
Lab-on-a-chip applicazioni (LOC) in, ricerca ambientale, biomedico, agricolo biologico, e il volo spaziale richiedono un elettrodo ione-selettivo (ISE), in grado di sopportare lo stoccaggio prolungato in complessi mezzi biologici 1-4. Uno ione-selettivo-elettrodo all-solid-state (ASSISE) è particolarmente attraente per le suddette applicazioni. L'elettrodo deve avere le seguenti caratteristiche favorevole: facilità di costruzione, manutenzione bassa, e (potenziale) di miniaturizzazione, consentendo l'elaborazione in batch. Un ASSISE microfabricated inteso per quantificare H +, Ca 2 +, e CO 3 2 - ioni è stato costruito. È costituita da uno strato di metallo nobile-elettrodo (cioè Pt), uno strato di trasduzione, ed una membrana ione-selettivo (ISM) strato. Le funzioni di strato di trasduzione di trasdurre la concentrazione-dipendente potenziale chimico della membrana ione-selettivo in un segnale elettrico misurabile.
Tegli durata di un ASSISE è trovato a dipendere mantenendo il potenziale al livello / interfaccia membrana conduttiva 5-7. Per prolungare la vita utile di esercizio ASSISE e quindi mantenere i potenziali stabili presso gli strati interfacciali, abbiamo utilizzato il polimero conduttivo (CP) poli (3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) 7-9 al posto di argento / cloruro di argento (Ag / AgCl) come strato trasduttore. Abbiamo costruito la ASSISE in un formato lab-on-a-chip, che abbiamo chiamato il biochip multi-analita (MAB) (Figura 1).
Calibrazioni nelle soluzioni di prova hanno dimostrato che il MAB può monitorare il pH (pH operativa 4-9), CO 3 2 - (misurata gamma 0,01 mm - 1 mm), e Ca 2 + (range log-lineare 0,01 mm a 1 mm). Il MAB di pH fornisce una risposta pendio vicino-Nernst dopo quasi un mese di stoccaggio nel terreno di coltura algale. Biochip carbonato mostrano un profilo potenziometrico simile a quello di un elettrodo ione-selettivo convenzionale. Physiolmisurazioni ogical stati impiegati per monitorare l'attività biologica del sistema modello, la microalga Chlorella vulgaris.
Il MAB veicola un vantaggio in termini di dimensioni, versatilità, e multiplex analita capacità di rilevamento, che lo rende applicabile a molte situazioni di monitoraggio ristretti, sulla Terra o nello spazio.
Biochip Disegno e Metodi Sperimentali
Il biochip è di 10 x 11 mm di dimensioni e dispone di 9 Assise designati come elettrodo di lavoro (WE) e 5 elettrodi di riferimento Ag / AgCl (RES). Ogni elettrodo di lavoro (WE) è di 240 micron di diametro ed è equamente distanziati a 1,4 mm dal RE, che sono 480 micron di diametro. Questi elettrodi sono collegati a rilievi del contatto elettrico con una dimensione di 0,5 mm x 0,5 mm. Lo schema è mostrato in Figura 2.
Voltammetria ciclica (CV) e metodi di deposizione galvanostatici sono usati per i film electropolymerize Pedot utilizzando un BioanalyticAl Systems Inc. (BASI) supporto cella C3 (Figura 3). Il contro-ione del film PEDOT è adatta a soddisfare lo ione analita di interesse. Un PEDOT con poli (styrenesulfonate) contro ione (PEDOT / PSS) è utilizzata per H + e CO 3 2 -, mentre uno con solfato (aggiunto alla soluzione come CaSO 4) vengono usate per Ca 2 +. Le proprietà elettrochimiche della PEDOT rivestita WE è analizzato tramite i CV in soluzione redox-attivo (cioè 2 mM potassio ferricianuro (K 3 Fe (CN) 6)). Sulla base del profilo CV, analisi Randles-Sevcik stato utilizzato per determinare l'area superficiale effettiva 10. Spin-coating a 1.500 giri viene utilizzato per lanciare ~ 2 micron di spessore membrane iono-selettivi (ISMS) sugli elettrodi di lavoro MAB (WE).
