Summary
Aynı anda sağ kalp fonksiyonu, akciğer iltihabı ve bağışıklık yanıtı araştırmak için bir özel ve hızlı bir protokol bir öğrenme aracı olarak tanımlanmaktadır. Video ve rakamlar büyük ölçekli çalışmalara küçük kullanılmak üzere uyarlanabilir bir organize ekip yaklaşımı, fizyoloji ve mikrodiseksiyon teknikleri anlatıyoruz.
Abstract
Sağ kalp fonksiyonu böylece sağ kalp fizyolojisi ve pulmoner vasküler fizyoloji bağlayan, akciğerler aracılığıyla kan pompalamak için. Enflamasyon hücresel infiltrasyon, sitokinler ve büyüme faktörlerinin üretimi, tertipleyerek tarafından ve biçimlenme süreçleri 1 başlatarak, kalp ve akciğer fonksiyon ortak bir düzenleyicidir.
Sol ventrikül ile karşılaştırıldığında, sağ ventrikül basınç değişikliklerinin nispeten dar bir bölgede faaliyet gösteren bir alçak basınç pompası. Artmış pulmoner arter basıncı akciğer vasküler yatak ve pulmoner hipertansiyon 2 içinde basınç artması ile ilişkilidir. Pulmoner hipertansiyon, iltihaplı sık sık akciğer hastalıkları, örneğin kronik obstrüktif akciğer hastalığı, otoimmün hastalıkların ya da 3 ile ilişkilidir. Pulmoner hipertansiyon yaşam ve yaşam beklentisi kalitesi için kötü prognoz bahşeder Çünkü çok araştırma bu mig mekanizmalarının anlaşılması yöneliktirht ilaç müdahalesi 4 için hedefler. Pulmoner hipertansiyon için etkin yönetim araçları geliştirilmesi için temel zorluk, moleküler ve hücresel sağ kalp değişiklikler, akciğer ve bağışıklık sisteminin eş zamanlı anlayış karmaşıklığı kalır.
Burada, farelerin sağ kalp basınç değişiklikleri hızlı ve hassas ölçümü için bir usul iş akışı ve kalp, akciğerler ve bağışıklık dokulardan örnekler eşzamanlı hasat sunuyoruz. Yöntemi ilk pulmoner arter 5-13 baskıların vekil ölçüsü olarak 1990'ların sonunda geliştirilen yakın göğüslü farelerde juguler ven yoluyla sağ ventrikül doğrudan kateterizasyon dayanmaktadır. Organize ekip yaklaşımı çok hızlı bir sağ kalp kateterizasyonu tekniğini kolaylaştırır. Bu da kendiliğinden oda nefes farelerde ölçümlerini yapar. Farklı iş alanlarında iş akışının organizasyonuzaman gecikmesi azaltır ve eşzamanlı fizyolojisi deneyleri ve hasat bağışıklık, kalp ve akciğer dokularında gerçekleştirme imkanı açar.
Burada özetlenen usul akışı büyük ilaç tarama testleri, küçük, hedeflenen deneyler, laboratuvar ortamlarında ve çalışma tasarımları geniş bir yelpazede için adapte edilebilir. Ekokardiyografi 5,14-17 ve kalp, akciğer ve bağışıklık dokuların hasat kapsayacak şekilde genişletildi olabilir kalp fizyolojisi verilerin eşzamanlı edinimi ileri bilimsel bilgi temeli taşımak veri elde etmek için ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltır. Burada sunulan usul iş akışı aynı zamanda bağışıklık, akciğer ve kalp fonksiyonu bağlantı ağları bilgi kazanıyor için ideal bir temel sağlar. Burada özetlenen aynı ilkeler gerektiği gibi başka veya ilave organlar çalışmaya adapte edilebilir.
Protocol
1. Hazırlık
- Aşağıdaki gibi aşağıdaki çözümler ve borular (Tablo 1) hazırlanması:
- Hanks çözeltisi, herhangi bir kalsiyum, magnezyum veya gösterge penisilin (100 U / ml) / streptomisin (100 mg / ml).
