Summary
एक विशिष्ट और तेजी से करने के लिए और साथ ही सही दिल समारोह, फेफड़ों की सूजन, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल एक शिक्षण उपकरण के रूप में वर्णित है. वीडियो और आंकड़े एक संगठित टीम के दृष्टिकोण है कि बड़े आकार का अध्ययन करने के लिए छोटे के लिए इस्तेमाल किया जा अनुकूलनीय में फिजियोलॉजी और microdissection तकनीकों का वर्णन करता है.
Protocol
1. तैयारी
- निम्नलिखित के रूप में और समाधान ट्यूबों (1 टेबल) तैयार:
- हैंक्स समाधान, कोई कैल्शियम, मैग्नीशियम, या पेनिसिलिन के साथ सूचक (100 यू / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एमएल).
- फास्फेट buffered खारा (पीबीएस), 1x, कोई कैल्शियम, कोई मैग्नीशियम.
- इथेनॉल, 70%, 500 मिलीलीटर.
- Formaldehyde Buffered, पीबीएस के साथ 7-10%, 500 मिलीलीटर.
- अनेस्थेसिया समाधान:
- Avertin. ध्यान 2,2,2 Tribromoethanol की 5 ग्राम 2-मिथाइल-2-butanol की 5 मिलीग्राम जोड़ने. एक बार भंग, कमरे के तापमान पर अंधेरे में स्टॉक समाधान रखने. स्टॉक समाधान की 0.25 मिलीग्राम ले लो और यह गिलास नीचे बोतल में 1xPBS की 10 मिलीलीटर के साथ पतला. 37 पर एल्यूमीनियम पन्नी, जगह के साथ बोतल लपेटें ° C तक भंग कर दी और फिर अशेष भाजक 5 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में और फ्रिज में रखने. प्रयोग की सुबह पर एक अशेष भाजक गर्म.
- बार्बिटुरेट. पीबीएस के साथ शेयर समाधान पतला करने के लिए 2.6% barbiturate प देution. Polypropylene ट्यूबों में 3-4 मिलीलीटर aliquots रखें.
- तीन कार्य क्षेत्रों (1 चित्रा) व्यवस्थित करें.
- क्षेत्र में एक अध्ययन अध्ययन पहचान संख्या, दिनांक, शरीर के वजन, सही दिल के वजन, बाएँ दिल और पट रिकॉर्ड फार्म, सटीक पैमाने (0.01 छ परिशुद्धता में 0-50 ग्राम) शरीर के वजन का निर्धारण, सूक्ष्म स्तर: निम्नलिखित मदों व्यवस्थित .001 छ परिशुद्धता में दिल वजन निर्धारित नावों तौलना, संज्ञाहरण समाधान (स्पष्ट रूप से चिह्नित), तरल नाइट्रोजन के साथ छोटे देवर, बर्फ के साथ अछूता कंटेनर, ट्यूब और 24 अच्छी तरह से थाली इकट्ठा करने के लिए रक्त और ऊतकों के नमूनों (1 टेबल), सर्जिकल उपकरणों ( तालिका 2, चित्रा 2), और उपकरणों (1 टेबल) को साफ करने के लिए समाधान.
- एरिया बी: विदारक माइक्रोस्कोप, सही दिल एक दबाव नियंत्रण इकाई कि एक एम्पलीफायर और लैपटॉप कंप्यूटर से जुड़ा है जुड़ा कैथेटर: निम्नलिखित मदों व्यवस्थित. कैथेटर में रखा गया हैएक पानी युक्त बीकर. शल्य चिकित्सा उपकरणों (2 तालिका), सीवन इष्टतम लंबाई के लिए कटौती की और टुकड़ों में रखा एक नाव तौलना व्यवस्था, टेप (आटोक्लेव टेप इष्टतम है) इष्टतम लंबाई और चौड़ाई में कटौती करने के लिए और आसान पहुँच के लिए माइक्रोस्कोप या प्रयोगशाला बेंच पर पंक्तिवाला, कपास swabs और बाल हटानेवाला समाधान. अध्ययन की शुरुआत में कैथेटर जांचना.
- क्षेत्र के सी: tracheal प्रवेशनी; 1 मिलीग्राम सीरिंज, सिवनी में कटौती करने के लिए अधिकतम लंबाई और एक नाव तौलना में रखा, तरल नाइट्रोजन के साथ छोटे देवर, बर्फ के साथ अछूता कंटेनर, ट्यूब और 24 अच्छी तरह से करने के लिए बाल इकट्ठा प्लेट ताल लेंस: निम्नलिखित मदों की व्यवस्था और ऊतक (1 टेबल) नमूनों, शल्य चिकित्सा उपकरणों (2 तालिका), समाधान BAL प्रदर्शन और tracheal प्रवेशनी और उपकरणों (1 टेबल) साफ.
