Summary
導電性高分子(CP)トランスデューサから構築全固体型イオン選択電極(ASSISEs)液体培地における機能生涯の数ヶ月を提供します。ここでは、ラボオンチップ形式でASSISEsの製作と校正プロセスについて説明します。 ASSISEは、複雑な生物学的培地で長期保管した後、近ネルンスト傾斜プロファイルを維持していることが実証されています。
Abstract
環境、医学、農業、生物学、そして宇宙飛行研究のラボオンチップ(LOC)のアプリケーションは、複雑な生物学的メディア1-4に長期保管に耐えることができ、イオン選択性電極(ISE)が必要です。全固体型イオン選択性電極(ASSISE)は、前述の用途に特に魅力的である。バッチ処理を可能にし、容易に構築、低メンテナンス、および(の可能性)小型化:電極は、以下の有利な特性を持つ必要があります。微細加工ASSISE H +、Ca 2 +のを定量化するためのもの、と3 CO 2を-イオンが建設された。これは、貴金属電極層( すなわち Pt)から、伝達層と、イオン選択性膜(ISM)層からなる。伝達層の機能は、測定可能な電気信号にイオン選択性膜の濃度依存性の化学ポテンシャルを伝達する。
T彼ASSISEの寿命は5-7導電層/膜界面の電位を維持することに依存することがわかった。 ASSISEワーキング寿命を延長することにより、界面層に安定した電位を維持するために、我々は(PEDOT)銀/塩化銀の代わりに7-9(銀/塩化銀)の導電性高分子(CP)、ポリ(3,4 -エチレンジオキシチオフェン)を利用変換器層として。我々は、多検体バイオチップ(MAB)( 図1)と呼ばれるラボオンチップ形式でASSISEを構築した。
(測定範囲0.01ミリメートル- - 1 mM)を、およびCa 2 +(1 mMのに対数線形範囲0.01 mM)をテスト·ソリューションの校正は、MABはpH値(動作範囲のpHは4-9)、CO 3 2を監視することができることを実証した。 pHのためのMABは藻類培地のほぼ1ヶ月保存した後に近いネルンストスロープ応答を提供します。炭酸塩バイオチップは、従来のイオン選択性電極と同様の電位差プロファイルを示す。生理学ogical測定は、微細藻類クロレラ尋常性モデル系の生物学的活性を監視するために用いられた。
MABは、サイズ、汎用性に利点を伝え、そして検体センシング機能を多重化、地球上または空間内で、多くの閉じ込められた監視状況にそれが適用されること。
バイオチップの設計と実験方法
バイオチップは、ディメンションで10×11ミリメートルで、作用電極(WES)と5のAg / AgCl参照電極(RES)として指定された9 ASSISEsを持っています。各ワーキング電極(WE)、直径240μmでかつ平等に、直径480ミクロンであるREを、から1.4ミリメートルに離間している。これらの電極は、0.5ミリメートル×0.5mmの寸法を有する電気接触パッドに接続されている。概略を図2に示されている。
サイクリックボルタンメトリー(CV)と定電流堆積方法はBioanalytic PEDOTを使用してフィルムをelectropolymerizeするために使用されるアル·システムズ(BASI)C3セルスタンド( 図3)。 PEDOTフィルムの対イオンは、目的の分析物イオンに合わせて調整される。ポリ(スチレンスルホン酸)対イオン(PEDOT / PSS)とPEDOTは、H +及びCO 3 2のために利用される- 、硫酸(のCaSO 4として溶液に添加)と、ワンは、Ca 2 +のために利用されている。 PEDOT-コーティングの電気化学的特性は、WEは、レドックス活性溶液(フェリシアン化カリウムすなわち 2mMの(K 3のFe(CN)6))でCVを用いて分析されている。 CVプロファイルに基づいて、ランドレス·シェフチク分析は、有効表面積10を決定した。 1,500 rpmでスピンコーティングはMABワーキング電極(WES)で〜2μmの厚さのイオン選択膜(ISMS)をキャストするために使用されます。
MABは、藻類媒体150μlの体積を充填したマイクロ流体フローセルチャンバー中に含まれ、コンタクトパッドを電気的に( 図 BASIシステムに接続されているURE 4)。 クロレラブルガリスの光合成活性は、周囲の明暗条件で監視されています。
Protocol
1。ポリの調製(3,4 -エチレンジオキシチオフェン):ポリ(ナトリウム4 -スチレン)(PEDOT:PSS)H +とCO 3 2用電解ソリューション-イオン
- 完全に分散するまで(約10秒)10ミリリットル脱イオン(DI)水と渦に- 70mgのポリ(ナトリウム4 -スチレン)(のNa + PSS)を追加します。
- 溶液が完全に混合されるまで、1.1のソリューション、ボルテックスに10.7μlの3,4 - ethlyenedioxythiophene(EDOT)を追加します。