Il MAB è contenuto in una camera di flusso microfluidica-cella riempita con un volume di 150 ml di terreno di coltura algale; le trecce sono collegati elettricamente al sistema BASI (Figure 4). L'attività fotosintetica di Chlorella vulgaris è monitorato in luce ambiente e al buio.
Protocol
1. Preparazione di Poli (3,4-ethylenedioxythiophene): Poli (sodio 4-styrenesulfonate) (PEDOT: PSS) elettropolimerizzazione Soluzione per H + e CO 3 2 - Ioni
- Aggiungere 70 mg di poli (sodio 4-styrenesulfonate) (Na + PSS -) a 10 ml deionizzata (DI) e vortex fino a completa dispersione (circa 10 sec).
- Aggiungere 10,7 microlitri 3,4-ethlyenedioxythiophene (EDOT) alla soluzione in 1.1 e vortice finché la soluzione è completamente miscelato.
2. Preparazione di Poli (3,4-ethylenedioxythiophene): solfato di calcio (PEDOT: CaSO 4) elettropolimerizzazione Soluzione per Ca 2 + ioni
- Aggiungere 136 mg di solfato di calcio (CaSO4) a 10 ml di acqua deionizzata e vortice, la soluzione non sarà completamente disperdere e un aspetto lattiginoso.
- Aggiungere 10,7 ml EDOT alla soluzione in 2.1 e vortex fino a quando completamente mescolato.
3. Elettropolimerizzazione di PEDOT-basedPolimerici
- Un Bioanalytical Systems Inc. (BASI) Cavalletto cella C3 (figura 3) e un epsilon CE potenziostato / galvanostato sono usati per formare la cella elettrochimica per elettropolimerizzazione. Collocare il EDOT: soluzione elettropolimerizzazione PSS nella cella elettrochimica e la bolla di azoto per 20 minuti per rimuovere l'ossigeno disciolto.
- Ora ritagliare una garza platino nella posizione contro elettrodo della cella elettrochimica. Agganciare il MAB nella posizione dell'elettrodo di lavoro della cella elettrochimica con gli elettrodi di lavoro che affrontano il platino garza. Regolare la profondità MAB in modo che solo gli elettrodi circolari sono sommersi nel PEDOT: soluzione elettropolimerizzazione PSS. Evitare il contatto con la soluzione gli elettrodi di contatto elettrico quadrati.
- Posizionare un saturo argento / cloruro di argento BASI (Ag / AgCl) elettrodo nella posizione dell'elettrodo di riferimento della cella elettrochimica. Assicurarsi che l'elettrodo di riferimento non è tra il lavoro e counter elettrodi.
- Per PEDOT: deposizione PSS: Bolla della cella elettrochimica per 20 minuti, e utilizzare la CE epsilon potenziostato / galvanostato per eseguire un singolo voltammogramma ciclico da 0 V - 1,1 V, con una velocità di scansione di 20 mV / sec su una scala di ± 100 μA.
- Per PEDOT: CaSO 4 deposizione: Bolla della cella elettrochimica per 20 minuti, e utilizzare la CE epsilon potenziostato / galvanostato correre cronopotenziometria a 814 nA per 30 min.
4. Voltammetria ciclica di coniugati polimero PEDOT a base di K 3 Fe (CN) 6
- Eseguire i passaggi 3,1-3,3 sopra.
- Utilizzare la CE epsilon potenziostato / galvanostato correre voltammograms ciclici singoli da -653 mV a 853 mV con diverse frequenze di scansione di (25, 50, 75, 100, l25, 150, 175, 200) mV / sec su una scala di ± 10 μA .
5. Funzionalizzazione superficiale protocollo
- Cassetta di polimero conduttivo coniugato specifico per gli ioni di interesse come al punto 3.
- Applicare membrana ione-selettivi, come nel passaggio 6.
6. Applicazione della membrana ionoselettivo
- Centrare il MAB sul vuoto filatore mandrino.