- Fosfat salin (PBS), 1x, hiçbir kalsiyum, magnezyum hiçbir tamponlu.
- Etanol,% 70, 500 ml olun.
- Formaldehit Buffered, PBS ile% 7-10, 500 ml olun.
- Anestezi çözümler:
- Avertin. Dikkatle 2,2,2-Tribromoethanol 5 g 2-Metil-2-butanol, 5 ml ekleyin. Bir kere çözülmüş, karanlıkta oda sıcaklığında stok solüsyonu tutun. Stok solüsyon 0.25 ml almak ve cam alt şişe içinde 10 ml 1xPBS ile seyreltin. 37 alüminyum folyo, yer ile şişe sarın ° C çözülmüş ve daha sonra kısım 5 ml polipropilen tüpler içine ve buzdolabında tutun kadar. Deneyin sabahı bir tablet ısıtın.
- Barbiturat. % 2.6 barbitürat sol vermek PBS ile stok solüsyon seyreltinution. Polipropilen tüplere 3-4 ml alikotları yerleştirin.
- Üç işlikler (Şekil 1) düzenleyin.
- Alan A: Çalışma formuna çalışmada kimlik numarası, tarih, vücut ağırlığı, sağ kalp ağırlıkları, sol kalp ve septum kaydetmek için; vücut ağırlığı belirlemek için hassas terazi (0.01 gr hassasiyet az 0-50 g); mikro ölçeği: aşağıdaki öğeleri düzenleyin 0.001 g hassasiyet de kalp ağırlıkları belirlemek; (cerrahi aletler, tekneler tartın; anestezi çözümleri (açıkça işaretlenmiş); sıvı nitrojen ile küçük Dewar; buz ile yalıtılmış bir kap; tüpleri ve 24-plaka kan ve doku örnekleri (Tablo 1) toplamak Tablo 2, Şekil 2) ve araçlar (Tablo 1) temizlemek için çözümler.
- Alan B: diseksiyon mikroskobu, bir amplifikatör ve dizüstü bilgisayara bağlı bir basınç kontrol ünitesine bağlı sağ kalp kateteri: aşağıdaki öğeleri düzenleyin. Kateter içine yerleştirilmiştirsu içeren bir beher. Cerrahi aletler (Tablo 2), optimal uzunluğu sütür kesim parçaları ve bir tekne tartın içine yerleştirilen düzenleyin; bant (otoklav bandı optimal) Optimum uzunluğu ve genişliğine kesilmiş ve kolay erişim için mikroskop veya laboratuar tezgah üzerinde dizilmiş; pamuklu ve saç çıkarıcı çözüm. Çalışmanın başlangıcında kateter kalibre edin.
- Alan C:; trakeal kanül; 1 ml şırınga; sütür uygun uzunlukta kesilmiş ve bir tartmak tekne içine yerleştirilir; sıvı nitrojen ile küçük Dewar; buz ile yalıtılmış bir kap; tüpleri ve 24-plaka BAL toplamak için büyüteç objektif: aşağıdaki öğeleri düzenleyin ve doku örnekleri (Tablo 1), cerrahi aletler (Tablo 2); çözümleri BAL gerçekleştirmek ve trakeal kanül ve aletleri (Tablo 1) temizlemek için.
2. Sağ Kalp Kateterizasyonu
- Yavaşça içine fare koyarak bir hassas terazi kullanarak fare tartılır b tartmakyulaf. Yavaşça ve sessizce hayvan işlemek için emin olun. Ağırlığı kaydedin. Açıklanan protokol, jugular damar çapı basınç kateter yerleştirmek zorunda olduğu için 20 g veya daha fazla olan fareler için en iyi şekilde çalışır, fakat damar yeterince büyük olduğu sürece, daha küçük fareleri (17 g ya da daha fazla) kateterize mümkündür.