2. सही हृदय कैथीटेराइजेशन
- धीरे एक में माउस रखकर एक सटीक पैमाने का उपयोग माउस वजन तौलनाजई. पशु धीरे और चुपचाप संभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि. वजन रिकार्ड. वर्णित प्रोटोकॉल चूहों कि 20 ग्राम या उससे अधिक हैं क्योंकि कंठ शिरा के व्यास दबाव कैथेटर को समायोजित करने के लिए के लिए सबसे अच्छा काम करता है, यह संभव है कि लंबे समय के रूप में छोटे चूहों कैथीटेराइज़ (17 या अधिक छ) के रूप में नस काफी बड़ी है.
- Avertin शरीर के वजन (10 μl / छ) पर निर्भर करता है, 20 ग्राम 200 μl देने के लिए जैसे के साथ इंजेक्शन द्वारा माउस संज्ञाहीन करना, 25 के लिए 250 μl दे छ, 30 के लिए 300 μl दे छ. सटीक इंजेक्शन मात्रा माउस तनाव के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता है. धीरे और चुपचाप करने के लिए पशु संभाल क्योंकि तनाव चतनाशून्य करनेवाली औषधि के लिए प्रतिक्रिया को बदल सकते हैं.
- जगह है, डबल pleated टिशू पेपर पर एक बार माउस बेहोश है. कागज पर आईडी नंबर नोट. धीरे से गर्दन के उदर पहलू में बालों को हटाने लोशन घिसना के लिए शल्य चिकित्सा का मैदान साफ है. माउस कागज पर वापस प्लेस और 1-2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
- उदर पहलू से बालों को हटानेधीरे कपास swabs के साथ बाल विकास की दिशा के खिलाफ बाल पथपाकर द्वारा गर्दन के.
- ध्यान से पैर की अंगुली पलटा के अभाव के लिए जाँच करके संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई का निर्धारण: माउस अपने पैर की उंगलियों के pinching पर प्रतिक्रिया नहीं करता.
- जल्दी और आराम से काम कर रहे है, सही हृदय कैथीटेराइजेशन के शेष 10 मिनट से अधिक नहीं ले, बेहतर 3-6 मिनट चाहिए. यह महत्वपूर्ण है कि ऊतक बाहर सूखी नहीं क्योंकि कैथेटर नस में सरकना और नमी की एक परत पर नस के अंदर ले जाने की जरूरत नहीं करता है. प्रक्रिया के अनुरूप समय डेटा है कि समूहों के बीच तुलना की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है.
- स्टायरोफोम बोर्ड पर टिशू पेपर के साथ टिशू पेपर और हस्तांतरण प्लेस पर माउस वापस. आटोक्लेव टेप का उपयोग जगह में पंजे और सिर फिक्स.
- Mandibles से उरोस्थि (छाती की हड्डी) त्वचा चीरा बनाओ.
- Mandibles की ओर ध्यान थायराइड भव्य ऊपर की तरफ टुकड़े करना सही गले नस का पर्दाफाशएन डी ट्रेकिआ.
- प्लेस स्टायरोफोम बोर्ड फोकस विमान के साथ माउस विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे पहले से ही पकड़ लगभग 0.8x बढ़ाई (कुल बढ़ाई [लेंस आंख टुकड़ा x] में जगह और लेंस में लगभग 8x है.
- ध्यान से सर्जिकल संदंश के साथ आसपास के संयोजी ऊतक को हटाने के द्वारा सही गले नस microdissect.
- सीवन के दो टुकड़े सही गले नस के शीर्ष पर रखें. टाई mandibles करने के लिए करीब के लिए रवाना शिरा में रक्त के प्रवाह में एक छोटे से मिलने के लिए करीब सीवन, सीवन कि नस के आसपास एक ढीला गाँठ में उरोस्थि / छाती की हड्डी के सबसे करीब है. एक रक्त के छोटे मिलने का उपयोग करने के बाद नस में छेद मिल सकते हैं, यह आवश्यक हो जाना चाहिए.
- साँस लो और आराम करने के लिए गर्दन और जबड़े में मांसपेशियों को ढीला ऐपिस के माध्यम से नस पर अपनी आँखें रखने. इससे यह सुनिश्चित होगा कि अपने हाथों और उंगलियों को सुरक्षित ले जाने के लिए, आसानी से और आराम से. जबकि संदंश के साथ निकटतम करने के लिए पक्ष में नस पकड़mandibles, दो दूसरे हाथ द्वारा संचालित माइक्रो कैंची का उपयोग sutures के बीच नस में एक छेद में कटौती. नीचे सूक्ष्म कैंची रखो, और है कि हाथ आराम रखते हुए, कैथेटर के लिए लग रहा है. धीरे से यह अंगूठे और पहली उंगली (3 चित्रा) के बीच पकड़ कैथेटर को पुनः प्राप्त. नस के छेद में कैथेटर डालें.
- धीरे सही दिल (3 चित्रा) में कैथेटर अग्रिम. कैथेटर कि कैसे दूर कैथेटर डाला जा जरूरत की एक अनुमानित सूचकांक दे और निगरानी के निरीक्षण के निशान का पालन. एक बार दबाव घटता प्रदर्शित कर रहे हैं, धीरे से कैथेटर के चारों ओर कम सीवन कस. क्योंकि कैथेटर तन्य शक्ति कि यह एक कुंडल देता है, और क्योंकि माउस की श्वास और दिल की धड़कन की गति को जोड़ने के लिए, अतिरिक्त प्रत्यय टेप का उपयोग कैथेटर.