- Cauzione 100 membrana microlitri sul centro del MAB e corsa.
- Spin-coat membrana ione-selettivo con una induzione di rotazione a 1500 rpm per 30 sec con una rampa di 5 secondi su e giù.
- Aspirare il MAB spin-rivestito per 30 minuti e cuocere il chip in un forno a 70 ° C per 20 min.
7. Taratura di PEDOT-PSS Polimerici Coniugato con pH e carbonato (CO 3 2 -) Membrana ionoselettivo
- Condizione del MAB durante la notte in 10 mM di bicarbonato di sodio (NaHCO3) e 5 mM di cloruro di potassio (KCl) in supporti algali.
- Inserire il MAB nel supporto chip microfluidica cella a flusso.
- Iniettare 5 ml di soluzione di prova con il valore iniziale del pH o concentrazione (ad esempio, pH 4 o 10 micron per CO 3 2 -). Rimuovere bubBles dal titolare chip di cella a flusso.
- Posizionare il supporto di chip flusso delle cellule sul dispositivo elettrico cella a flusso.
- Aprire il software CE epsilon ed entrare in modalità potenziale di riposo (OP). Impostare il tempo di 300 min, la scala di tensione di ± 1V, e la frequenza di taglio a 10 kHz, e registrare il valore ogni 2 secondi.
- Lasciate che il MAB stabilizzi (cercare una linea piatta) prima di continuare con il processo di calibrazione.
- Una volta che il MAB è stabilizzato, sciacquare la cella di flusso con la soluzione di prova e iniettare la prossima concentrazione da calibrare (pH 5 o 25 mM CO 3 2 -). Assicurarsi che non bolle sono autorizzati a entrare nella cella di flusso. Ripetere i passi 7.5 e 7.6 per pH 6, 7, 8, e 9 o CO 3 2 - concentrazioni di 50, 75, 100, 250, 500, 750 e 1.000 micron.
- Dopo l'ultima concentrazione ha eseguito, togliere il MAB e asciugare con aria azoto.
- Riposizionare il MAB in soluzione di condizionamento fresco fino all'utilizzo successivo.
4 Polimerici Coniugato in CaCl 2
- Condizione del MAB durante la notte in 7 ml di 0,1 M CaCl 2 e 10 micron nano 3.
- Seguire i passaggi simili a 7,2-7,10. Nel passo 8.3, sostituire soluzione di prova carbonato con una concentrazione iniziale di 0,01 mM CaCl 2. Ripetere l'operazione per le concentrazioni di test-soluzione di 0,05, 0,1, 0,5, 1 e 10 mm.
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Representative Results
Un esempio di un voltammogramma (CV) risultato ciclica di PEDOT: PSS e la corrispondente corrente di picco catodica (i p) vs la frequenza di scansione (v 1/2) sono mostrati nelle Figure 5a e 5b, rispettivamente. PEDOT: CaSO 4 a varie frequenze di scansione e il suo picco di corrente catodica non sono mostrate. Utilizzando Randles Sevcik-analisi 10, le aree superficiali effettive del contatto solido PEDOT PSS e PEDOT: CaSO 4 senza membrana ione-selettivi sono risultati essere 4,4 x 10 -11 cm 2 e 5,8 x 10 -11 cm 2, rispettivamente. Questi valori sono relativamente piccole in confronto alle precedenti elettrodi segnalati però, le dimensioni dell'elettrodo essendo ~ 130 volte più piccolo delle dimensioni dell'elettrodo segnalato dal nostro gruppo di ricerca 11. Notare che l'elettrodo di superficie effettiva MAB potrebbe essere rafforzata modificando la superficie con nanomateriali 11.