- , Avertin 20 g 200 ul vermek için, örneğin, vücut ağırlığı (tercihen 10 ul / g), isteğe göre enjeksiyon yoluyla fare uyuşturmak için 25 g vermek 250 ul, 30 g 300 ul verir. Tam enjeksiyon hacmi fare suşu bağlı olarak ayarlanması gerekmektedir. Stres anestezik yanıtı değiştirebilir çünkü yavaşça ve sessizce hayvan işlemek için emin olun.
- Çift pilili kağıt mendil üzerine fare sedatize sonra, yer. Kağıt üzerinde kimlik numarasını not edin. Yavaşça cerrahi alan temizlemek için boynun ventral yönü içine epilasyon losyonu sürün. Kağıda geri fare yerleştirin ve 1-2 dakika bekleyin.
- Ventral saç kaldırnazikçe pamuklu çubukla tüylerin çıkış yönünün tersine saçını okşayarak tarafından boyun.
- Dikkatlice ayak refleks yokluğu denetleyerek anestezi yeterli derinliği belirlemek: Fare, ayak kıstırma tepki vermez.
- Hızlı ve rahat çalışma, sağ kalp kateterizasyonu kalan en iyi, 3-6 dk 10 dakikadan fazla sürmemelidir. Bu kateter damar içine kayma ve nem tabakası üzerinde damar içinde hareket etmesi gerekir, çünkü doku dışarı kuru değil önemlidir. Prosedürün tutarlı bir zamanlama grupları arasında karşılaştırılabilir veri üretimi için önemlidir.
- Kağıt mendil ve strafor tahta üzerine kağıt mendil ile transferi Yeri fare geri. Otoklav bandı kullanarak yerine pençeleri ve baş Fix.
- Altçeneleri dan sternum (göğüs-kemiği) için cilt kesi olun.
- Sağ juguler ven bir açığa altçeneleri doğru tiroid büyük yukarı dikkatlice teşrihnd trakea.
- Sıra strafor kurulu yaklaşık 0.8x büyütme (toplam büyütme [mercek x göz Adet] yer ve objektif zaten odak düzlemi ile diseksiyon mikroskobu altında fare tutan yaklaşık 8x olduğunu.
- Dikkatlice cerrahi forseps ile çevreleyen bağ dokusu kaldırarak sağ juguler ven microdissect.
- Sağ juguler venin üstüne yerleştirin sütür iki adettir. Küçücük bir damla ven kan akışını kapatmak için altçeneleri yakın dikiş Kravat, damar çevresinde gevşek bir düğüm de sternum / göğüs kemiği en yakın sütür koyun. Bir sonraki ven delik bulmak için kan küçük damlama kullanabilirsiniz, gerekli olması halinde.
- Nefes alın ve mercek aracılığıyla damarın üzerinde gözlerini tutmak için (boyun ve çene kasları gevşetmek) dinlenebilir. Bu ellerinizi ve parmaklarınızı sorunsuz ve rahat, güvenli hareket sağlayacaktır. Yakın tarafında forseps ile ven tutarkenaltçeneleri, diğer taraftan tarafından işletilen mikro-makas kullanarak iki sütür arasındaki damarın içine bir delik kesti. Mikro-makas yere koy, ve el gevşemiş tutarak, kateter için hissediyorum. Hafifçe başparmak ve ilk parmak (Şekil 3) arasında tutarak kateter almak. Ven deliğine kateter yerleştirin.
- Yavaşça sağ kalp (Şekil 3) içine kateter ilerlemek. Kateter takılması gerekir ne kadar yaklaşık bir dizin vermek ve monitör gözlemlemek kateter de işaretlerini gözlemleyin. Basınç eğrileri gösterilir sonra, yavaşça kateter etrafında alt dikiş sıkıştırın. Kateter bir bobin verir çekme gücüne sahip olduğundan ve fare solunumu ve kalp atışı yapıştırmayın ayrıca, bant kullanarak kateter hareket eklemek için.
- Daha sonraki analizler için 2 dakika için Tutanak basıncı ölçümleri (Şekil 4).