- रिकार्ड बाद में विश्लेषण के लिए 2 मिनट के लिए दबाव मापन (4 चित्रा).
- कैथेटर पकड़े हुए सिवनी खोलें, फिर धीरे retrieकैथेटर ve. दबाव transducer के पीछे भाग पोंछ, बीकर में पानी के साथ वापस जगह है. दबाव transducer नहीं छुओ.
- टिशू पेपर के शीर्ष पर इच्छामृत्यु के लिए एक क्षेत्र, रक्त और तिल्ली के ऊतकों का संग्रह करने के लिए माउस स्थानांतरण. शल्य चिकित्सा उपकरणों को साफ करें.
- अगले जानवर के साथ प्रक्रिया शुरू करो. जब समय परमिट, चतनाशून्य करनेवाली औषधि इंजेक्षन जबकि दबाव वक्र (2.15) को रिकॉर्ड करने के लिए इंतज़ार कर.
3. रक्त और प्लीहा के नमूने के संग्रह
- समाधान, माउस प्रति 400 μl बार्बिटुरेट और 1-2 मिनट के लिए प्रतीक्षा इंजेक्षन. यह नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में संभावना है कि चूहों अनजाने Avertin संज्ञाहरण से उबरने जबकि लहूलुहान किया जा रहा से बचने के लिए किया जाता है. प्रयोग के उपयुक्त मानकीकरण, और समय की ही राशि पहले से इंतज़ार कर रही खून की फसल के लिए माउस प्रति barbiturate समाधान की एक ही खुराक इंजेक्शन द्वारा हासिल की है. यदि संस्थागत पशु की देखभाल की अनुमति दी है और समिति का प्रयोग करें औरके रूप में लंबे समय के रूप में पशुओं को ध्यान से संज्ञाहरण के exsanguination करने से पहले गहराई के लिए निगरानी कर रहे हैं, इस कदम से हटाया जा सकता है.
- पेट में चीरा बनाओ. लांगुलिय नस खोलें (वेना कावा) और एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर रक्त एकत्र.
- तिल्ली निकालें, या Eppendorf ट्यूब और तरल नाइट्रोजन में तस्वीर फ्रीज में तिल्ली का एक टुकड़ा, या 24 एकल कक्षों के बाद तैयार करने के लिए एक अच्छी तरह से युक्त हैंक्स बफर में अच्छी तरह से थाली में.
- ऊतक BAL, फेफड़ों का संग्रह draining लिम्फ नोड, फेफड़ों, और हृदय के ऊतकों के लिए सी कार्य क्षेत्र के लिए कागज के शीर्ष पर माउस स्थानांतरण. शल्य चिकित्सा उपकरणों को साफ करें.
4. फेफड़े और दिल के नमूने का संग्रह
- मांसपेशियों और संयोजी ऊतक के ट्रेकिआ मुफ्त काटना. ट्रेकिआ तहत रखकर संदंश, के माध्यम से सीवन खींच. धीरे पर्याप्त खिंचाव उत्पन्न करने के लिए एक छेद में कटौती. सौम्य खिंचाव को बनाए रखने, tracheal प्रवेशनी एक थोड़ा मोड़ प्रस्ताव का उपयोग कर सम्मिलित करने के लिए, और सिवनी प्रवेशनी intजगह ओ. Tracheal प्रवेशनी की प्रविष्टि के लिए, सुनिश्चित करें कि ट्रेकिआ नम है, यदि आवश्यक हो तो हैंक्स समाधान की एक बूंद जोड़ें. प्रक्रिया के दौरान, साँस, गर्दन और जबड़े की मांसपेशियों को आराम करने के लिए हाथ आंदोलनों सुरक्षित और चिकनी रखने.
- ध्यान से पेट के अंत से शुरू छाती की हड्डी को हटाने के द्वारा रिब पिंजरे खोलने काटना. परेशान है क्योंकि यह यह बहुत मुश्किल लिम्फ नोड को खोजने के लिए करना होगा नहीं छाती की सामग्री.
- प्रदर्शन ब्रोन्कोएल्वियोलर lavage (बाल), धीरे हैंक्स बफर के 1 मिलीलीटर डालने से धीरे सिरिंज बारी और पुनः प्राप्त बाल द्रव. 3 बार, करीब है और बर्फ पर ट्यूब जगह दोहराएँ. इस प्रक्रिया के दौरान, tracheal प्रवेशनी कि सिरिंज को जोड़ता के अंत पर आँखें रखो. छाती नज़र और फेफड़ों की मुद्रास्फीति अपस्फीति का पालन.