t "risultati> calibrazione per ISE basato su PEDOT: PSS polimero si coniuga in mezzi algali con pH compreso fra 4 e 9 dopo 20 giorni di stoccaggio a medio algale sono mostrati in Figura 6 La variazione nel profilo pendio potrebbe essere dovuto al complesso. mezzo biologico (ATCC media:. soluzione di 1.0 L Bristol e 1,0 g proteasi Peptone (Diagnostic System BD, Sparks, MD, USA), che ha composti incrostanti e sali di disturbo che possono influenzare le misurazioni Lo scopo del lavoro è quello di testare la capacità ASSISE acquisire misurazioni in ambiente reale coltura cellulare.Passiamo ora ai risultati di calibrazione per PEDOT: PSS in carbonato (CO 3 2 -) soluzione con un intervallo di concentrazione di 0,01 mm a 1 mm in entrambe mezzo biologico delle alghe e mezzo biologico algale tamponata a pH 8.5 (Figura 7). Le misurazioni vengono effettuate a pH 7.8. L'inserto mostra la variazione di concentrazione, con un abbassamento della pendenza con il tamponatasoluzione. I risultati mostrano la dipendenza dal pH dell'elettrodo carbonato-selettivo. Questi risultati sono significativi se si considera l'esistenza di diverse specie di carbonato in forma disciolta; specificamente H 2 CO 3 (acido carbonico), HCO 3 - (bicarbonato) e CO 3 2 - (carbonato). Il valore di pK a1 per l'acido carbonico a forma di bicarbonato è di 6,4, mentre il valore di A2 pK da bicarbonato di carbonato è di 10,4. Quando il pH è superiore al pKa, la specie è nella sua forma deprotonato, mentre quando il pH è inferiore al pKa, la specie è nella sua forma protonata. Poiché le misurazioni vengono effettuate a pH 7,8, la maggior parte delle specie sono in forma bicarbonato. L'incremento della tensione correlato all'incremento nella specie carbonato. A causa della dipendenza dal pH della concentrazione carbonato, si deve considerare questa dipendenza quando effettuano misurazioni in mezzi biologici. Misurazioni con il MAB con un PEDOT: PSS-basedISE in 150 microlitri contenente terreno di coltura algale microalghe Chlorella vulgaris a pH 7.8 sono mostrati in Figura 8. Si nota un cambiamento di 30 mV che è correlato a un cambiamento nella concentrazione di carbonato di dieci anni in condizioni di alternanza di luce e buio. Questi risultati possono essere spiegati considerando l'attività fisiologica di microalghe durante la fotosintesi. In condizioni di oscurità le alghe rimanere in uno stato di dormienza cui si verifica alcuna attività fotosintetica. Questo può essere visto nel grafico in cui la lettura mV rimane costante e vicino alla lettura iniziale basale. Una volta che le alghe sono esposti alla luce, sono attivamente in fase di fotosintesi, di conseguenza una diminuzione del HCO 3 - e 2 livelli di CO 3 si osserva come previsto. In termini di una lettura mV questo dovrebbe corrispondere ad un aumento di tensione in quanto i livelli di HCO 3 - e CO 3 2 livelli sono diminuiti. Risultati di calibrazione per PEDOT: Caso 4 inSoluzione di CaCl 2 a concentrazioni variabili tra 0,01 mM a 1 mM sono mostrati in Figura 9. Il PEDOT: CaSO 4 viene utilizzato per un modello formato elettrodo 3D per misurare i livelli di calcio dalla felce spore Ceratopteris richardii, questi risultati non sono qui presentati. I risultati mostrano un profilo di pendenza quasi Nernst per 30 mV per il cambiamento decennio a Ca 2 + concentrazione. Il risultato di calibrazione viene utilizzato per misurare gli attuali livelli di calcio nel germinazione delle spore di felce. Questi risultati non sono presentati qui.
Per tutte le misurazioni, il campo lineare di misura, pensata appositamente per l'intervallo richiesto per l'applicazione.
Figura 1. Multi-analita biochip (MAB). L'biochip consiste di lavorazione multipla e elettrodi di riferimento.