2。硫酸カルシウム(PEDOT:のCaSO 4)のCa 2用電解液+イオンポリ(3,4 -エチレンジオキシチオフェン)の調製
- 10ミリリットルのDI水と渦に136 mgのカルシウム硫酸(のCaSO 4)を追加し、ソリューションは、完全に分散させると乳白色表示されません。
- 完全に混合されるまで、2.1、ボルテックスで液に10.7μlのEDOTを追加します。
3。 PEDOTベースの電解導電性ポリマー
- バイオ分析システムズ(BASI)C3セルスタンド( 図3)およびECイプシロンポテンショスタット/ガルバノスタット電解ための電気化学セルを形成するために使用される。溶存酸素を除去するために20分間電気化学セル及び窒素バブルでPSS電解液:EDOTを置きます。
- 現在電気化学セルの対向電極の位置に白金ガーゼをクリップ。次いで、白金ガーゼに対向する作用電極との電気化学セルの作用電極の位置にMABをクリップ。 PSS電解液:のみ円形の電極をPEDOTに沈めれるようにMABの深さを調整します。平方電気接触パッドを使用してソリューションの接触を避ける。
- BASI飽和銀/塩化銀(Ag / AgCl電極)電気化学セルの参照電極位置に電極を配置します。参照電極は、作業とcounteの間に含まれていないことを確認してくださいrは電極。
- PEDOTの場合:PSS堆積:20分間バブル電気化学セルを、と0Vから単一のサイクリックボルタモグラムを実行するためにECイプシロンポテンショスタット/ガルバノスタットを使用 - ±100μAスケールで20 mVの/秒のスキャンレートで1.1V。
- ためのPEDOT:のCaSO 4堆積:バブル20分間電気化学セル、および30分間nAの814でクロノを実行するためにECイプシロンポテンショスタット/ガルバノスタットを使用しています。
4。 K 3サンタフェのPEDOT系ポリマー複合体のサイクリックボルタンメトリー(CN)6
- 3.1から3.3まで、上記の手順を実行します。
- ±10μAスケールでMV /秒(25、50、75、100、L25、150、175、200)のスキャン速度を変えて-653 mVのから853 mVまでシングルサイクリックボルタモグラムを実行するためにECイプシロンポテンショスタット/ガルバノスタットを使用してください。
5。表面機能化プロトコル
- ステップ3のように、興味のあるイオンの特定預金導電性ポリマー共役。
- ステップ6のように、イオン選択膜を適用します。
6。イオン選択性膜の応用
- 真空スピナーチャック上センターMAB。
- MABと実行の中心への預金100μlの膜。
- 上下に5秒のランプで30秒間1,500 rpmでスピンコーターをスピンコートイオン選択性膜。
- 30分間スピンコートMABに掃除機をかける、20分間70℃のオーブンでチップを焼く。
7。 pHと炭酸とPEDOT-PSS導電性高分子複合体(CO 3 2 - )のキャリブレーションイオン選択性膜
- 条件10μMの炭酸水素ナトリウム(NaHCO 3を )と藻類のメディアで5 mMの塩化カリウム(塩化カリウム)でMAB一晩。
- マイクロ流体フローセルチップホルダーにMABを挿入します。
- 初期pH値または濃度(CO 3 2用などのpH 4または10μM - )で5ミリリットルの試験溶液を注入する。 BUBを削除フローセルチップホルダーからBLES。
- フローセル電気治具上にフローセルチップホルダーを置きます。
- ECイプシロンソフトウェアを開き、開回路電位(OP)モードに入ります。 300分、±1Vの電圧スケール、および10 kHzのカットオフ周波数までの時間を設定し、値ごとに2秒を記録します。
- MABは、キャリブレーション処理を続行する前に、(フラットラインを探してください)安定させます。
- MABが安定したら、試験溶液をフローセルをフラッシュし、校正されるべき次の濃度を注入液(pH5又は3 CO 2を 25μM - )。全く泡がフローセルに入ることを許可されていないことを確認してください。 pHが6、7、8、9またはCO 3 2について、ステップ7.5お よび7.6を繰り返す- 50の濃度、75、100、250、500、750、および1,000μM。
- 最後の濃度が実行された後、窒素空気とMABとドライを削除します。
- 次の使用まで、新鮮な空調ソリューションにMABバックを置きます。
塩化カルシウムでのCaSO 4導電性高分子共役
- 条件0.1 MのCaCl 2および10μMのNaNO 3 7mlの中で一晩MAB。
- 7.10から7.2に似た手順に従ってください。ステップ8.3で、0.01のCaCl 2の初期濃度と炭酸テストソリューションを交換してください。 0.05、0.1、0.5、1および10mMの試験溶液濃度について、この手順を繰り返します。