- संदंश के एक सेट के साथ रिब पिंजरे दीवार पकड़े, लग रहा है और एक और संदंश साथ लिम्फ नोड को पुन: प्राप्त करने के द्वारा हार्वेस्ट फेफड़ों लिम्फ नोड. 24 अच्छी तरह से थाली में जगह लिम्फ नोड. यह कश्मीर के लिए महत्वपूर्ण हैअब जहाँ खोज करने के लिए गर्दन से शुरू, माउस के दाईं ओर से रिब पिंजरे के द्वार और रीढ़ की हड्डी के ऊपर देखो (5 चित्रा).
- हार्वेस्ट दिल और टिशू पेपर पर जगह है. ध्यान से पट के बगल विदारक सही दिल अलग. कार्य क्षेत्र तौलना, वजन और Eppendorf ट्यूब में जगह रिकॉर्ड तरल नाइट्रोजन में फ्रीज तस्वीर स्थानांतरण.
- बाएं फेफड़े पालि के आसपास सीवन प्लेस मुख्य bronchus बंद. Eppendorf ट्यूब और तरल नाइट्रोजन, एकल कक्ष निलंबन के बाद अलगाव के लिए एक अच्छी तरह से 24 हैंक्स समाधान युक्त थाली के एक कुएं में या जगह में फ्रीज तस्वीर में बाएं फेफड़े पालि मुक्त, जगह काटना.
- लगभग डालें. 0.5 मिलीलीटर शेष फेफड़ों lobes में tracheal प्रवेशनी के माध्यम से formaldehyde समाधान buffered. मुद्रास्फीति के बाद, फेफड़ों lobes formaldehyde समाधान युक्त 50 मिलीलीटर ट्यूब में छाती और जगह के टुकड़े करना. एक वैकल्पिक अध्ययन डिजाइन के लिए, फेफड़ों opti के साथ फुलाया जा सकता हैमल मीडिया (अक्टूबर, 1:04 पीबीएस के साथ पतला) काटने और जमे हुए वर्गों के बाद तैयारी के के लिए undiluted अक्टूबर युक्त मोल्ड में जमे हुए. एक अन्य अध्ययन में डिजाइन तस्वीर जमे हुए फेफड़े के ऊतकों और फेफड़ों से एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने की जरूरत हो सकती है. उस मामले में, कोई मुद्रास्फीति आवश्यक है: शेष फेफड़ों lobes टुकड़े करना, छाती और एक अच्छी तरह से युक्त हैंक्स बफर में 24 अच्छी तरह से थाली में जगह से उन्हें पुनः प्राप्त.
- हैंक्स बफर के साथ rinsing द्वारा tracheal प्रवेशनी, स्वच्छ निकालें, शल्य चिकित्सा उपकरणों को साफ.
5. सही दिल कैथेटर से उत्पन्न दबाव घटता का विश्लेषण
दर्ज सही वेंट्रिकुलर दबाव प्रत्येक रिकॉर्डिंग के समूह की पहचान का ज्ञान नहीं के साथ LabChart 7 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण कर रहे हैं. 20 से अधिक घटता बेतरतीब ढंग से चुना जाता है और प्रत्येक अवस्था के लिए अधिकतम और न्यूनतम वेंट्रिकुलर दबाव के बीच अंतर को मापा (ΔP). औसत ΔP सही v देने के लिए गणना की हैentricular systolic दबाव.
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Representative Results
सही दिल दबाव घटता प्राप्त करने के लिए प्राथमिक परिणाम सही दिल कैथेटर की सही स्थिति से हासिल की है. दबाव समय घटता के आकार के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि सही वेंट्रिकल के कैथेटर के अंदर का सही स्थान दबाव पठारों में परिणाम (4 चित्रा). Spiky घटता, बजाय, एक कैथेटर कि या सही वेंट्रिकल की दीवार के खिलाफ दिल की धड़कन प्रस्ताव श्वास द्वारा ले जाया जाता है संकेत मिलता है. जानवरों के जीवित रहने की अवस्था के साथ संभावित समस्याओं का पता लगाने, ΔP के मानक विचलन, और हृदय की दर की गणना करने के लिए जरूरत है. दोनों मूल्यों के लिए उपचार समूहों के बीच काफी अलग नहीं होने की उम्मीद कर रहे हैं. इसके अलावा, उम्मीद है कि ΔP मूल्यों और हृदय की दर रिकॉर्डिंग समय के पार एक बहाव नहीं दिखा है. उदाहरण के लिए, धीरे धीरे ΔP मूल्यों में वृद्धि hypoxic फेफड़े 18-20 वाहिकासंकीर्णन का संकेत होगा. हृदय की दर को घटाना indicat होगाई है कि संज्ञाहरण के स्तर उच्च जानवर की मौत के लिए अग्रणी भी है. हमारी प्रयोगशाला में अलग अलग लोगों प्रक्रिया करते हैं. चूहों के सभी समूहों में हम नियमित रूप से सही वेंट्रिकुलर दबाव डेटा प्राप्त करने में 90-95% की सफलता दर को प्राप्त करने के लिए.