- Kateter tutarak dikiş açın, sonra yavaşça Geri alkateter ettik. Basınç dönüştürücü arkasındaki bölümü silin, su ile beher içine geri yerleştirin. Basınç dönüştürücü dokunmayın.
- Ötenazi alan A, kan ve dalak dokusunun toplama kağıt mendil üstüne fare aktarın. Cerrahi aletler temizleyin.
- Bir sonraki hayvan ile prosedürü başlatın. Basınç eğrisi (2.15) kaydetmek için beklerken zamanlama izin yaparken, anestezik enjekte edilir.
3. Kan ve Dalak Örnekleri Koleksiyonu
- Çözümü, fare başına 400 ul barbitürat ve 1-2 dk bekleyin enjekte. Bu rutin havası olurken fare yanlışlıkla avertin-anestezi kurtarmak ihtimalini önlemek için laboratuvarımızda yapılmaktadır. Deney uygun standardizasyon fare başına barbitürat çözelti aynı dozda enjekte, kan ve hasat öncesi zaman aynı miktarda bekleme ile elde edilir. Kurumsal Hayvan Bakım tarafından izin ve Komite kullanın ve varsagibi uzun hayvanlara önce dikkatle kan kaybı ile anestezi derinliği için izlenir olarak, bu adım göz ardı edilebilir.
- Karın içine kesi olun. Kaudal ven (vena kava) açın ve bir transfer pipet kullanarak kan toplamak.
- Dalak çıkarın veya Eppendorf tüp ve sıvı azot içinde ek dondurucuya dalak bir parça veya tek hücre sonraki hazırlanması için de içeren Hanks tamponu içine 24 plaka içine.
- BAL toplanması, akciğer lenf nodu, akciğer ve kalp dokuları için işlik C doku kağıt üstüne fare aktarın. Cerrahi aletler temizleyin.
4. Akciğer ve Kalp Örnekleri Koleksiyonu
- Kas ve bağ dokusu trakea ücretsiz teşrih. Trakea altında yerleştirilmesi forseps aracılığıyla dikiş çekin. Hafifçe bir delik kesmek için yeterince streç oluşturur. Nazik streç bakımı, biraz döndürerek hareket kullanan trakeal kanül takın ve sütür kanül intyer o. Hanks çözüm bir damla eklemek gerekirse trakeal kanül yerleştirilmesi için, trakea nemli olduğundan emin olun. Prosedürü boyunca, nefes el hareketleri güvenli ve pürüzsüz tutmak için, boyun ve çene kasları gevşer.
- Dikkatle karın sonundan başlayarak göğüs-kemiği kaldırarak göğüs kafesini açmak teşrih. Bu çok zor lenf düğümü bulmak için yapacak çünkü toraks içeriğini rahatsız etmeyin.
- Yavaşça Hanks tamponu 1 ml ekleyerek bronkoalveoler lavaj (BAL) gerçekleştirin, yavaşça şırınga açmak ve BAL sıvısı almak. 3 kez, buz üzerinde yakın tüp ve yerde tekrarlayın. Işlem boyunca, şırınga ile bağlanır trakeal kanül ucunda gözler tutun. Akciğerlerin enflasyon ve deflasyon gözlemlemek için toraks Glance.
- , Forseps bir set ile göğüs kafesi duvarı tutarak bulma ve başka bir forseps ile lenf nodu alarak Hasat akciğer lenf nodu. 24 plaka içine yerleştirin lenf nodu. Bu k önemlidirŞimdi nerede aramak için: boyun başlayarak, (Şekil 5) farenin sağ tarafındaki kaburga kafesinin giriş bulmak ve omurga üzerinde görünüyor.
- Doku kağıt üzerinde Hasat kalp ve yer. Dikkatle septum yanında diseksiyon ile sağ kalp ayırın. A, tartmak sıvı nitrojen içinde dondurarak snap Eppendorf tüpleri içine ağırlık ve yere kaydetmek için işlik aktarın.
- Ana bronş kapatmak için sol lobun etrafında dikiş yerleştirin. Eppendorf tüp ve tek hücre süspansiyonları daha sonra izolasyonu için Hanks çözeltisi içeren bir 24 plaka bir kuyunun içine sıvı azot veya bir yerde ek dondurucuya sol lobun ücretsiz yer teşrih.