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Representative Results
PEDOTのサイクリックボルタモグラム(CV)結果の例:PSSとそれに対応するカソードピーク電流(I P)対スキャン速度(V 1/2)は、それぞれ図5aおよび5bに示されている。 PEDOT:様々なスキャンレートおよびそのカソードピーク電流でのCaSO 4は表示されません。 PSSとPEDOT:ランドレス-シェフチク分析10、固体接触PEDOTの実効表面積を用いてイオン選択性膜なしでのCaSO 4は、それぞれ、4.4×10 -11 cm 2とし、5.8×10 -11 cm 2であることがわかった。これらの値は、我々の研究グループ11から通知された電極サイズより〜130倍小さいこと電極サイズに起因し以前報告された電極に比べて比較的小さい。 MAB電極有効表面積が11ナノで表面を修飾することによって強化することができることに留意されたい。
T "PEDOT基づくISEは用>校正の結果:4〜9の範囲のpHを有する藻類メディアにおけるPSSポリマー結合体20日後ストレージ藻類培地で図6に示されている斜面プロファイルの変化は複雑である可能性があります。生物学的培地(ATCC培地:1.0 Lブリストルのソリューションとファウリング化合物および測定値に影響を与えることができる妨害塩を持っている1.0グラムプロテアーゼペプトン(BD診断システム、スパークス、MD、USA)は、仕事の目的はASSISE能力をテストすることです実際、細胞培養環境での測定を取得する。藻類生物培地およびpH 8.5( 図7)で緩衝藻類の生物学的培地の両方で1 mMの0.01 mMの濃度範囲とソリューション-カーボネートPSS(CO 3 2):私たちは、PEDOTのキャリブレーション結果をすぐにしてください。測定は、pHが7.8で実行されます。挿入図は、バッファリングされた斜面の低下と、濃度の変化を示しているソリューション。結果は、炭酸選択電極のpH依存性を示す。一つは溶解して異なるカーボネート種の存在を考慮する場合、これらの結果は有意義であり、具体的にはH 2 CO 3(炭酸)、HCO 3 - (炭酸水素)及びCO 3 2 - (カーボネート)。重炭酸塩から炭酸のpK a2の値が10.4である間炭酸フォームに炭酸用のpK a1の値は6.4です。 pHがpKa値よりも低い場合には、その種はプロトン化された形態にある間にpHがpKa値より大きい場合に、種は、その脱プロトン化形態である。測定は、pHが7.8で行われているため、ほとんどの種は、重炭酸塩形である。電圧の増分は炭酸種の増加に相関している。生物学的なメディアでの測定を行う場合があるため炭酸塩濃度のpH依存性を、人はこの依存関係を考慮する必要があります。 PEDOTとMABを使用して測定:PSSベースpHは7.8で微細藻類クロレラブルガリスを含む150μlの藻類の培地中のISEを図8に示します。私たちは、光と暗い交互に炭酸塩濃度の十年変動に相関30 mVの変動に注意してください。これらの結果は、光合成中に微細藻類の生理活性を考慮することにより説明することができる。暗い条件下で藻類は光合成活動が発生していない休眠状態のままになります。これはmVの測定値が初期ベースラインの読み取りに一定のままであり、近隣のグラフに見ることができる。藻類が光に曝されると、それらが積極的に光合成が行われている。したがって、HCO 3の減少-及びCO 3 2レベルが期待どおりに観察される。 mVの読書の面では、これはHCO 3のレベルから電圧の増加に対応している必要があります-とCO 3 2レベルが低下する。 PEDOTのキャリブレーションの結果:のCaSO 40.01ミリモルから1mMの範囲の濃度で塩化カルシウム溶液を図9に示す。 PEDOT:のCaSO 4はパターンシダ胞子Ceratopterisのrichardiiからのカルシウム濃度を測定するための電極3Dフォーマットに使用され、それらの結果は、ここで提示されていないが。結果は、Ca 2 10年変動+濃度あたり30 mVのためのほとんどネルンストスローププロファイルを示しています。キャリブレーション結果は、シダ胞子の発芽中のカルシウム電流レベルを測定するために使用される。これらの結果は、ここで提示されていない。
すべての測定では、測定直線範囲は、アプリケーションに必要な範囲に収まるように調整されています。
図1。多検体バイオチップ(MAB)はバイオチップは、複数の作業と参照電極で構成されています。