जबकि सीखने की प्रक्रिया, यह सबसे अच्छा है पुराने महिला चूहों (25-30 ग्राम और अधिक) है कि एक बड़ा गले नस है और नर चूहों की तुलना में कम वसा जमा हो जाते हैं के साथ शुरू. कैथेटर का स्थान का पता लगाने का सबसे अच्छा तरीका करने के लिए पशु के रूप में जल्द ही के रूप में कैथेटर नस के अंदर सुरक्षित है euthanize है. दिल से शुरू करने के लिए सीधे कैथेटर का स्थान कल्पना पशु काटना. यह बहुत ही इस समस्या को हल करने की सुविधा होगी.
BAL तरल पदार्थ प्राप्त करने के लिए 1 परिणाम tracheal प्रवेशनी का सही स्थान है. यह फेफड़ों जब हैंक्स बफर डाले है, और फेफड़ों के अपस्फीति की मुद्रास्फीति ने संकेत दिया है शौकीन जबएर निकाल दिया जाता है. वसूली की उम्मीद नियंत्रण पशुओं में डाले मात्रा के 70-80% है, कम है कि पशुओं के फेफड़ों की सूजन में (50% नीचे करने के लिए). बरामद BAL द्रव के शीर्ष पर फोम surfactant की उपस्थिति का संकेत मिलता है. बरामद बाल तरल पदार्थ की रक्त संदूषण या तो महत्वपूर्ण फेफड़ों की सूजन की उपस्थिति की वजह से होता है, या क्योंकि टपकाना और धोने के तरल पदार्थ की वसूली भी तेजी से किया गया था. यह बात नोट की है कि फेफड़ों के भीतर चोट के कुछ तीव्र उपाय बाल प्रक्रिया द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. यदि प्रयोगात्मक डिजाइन इन गंभीर चोट मानकों और बाल की परीक्षा भी महत्वपूर्ण है समझने की है, तो एक फेफड़ों लोब से बंधे हो और बाल का आयोजन करने से पहले हटा की जरूरत है.
यहां दिखाए गए प्रक्रिया में, हम मानकीकृत और फेफड़ों की मुद्रास्फीति छिड़काव के बिना ऊतक विज्ञान के लिए फेफड़ों के ऊतकों की फसल. मामलों में जहां सटीक histological morphometry पढ़ने के बाहर प्रमुख है, फेफड़े, ट्रेकिआ और पे के माध्यम से फुलाया किया जाना चाहिएrfusion मानकीकृत दबाव के तहत सभी फुफ्फुसीय धमनी के माध्यम से किया जाना चाहिए.
प्रोटोकॉल में दिखाया, दिल को सही दिल अतिवृद्धि के उपाय (सही / बाएं वेंट्रिकल और पट के वेंट्रिकल वजन के वजन) के रूप में फुल्टन सूचकांक प्रदान dissected है. इसके अलावा, नए तरीकों को विकसित किया जा रहा है कि सही दिल के histological मूल्यांकन के आधार पर कर रहे हैं. सही दिल अतिवृद्धि के उभरते histological उपायों एक) के नाभिक की संख्या बेतरतीब ढंग से चुनी सही दिल का एक परिभाषित क्षेत्र के भीतर, और ख) वाहिकाओं, और दिल की क्षेत्र के प्रति fibrotic सूचकांक के मायने रखता है.
हमारी प्रयोगशाला में, mediastinal और tracheobronchial लिम्फ नोड्स (5 चित्रा) draining फेफड़ों के सही वसूली नियमित प्रवाह cytometry द्वारा सत्यापित किया गया है क्योंकि इन ऊतकों नियंत्रण चूहों में बहुत छोटे हैं. हालांकि, आवास सुविधा और जानवरों की उम्र, unchallen में लिम्फ नोड्स के आकार में microbiome पर निर्भर करता हैGED, नियंत्रण चूहों केवल दृश्य पुष्टि के लिए पर्याप्त रूप से बड़े हो सकता है. जब प्रवाह cytometry द्वारा सत्यापित, लिम्फ नोड कोशिकाओं को thymocytes से प्रतिष्ठित किया जा जरूरत है. दुर्घटना से, थाइमस आसानी लिम्फ नोड के साथ एक साथ कर सकते हैं जांचा जा क्योंकि थाइमस और लिम्फ नोड्स एक दूसरे के करीब स्थित हैं और रिब पिंजरे के भीतर समाहित कर रहे हैं. अंतर यह है कि thymus छाती की हड्डी और रीढ़ की हड्डी में करीब लिम्फ नोड के करीब स्थित है. इसके अलावा चुनौती दे रहा है कि thymus बहुत बड़ा है, छोटे लिम्फ नोड्स से अधिक कई कोशिकाओं से युक्त है. Thymocytes आसानी से प्रवाह cytometry और CD3, CD4, और CD8 मार्करों का उपयोग करके लिम्फ नोड कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. लिम्फ नोड्स CD3 विशेषता + कोशिकाओं है, जिनमें से अधिकांश या तो CD4 या CD8 के लिए सकारात्मक हैं. इसके विपरीत, thymocytes के बहुमत के सभी तीन मार्करों के लिए सकारात्मक रहे हैं (CD3 +, CD4 + CD8 +). माउस लिम्फ नोड्स के स्थानीयकरण पर गहराई से जानकारी में आगे पांडुलिपि में पाया जा सकता हैवैन मांद Broeck एट अल 21.