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Figura 2. MAB disegno schematico. L'MAB è un x 11 mm biochip 10 che consiste di 9 pt elettrodi (Ø = 240 micron), intesi come elettrodi ISE di lavoro (WE), e 5 Pt (Ø = 480 micron) elettrodi destinati come elettrodi di riferimento (res ). Due insiemi costituiti da tre elettrodi condividere un elettrodo di riferimento (RE), mentre i restanti 3 hanno il proprio RE. I gruppi di tre WE con REs condivisi sono destinati alla misura potenziometrica, mentre il resto sono destinati alla misura amperometrica. Il Wes e le sue corrispondenti ER sono equidistanti a 1,4 mm. Questi elettrodi sono collegati a contatto Pt pad (0.5 x 0.5 mm) situato ad una estremità del biochip.
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Figura 3. Basamento BASI cella a tre elettrodi potenziostato / galvanostato sistema. L'BASI è collegato elettricamente alla camera di cella a flusso microfluidica e registra misure di tensione in tempo reale.
Figura 4. Microfluidica camera di flusso-cellula. Una siringa è collegata sia all'ingresso e all'uscita della camera microfluidica per spingere il fluido di misura sul biochip.
Figura 5. (A) profili di voltammetria ciclica a varie frequenze di scansione e (b) il picco corrispondente catodica contro la frequenza di scansione per Randles-Sevcik . analisi basata su analisi Randles-Sevcik, le effettive aree di superficie degli elettrodi sono stati calcolati per essere 4.4 x 10 -11 cm 2 e 5,8 x 10 -11 cm 2 per PEDOT: PSS e PEDOT:. Caso 4 rispettivamente Clicca qui per vedere grande figura .
Figura 6. Profilo di calibrazione per MAB ises basa su PEDOT:. PSS in soluzione con l'aumentare del pH per 4 diverse misurazioni effettuate con la stessa biochip nel corso di 28 giorni I risultati mostrano un intervallo di errore più grande a pH 4 a causa della fluttuazione di ioni H + a limite di sensibilità inferiore.
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Figura 7. Profilo di calibrazione per MAB ISES basa su PEDOT: PSS in CaCO3 soluzione con l'aumentare della concentrazione di CO 3 2 - sia in terreno di coltura algale e tamponato medie algale a pH 8.5 I risultati mostrano l'effetto del pH sulla CO 3 2 - rilevamento a causa della. disponibilità di diverse specie di carbonato a valori costanti di dissociazione (pKa differenti) - H 2 CO 3 (acido carbonico), HCO 3 - (bicarbonato) e CO 3 2 - (carbonato). Dal MAB sono per eseguire misure in campioni naturali, taratura sono realizzati con supporti di alghe senza buffer, che mostra una pendenza di -30 mV a cambio decade di CO 3 2 - concentrazione.
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Figura 8. CO 3 2 -. Misura della concentrazione con il modello biologico Chlorella vulgaris in luce ambiente e condizioni di oscurità che mostrano un cambiamento di 30 mV 30 mV ~ Questo cambiamento è correlato ad un cambiamento nel decennio CO 3 2 - concentrazione. Un controllo con solo supporti algali mostra alcuna risposta, indicativo di un biochip funzionale.
Figura 9. Profilo di calibrazione per MAB ISES basa su PEDOT:. PSS in soluzione di CaCl 2 con l'aumentare della concentrazione I risultati mostrano un profilo di pendio vicino-Nernst per catione bivalente a 30 mV per il cambiamento decennio a Ca 2 + concentrazione.
Tabella 1. Ione-selettivo membrana composizione chimica. Tutte le composizioni di membrana sono sciolti in solvente (cicloesanone) al 10% in peso / volume. Per tutte le composizioni di membrana, 4,3 mg di tetracloruro di silicio (Sigma Aldrich, numero di catalogo: 215120) è stato aggiunto per 100 mg di componenti secchi.
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Discussion
Il MAB biochip consiste di Assise che sono costruiti da un ISM cima a un coniugato CP strato trasduzione PEDOT basato su un elettrodo di Pt, la cui combinazione trasduce la concentrazione ionica di interesse ad un segnale elettrico misurabile. Un potenziale elettrodo stabile è definita sia lo strato di CP e lo strato ISM. Entrambi gli strati determinano anche la vita di lavoro del MAB e la qualità (rumore, deriva) del segnale elettrico misurato.