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図2。 MAB設計概略図。MABは、基準電極(RESとして意図ISE作用電極(WES)として意図9白金電極(Ø= 240μm)を、そして5白金(oは = 480μm)の電極で構成されています10×11ミリメートルバイオチップである)。残りの3つが自分のREを有しながらつの電極からなる二組は、参照電極(RE)を共有する。残りは電流測定測定のために意図されている間共有REを持つ3つのWESのセットは、電位差測定のために意図されています。ウェスとその対応のREは、等間隔1.4ミリメートルで離間されている。これらの電極は、バイオチップの一方の端部に位置Ptの接触パッド(0.5×0.5 mm)のに接続されている。
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図3。 BASIセルスタンド三電極ポテンショスタット/ガルバノスタットシステム。BASIが電気的にリアルタイムでマイクロ流体フローセルチャンバーと記録電圧測定に接続されている。
図4。マイクロ流体フローセルチャンバー。注 射器はバイオチップ上の被測定流体をプッシュするマイクロ流体チャンバの入口と出口の両方で接続されている。
図5。 (a)は、様々なスキャン速度でサイクリックボルタンメトリープロファイルとランドレス-シェフチクためのスキャンレート対(b)に対応するカソードピーク 。PSSとPEDOT:分析はランドレス-シェフチク分析に基づいて、電極の有効表面積は4.4×10 -11 cm 2で5.8 PEDOT用×10 -11 cm 2となるように計算された。それぞれのCaSO 4 表示するにはここをクリック大きい数字 。
図6。 MABのためのキャリブレーションプロファイルはPEDOT基づくISES:28日間にわたって同じバイオチップを用いて実施4種類の測定のためのpHの上昇とともに溶液中でPSSの結果はH +イオンの変動時に起因するpHが4で大きな誤差範囲を示しています。検出下限。
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図7。 CO 3 2の濃度の増加と炭酸カルシウム溶液中でPSS -藻類培地の両方であり、pH 8.5での藻類の培地をバッファリングの結果は、CO 3 2に対するpHの影響を示す-のためにセンシング:MABのためのキャリブレーションプロファイルはPEDOTに基づいISES。別の解離定数(pKa)が値において、複数の炭酸塩の種の可用性- H 2 CO 3(炭酸)、HCO 3 - (重炭酸塩)、及びCO 3 2 - (カーボネート)。 -濃度のmAbは、天然の試料での測定を行うことがあるので、キャリブレーションは、CO 3 2 10年の変化当たり-30 mVでの傾きを示し、バッファリングされていない藻類のメディアで作られています。
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図8。 CO 3 2 -濃度- 周囲の光と30 mVの変化を示す暗い条件下での生物学的モデルクロレラブルガリスとの濃度測定この〜30 mVの変化は、CO 3 2 10年変動に相関する。のみ藻類メディアのコントロールが機能バイオチップを示す応答を示していない。
図9。 MABのためのキャリブレーションプロファイルがPEDOT基づくISES:。増加濃度の塩化カルシウム溶液中でPSSの結果は、Ca 2 10年変動+濃度あたり30 mVで二価陽イオンのために近いネルンスト傾斜プロファイルを示しています。
表1。イオン選択性膜の化学組成物。全ての膜組成物は、10%重量/体積で溶媒(シクロヘキサノン)に溶解する。すべての膜組成は、四塩化ケイ素(シグマアルドリッチ社、カタログ番号:215120)の4.3 mgの乾燥成分100mgのために追加されました。
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Discussion
MABバイオチップは、Pt電極、測定可能な電気信号に関心のイオン濃度を伝達したとの組合せにPEDOTベースCP共役伝達層の上にISMから構成さASSISEsで構成されています。安定した電極電位はCP層とISM層の両方によって定義される。両方の層はまた、MABと測定された電気信号の品質(ノイズ、ドリフト)の作業寿命を決定する。