प्रत्येक मुख्य प्रक्रियात्मक कदम (हृदय कैथीटेराइजेशन, रक्त और तिल्ली की वसूली, बाल, फेफड़ों और हृदय के ऊतकों की फसल) के अनुरूप समय डेटा की पीढ़ी है कि उपचार समूहों के बीच मजबूत की तुलना के लिए अनुमति देता है के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, यह सिफारिश की है कि कम से कम दो और सर्वश्रेष्ठ तीन, जांचकर्ताओं के लिए प्रयोग पूरा सहयोग. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि जांचकर्ताओं जानवरों के समूह की पहचान के ज्ञान के बिना प्रक्रिया का प्रदर्शन है. इसलिए, डेटा की पहचान करने के लिए एक तरह से है कि समूह की पहचान obscures में किया जाना है. अंत में, यह भी महत्वपूर्ण है कि जिस क्रम में जानवरों का विश्लेषण कर रहे हैं यादृच्छिक. उदाहरण के लिए, एक साधारण पहचानकर्ता प्रयोग और लगातार पशुओं की संख्या की तारीख है. अगर वहाँ उदाहरण के लिए पशुओं के 4 समूहों (ई.), पहचान असाइन और निम्नलिखित क्रम में जानवरों का अध्ययन: date_1: ए.ए., _2: दादी, date_3: Ca, date_4: दा, date_5: अटल बिहारी, date_6: Bb, date_7: सीबी, और इतने पर.
इस प्रयोगात्मक प्रवाह एक में गहराई से, आणविक तंत्र है कि फेफड़ों की सूजन और सही दिल समारोह नियंत्रण के साथ - साथ अध्ययन के लिए अनुमति देता है. युगपत डेटा और नमूना संग्रह आणविक नेटवर्क में बेहतर अंतर्दृष्टि, और उपन्यास जैविक ज्ञान प्राप्त करने के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या में कमी को प्राप्त होता है.
| / ट्यूब बीकर के प्रकार | समाधान (मात्रा) | उपयोग | |||
| रक्त के प्रसंस्करण | |||||
| Eppendorf, 1.5 मिलीग्राम | सीरम के लिए रक्त | ||||
| EDTA लेपित 2.0 मिलीलीटर | रक्त प्लाज्मा के लिए | ||||
| Eppendorf, 0.5 मिलीग्राम | रुक सीरम या प्लाज्मा | बाल का प्रसंस्करण | |||
| Polypropylene, गोल नीचे 4.5 मिलीग्राम | ब्रोन्कोएल्वियोलर lavage ले लीजिए | ||||
| Polypropylene, गोल नीचे 4.5 मिलीग्राम | BAL तैरनेवाला रुक | ||||
| 96 अच्छी तरह से थाली skirted, | BAL कोशिकाओं | ||||
| ऊतक के प्रसंस्करण | |||||
| Polypropylene, 50 मिलीलीटर | Formaldehyde, 7.5 मिलीग्राम | फेफड़े के ऊतकों को ठीक | |||
| Eppendorf, 1.5 मिलीग्राम | फ्रीज फेफड़ों पालि स्नैप | ||||
| Eppendorf, 1.5 मिलीग्राम | फ्रीज स्नैप सही दिल | ||||
| Eppendorf, 1.5 मिलीग्राम | स्नैप फ्रीज छोड़ दिया दिल | ||||
| 24 अच्छी तरह से थाली | हैंक्स बफर, 0.5-1 मिलीग्राम | मैं बाद के लिए फेफड़ों lobes के त्वरित भंडारणएकल कक्षों के solation | |||
| 24 अच्छी तरह से थाली | हैंक्स बफर, 0.5-1 मिलीग्राम | Spleens की एकल कक्षों के बाद अलगाव के लिए त्वरित भंडारण | |||
| 24 अच्छी तरह से थाली | हैंक्स बफर, 0.5-1 मिलीग्राम | एकल कक्षों के बाद अलगाव के लिए लिम्फ नोड्स के त्वरित भंडारण | |||
| प्रक्रियाओं के लिए | |||||
| ग्लास बीकर, 300 मिलीलीटर | Autoclaved पानी | मॉइस्चराइजिंग और कैथेटर सफाई | |||
| Polypropylene ट्यूब, 50 मिलीलीटर | हैंक्स बफर, 50 मिलीलीटर | BAL प्रदर्शन | |||
| Polypropylene ट्यूब, 50 मिलीलीटर | हैंक्स बफर, 50 मिलीलीटर | धोने के tracheal प्रवेशनी | |||
| Polypropylene ट्यूब, 50 मिलीलीटर | निस्संक्रामक समाधान | उपकरणों सफाई | |||
| Polypropylene ट्यूब, 50 मिलीलीटर | 70% इथेनॉल | सीएलeaning उपकरणों | |||
| Polypropylene ट्यूब, 50 मिलीलीटर | बंबा | उपकरणों सफाई | |||
तालिका 1 तैयारी और ट्यूब और समाधान के संगठन.