PEDOT è particolarmente attraente come strato trasduzione causa di entrambe le sue proprietà ioniche ed elettroniche (quando nella sua forma ossidata). PEDOT ha la capacità per alta capacità redox per ridurre al minimo elettrodo conduttivo polarizzante effetti, abbiamo misurato la sua stabile potenziale redox a 153 mV ± 6 vs Ag / AgCl. Questa caratteristica è necessario per la stabilità del potenziale ISE, che utilizza un solido contatto interno 12. Il PEDOT: PSS CP coniugato viene utilizzato come trasduttore per smacationi monovalenti LL (es. H +) e anioni bivalenti (es. CO 3 2 -). Il profilo pendenza lineare dell'elettrodo carbonato-selettiva è dovuta alla sua dipendenza dal pH. Per le misurazioni con microalghe, misura simultanea deve essere fatta per H + e CO 3 2 - ioni. Il risultato per CO 3 2 - misure è simile a quello di elettrodi convenzionali 13 e elettrodi planari simili che sono molto più grandi in dimensione 14. Quindi, la geometria dell'elettrodo riportato qui non altera le proprietà potenziometrici. Inoltre, quando la soluzione è tamponata a pH 8.5, profilo del pendio di cambiamento decade in CO 3 2 - concentrazione diminuisce da -30 a -17 mV. Ciò può essere spiegato dal fatto che H 2 CO 3, HCO 3 -, CO 3 2 -, e sciolto CO 2 Tutto coesistono in soluzioni acquose e questo equilibrium dipende dal pH. Ulteriori studi sono necessari per esplorare questo aspetto dei risultati di ioni di carbonato. Per le misure con cationi bivalenti, sostituiamo la contro-ione PSS con CaSO 4 sale, con un conseguente PEDOT: CaSO 4 polimero coniugato. Riteniamo che l'eccesso bivalente Ca 2 + catione dal disciolto CaSO 4 entro il polimero coniugato previene il legame del Ca 2 + misurata dalla soluzione campione.
Metodi elettrochimici (ciclico voltammetriche e galvanostatico) sono utilizzati per adattare la proprietà elettrochimiche e fisiche del polimero coniugato PEDOT-based. Questi metodi elettrochimici di deposizione sono utili per la costruzione rapida di Assise. L'applicazione di Assise non è limitata a sensori di ioni; dei coniugati CP possono essere funzionalizzati con biomolecole e il MAB possono funzionare come un biosensore. A causa della lunga durata di lavoro funzionali dimostrato con i ISE per ioni H +, il MAB è Suitabile per le applicazioni che richiedono un monitoraggio a lungo termine in un complesso ambiente di liquido biologico. Quindi, ha il potenziale di essere utili nella ricerca biomedica in-vivo e monitoraggio a lungo termine di ioni in screening di farmaci.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare NASA Astrobiology Science and Technology strumento di sviluppo (ASTID) Programma per il sostegno finanziario (numeri di sovvenzione 103498 e 103692), Gale Lockwood del Birck Nantechnology Center presso la Purdue University per wirebonding dei dispositivi MAB, e Joon Hyeong Parco per la disegno CAD della camera di cella a flusso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,4-Ethylenedioxythiophene | Sigma-Aldrich | 483028 | |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate) | Sigma-Aldrich | 243051 | |
| EC epsilon galvanostat/potentiostat | Bioanalytical Systems Inc. | e2P | |
| Saturated Ag/AgCl reference electrode | Bioanalytical Systems Inc. | MF-2052 | |
| Pt gauze | Alfa Aesar | 10283 | |
| Potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
| Potassium nitrate | J.T. Baker | 3190-01 | |
| Sodium bicarbonate | Mallinckrodt/ Macron | 7412-12 | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S-7127 | |
| Calcium chloride | J.T. Baker | 1311-01 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Calcium sulphate | Sigma-Aldrich | 237132 | |
| C3 cell stand | Bioanalytical Systems Inc. | EF-1085 | |
| Flow-cell chip holder | Custom, courtesy of NASA Ames | ||
| Flow-cell electrical fixture | Custom, courtesy of NASA Ames | ||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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