PEDOTは、そのイオンと電子特性(その酸化形態で)の両方に起因伝達層としては特に魅力的です。 PEDOTエフェクトを偏光導電性電極を最小限に抑えるために高いレドックスキャパシタンスのための能力を有し、我々は、153 mVの±6 Ag / AgClに対してで安定した酸化還元電位を測定した。この特性は、固体内部接点12を使用してISEの電位安定性のために必要である。 PEDOT:PSS CPコンジュゲートは、SMAのための変換器として使用され一価の陽イオン( 例えば H +)と二価のアニオン( 例えば CO 3 2 - )う。炭酸選択性電極の非線形スローププロファイルは、pHへの依存によるものです。イオン-微細藻類による測定の場合は、同時測定は、H +とCO 3 2のために作られなければならない。 CO 3 2の結果は-測定は、従来の電極13及び14次元ではるかに大きい同様の平面電極と同様である。したがって、ここで報告された電極形状は、電位差のプロパティを変更しません。さらに、溶液はpHが8.5、CO 3 2 10年変化の斜面プロファイルでバッファリングされている場合- -30〜-17 mVのに濃度が減少する。 、CO 3 2 - - 、およびCO 2を溶解し、すべての水溶液中で共存し、このequilibriuこれは、H 2 CO 3、HCO 3という事実によって説明することができるmは、pH値に依存します。より多くの研究が炭酸イオン結果のこの局面を探索するために必要とされる。のCaSO 4ポリマー複合体:二価カチオンとの測定のために、私たちは、PEDOTの結果のCaSO 4塩、とカウンターイオンPSSを交換してください。私たちは、ポリマー複合体の中に溶解のCaSO 4からその過剰価のCa 2 +カチオンが+試料溶液から測定のCa 2の結合防止と考えています。
電気化学的方法は、(サイクリックボルタンメトリーと定電流)テーラーPEDOT系高分子複合体の物理的および電気化学的特性に慣れている。堆積これらの電気化学的方法はASSISEsの迅速な構築のために有用である。 ASSISEsの適用は、イオンセンサに限定されるものではなく、CP複合体は、生体分子で官能化することができ、MABは、バイオセンサとして機能することができる。 H +イオンのISEはで実証長い機能ワーキング寿命のために、MABは吹田です複雑な生物学的液体培地環境での長期モニタリングを必要とするアプリケーションにBLE。それゆえ、 生体内生物医学研究及び薬物スクリーニングにおけるイオンの長期モニタリングに有用である可能性を秘めている。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、MABのデバイスのワイヤボンディングのための資金支援(助成番号103498と103692)、パーデュー大学のBirck NantechnologyセンターガーレロックウッドのためにNASA宇宙生物学科学技術楽器開発(ASTID)プログラムに感謝したい、とヨンジュンヒョンParkのでしょうフローセル室のCAD図面。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3,4-Ethylenedioxythiophene | Sigma-Aldrich | 483028 | |
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) | Sigma-Aldrich | 243051 | |
EC epsilon galvanostat/potentiostat | Bioanalytical Systems Inc. | e2P | |
Saturated Ag/AgCl reference electrode | Bioanalytical Systems Inc. | MF-2052 | |
Pt gauze | Alfa Aesar | 10283 | |
Potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
Potassium nitrate | J.T. Baker | 3190-01 | |
Sodium bicarbonate | Mallinckrodt/ Macron | 7412-12 | |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S-7127 | |
Calcium chloride | J.T. Baker | 1311-01 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium sulphate | Sigma-Aldrich | 237132 | |
C3 cell stand | Bioanalytical Systems Inc. | EF-1085 | |
Flow-cell chip holder | Custom, courtesy of NASA Ames | ||
Flow-cell electrical fixture | Custom, courtesy of NASA Ames | ||
Table 2. Specific reagents and equipment. |
References
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