| साधन | विवरण | उपयोग |
| कैंची | गोल या सीधे 5.5 इंच, गोल या तेज छोर | एक क्षेत्र |
| कैंची | 4.0 इंच, गोल तेज समाप्त होता है | |
| संदंश | 4.5 इंच, तुला, फ्लैट, लोभी के साथ समाप्त होता है | |
| संदंश | 4.0 इंच, तुला, फ्लैट, लोभी के साथ समाप्त होता है | |
| कैंची | स्लिम Blades/Angled- 9 सेमी | एरिया बी |
| माइक्रो कैंची | वैनnas स्प्रिंग कैंची - 2 मिमी ब्लेड | |
| संदंश | संदंश (Dumon ललित 5) | |
| संदंश | 4.0 इंच, तुला, फ्लैट, लोभी के साथ समाप्त होता है | |
| संदंश | 4.0 इंच, सीधे, के साथ फ्लैट, लोभी समाप्त होता है | |
| सीवन | लट सिल्क 6-0 सिवनी | |
| कैथिटर | दबाव कैथेटर | |
| कैंची | गोल या सीधे 5.5 इंच, गोल या तेज छोर | क्षेत्र के सी |
| कैंची | 4.0 इंच, गोल तेज समाप्त होता है | |
| संदंश | 4.5 इंच, तुला, फ्लैट, लोभी के साथ समाप्त होता है | |
| संदंश | 4.0 इंच, तुला, फ्लैट, लोभी के साथ समाप्त होता है | |
| प्रवेशनी | Tracheal प्रवेशनी | |
| सीवन | लट सिल्क सिवनी4-0 |
तालिका 2. उपकरणों के संगठन, सिवनी, कैथेटर, tracheal प्रवेशनी.
चित्रा 1 कार्य क्षेत्रों के योजनाबद्ध स्केच.) कार्य क्षेत्र एक रिकॉर्डिंग के लिए, वजन, खून और तिल्ली ऊतक और पशुओं के लिए अस्थायी अंतरिक्ष का संग्रह. बी) सही हृदय कैथीटेराइजेशन के लिए कार्य क्षेत्र बी सी) BAL, फेफड़ों, फेफड़ों के लिम्फ नोड, और हृदय के ऊतकों की फसल के लिए कार्य क्षेत्र सी.
. चित्रा 2 प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल उपकरण कार्य क्षेत्र के लिए एक उपकरण), बी) सही हृदय कैथीटेराइजेशन (बी काम क्षेत्र) के लिए उपकरणों, सी) भारतीय नौसेना पोतकाम क्षेत्र में सी. डी के लिए truments) Tracheal cannulas. शासक उपकरणों के आकार का पता चलता है.
चित्रा 3 सही दिल कैथेटर. सही दिल कैथेटर निशान और टेप (ए) के साथ दिखाया गया है, या हाथ (बी) के द्वारा आयोजित किया. कैथेटर (एक) पर बने निशान के लिए पेंसिल अंक. कैथेटर की प्रविष्टि (सीई): सही कंठ का शिरा (सी) की सफाई, sutured संदंश के साथ आयोजित नस, कैथेटर पहले नस (डी) में बनाया छेद की ओर जा रहा है उन्नत है, कैथेटर नस (ई) में प्रविष्टि के बाद. तीर कैथेटर (डी, ई) को इंगित.
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चित्रा 4 सही दिल में दबाव में परिवर्तन का नमूना ट्रेस. निशान समय पर दबाव (mmHg) परिवर्तन (मिनट: सेकंड), सॉफ्टवेयर दो अलग गति में घटता के प्रत्येक प्रदर्शित करता है. एक नियंत्रण माउस (A) के निशान, और सूजन प्रेरित फुफ्फुसीय धमनी remodeling और उच्च रक्तचाप (बी) के साथ एक चूहे के दिखाए जाते हैं. सही सिस्टोलिक वेंट्रिकुलर दबाव के माप के लिए इस्तेमाल घटता डाला जाता है. नोट डाला घटता में स्पष्ट दबाव पठारों. तीर एक वक्र है कि एक कील एक तकनीकी त्रुटि का संकेत है. घटता के इन काँटेदार प्रकार सही वेंट्रिकुलर systolic दबाव के माप के लिए नहीं इस्तेमाल किया जा सकता है .. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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5 चित्रा एक लसीका / mediastinal tracheobronchial रिब पिंजरे और रीढ़ की हड्डी के सापेक्ष नोड के स्थान. तीर लिम्फ नोड के लिए अंक.
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Discussion
प्रयोगात्मक यहाँ उल्लिखित प्रवाह फेफड़े, दिल, और चूहों में प्रतिरक्षा प्रणाली में प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए सही वेंट्रिकुलर systolic दबाव और नमूनों की फसल में तेजी से और एक साथ माप के लिए अनुमति देता है. प्रक्रिया दिल शरीर क्रिया विज्ञान माप, सूक्ष्म विच्छेदन है और जीवित कोशिका अध्ययन, histological विश्लेषण, या ऊतकों की omics विश्लेषण के लिए बाद में ऊतक फसल को जोड़ती है. पूरी प्रक्रिया माउस के अनुसार कम से कम 20 मिनट लगते हैं. काम क्षेत्र संगठित कार्यप्रवाह की वजह से, 2-3 जानवरों के साथ अध्ययन किया जा सकता है. इसलिए, प्रक्रिया छोटे, लक्षित 12 प्रयोगों और बड़े पैमाने पर स्क्रीन सेटिंग्स की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रदर्शन के लिए उपयुक्त है, एक छोटी सी प्रयोगशाला से एक बड़ी दवा अध्ययन.
दिल शरीर क्रिया विज्ञान मापन और ऊतक फसल के संयोजन जैविक नियंत्रण है कि नेटवर्क का पता लगाने के लिए या दिल सिंक्रनाइज़ डिजाइन विश्लेषण करने की संभावना को खोलता है, फेफड़ों एकएन डी प्रतिरक्षा समारोह, ट्रांसजेनिक और KO माउस संसाधनों का उपयोग. एक साथ प्रक्रिया प्रवाह का एक महत्वपूर्ण लाभ यह अध्ययन के अनुसार आवश्यक पशुओं की संख्या में कमी है. इस प्रक्रियात्मक कार्यप्रवाह के एक अन्य आवेदन वही जानवर से दूसरे या अतिरिक्त अंगों का अध्ययन के रूप में की जरूरत की संभावना है.
यहाँ उल्लिखित प्रक्रिया सही दिल दबाव डेटा बहुत तेजी से संज्ञाहरण प्रेरण के 5-10 मिनट के भीतर उत्पन्न करता है. यह संभव पशुओं का अध्ययन करने के लिए जब वे कमरे में हवा में साँस ले रहे हैं अनायास बनाता है. दृष्टिकोण की एक सीमा है कि यह आक्रामक है: जानवरों anaesthetized हैं, वे उनकी पीठ पर रखा जाता है, और एक कैथेटर सही वेंट्रिकल में atrium के माध्यम से गले नस के माध्यम से पारित कर दिया है. सीमा भी इस प्रक्रिया का लाभ है क्योंकि डेटा सही वेंट्रिकल में समय पर दबाव में परिवर्तन के प्रत्यक्ष माप का प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके अलावा तकनीकी सुधार, विशेष रूप से जनसंपर्क miniaturizing पर भरोसाessure कैथेटर, चूहों कि कई सप्ताह का समय पर फुफ्फुसीय धमनी दबाव के प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देते हैं, के रूप में 22-24 चूहों और अन्य बड़े जानवरों में प्रदर्शन किया जा रहा है में स्थायी, निबाह कैथेटर जगह की अनुमति दे सकता है. यदि एक बंद-chested में गले नस के माध्यम से दिल कैथेटर की प्रविष्टि है, अनायास जानवरों को साँस लेने में संभव नहीं है, सही वेंट्रिकुलर systolic दबाव परिवर्तन का एक वैकल्पिक रिकॉर्डिंग छाती के उद्घाटन और एक के माध्यम से दबाव कैथेटर रखने हवादार पशुओं में बने किया जा सकता है सही वेंट्रिकल में 25 सीधे चीरा. सही दिल समारोह के गैर इनवेसिव मापन इकोकार्डियोग्राफी उपयोग किया जा सकता है. यह प्रक्रिया भी सही हृदय कैथीटेराइजेशन पहले प्रदर्शन कर सकते हैं हो सकता है, या कई बार करने के लिए रोग पहले आक्रामक 5,14-17 मापन के लिए प्रगति अध्ययन के लिए चूहों इकोकार्डियोग्राफी द्वारा जांच की जा सकती है.
इस प्रक्रिया का एक और आवेदन करने के लिए additiona प्राप्त हैएल डेटा. एक उदाहरण के रूप में एक कैथेटर कि प्रवाह और दबाव मापने के लिए कर सकते हैं का उपयोग कर, सही दिल उत्पादन और साथ ही सही दिल के दबाव में परिवर्तन के साथ किया जा सकता है एक साथ दर्ज की गई. यहाँ रेखांकित प्रक्रिया भी आगे शारीरिक, सेलुलर और आणविक परिवर्तन है कि फेफड़े प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अलावा अन्य उच्च रक्तचाप की ट्रिगर समझते हैं, उदाहरण के लिए, 27-29 आनुवंशिक म्यूटेशनों 8,10, सिगरेट का धुआँ 26 जोखिम, या माइक्रोबियल संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
(JW) R01HL082694, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन, स्थापना सहबद्ध (0855943D, सीजी), यह काम स्वास्थ्य 1R21HL092370-01 के के राष्ट्रीय संस्थान (सीजी), 1R01 HL095764-01 (GG) द्वारा वित्त पोषित किया गया था पथरीले Wold - हर्बर्ट फंड, न्यूयॉर्क (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments | ||
References
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