- Yaklaşık takın. 0.5 ml kalan akciğer lobu içine trakeal kanül aracılığı ile formaldehid çözeltisinin tamponlu. Enflasyon sonra, formaldehit solüsyon içeren 50 ml'lik tüp içine toraks ve yerin akciğer lobları dışarı teşrih. Alternatif bir çalışma tasarımı için, akciğerlere optimum şişirilir edilebilirmal medya (OCT, PBS 1:4 seyreltilerek) kesme ve frozen sonraki hazırlanması için sulandırılmamış Ekim içeren bir kalıp içinde donmuş. Başka bir çalışmada tasarım çırpıda dondurulmuş akciğer dokusu ve akciğerlerden çıkan tek hücre süspansiyonları elde sebep olabilir. Bu durumda, enflasyon gereklidir: Kalan akciğer lobu teşrih; iyi içeren Hanks tamponu içine 24 plaka içine toraks ve yerden onları almak.
- Hanks tamponu ile durulayarak temiz trakeal kanül, Kaldır, cerrahi aletler temizleyin.
5. Sağ Kalp Kateter Yaratılan Basıncı Eğrileri Analizi
Kaydedilen sağ ventrikül basınç verileri her kayıt grup kimliğinin hiçbir bilgi ile LabChart 7 yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. 20'den fazla eğrileri rastgele seçilmiş ve her eğri için azami ve asgari ventrikül basıncı arasındaki farkı (ΔP) ölçülür. Ortalama ΔP doğru v vermek için hesaplanırentricular sistolik basınç.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sağ kalp baskı eğrisi elde etmek için birincil sonuç sağ kalp kateteri doğru pozisyon elde edilir. Sağ ventrikül kateter içinin doğru yerleştirme (Şekil 4) basınç yaylaları neden olacağından basınç zaman eğrisinin şekli önemlidir. Spiky eğrileri yerine, sağ ventrikül duvarına solunum veya kalp atım hareketi ile taşınır bir kateter göstermektedir. Hayvanların hayatta kalma evresi ile olası sorunları tespit etmek, ΔP, standart sapma ve kalp hızı hesaplanır gerekmektedir. Her iki değer de tedavi grupları arasında anlamlı fark olması beklenmektedir. Ayrıca, beklenti ΔP değerleri ve kalp hızı kayıt süresi boyunca bir sürüklenme görünmüyor olmasıdır. Örneğin, yavaş ΔP değerleri artan hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon 18-20 işaret eder. Kalp hızı azalan indicat ederimanestezi seviyesini hayvan ölümüne yol açan çok yüksektir, e. Laboratuvarımızda farklı insanlar yordamı gerçekleştirin. Farelerin tüm gruplar karşısında rutin sağ ventrikül basınç veri elde% 90-95 başarı oranları elde.
Prosedürü öğrenirken, daha büyük bir şahdamarından var ve erkek farelere göre daha az deri altı yağ mevduat sahip olma eğilimindedir yaşlı dişi farelerde (25-30 g ve daha fazla) ile başlamak en iyisidir. Kateterin yerleştirilmesi tespit etmek için en iyi yolu en kısa sürede kateterin damar içine sabitlenmiş olarak hayvan ötenazi etmektir. Doğrudan doğruya kateterin yerleştirilmesi görselleştirmek için kalp başlayarak hayvan teşrih. Bu büyük problem çözme kolaylaştıracaktır.
BAL sıvısı elde etmek için ilk sonuç trakeal kanül doğru yerleştirilmesidir. Bu Hanks tamponu aşılandığı akciğer şişirme, ve akciğer sönmesi ile gösterildiği zaman, buffer kaldırılır. Beklenen iyileşme akciğer iltihabı olan hayvan kontrol hayvanlarında telkin hacminin% 70-80, daha az (aşağı% 50 kadar). Geri kazanılan BAL sıvısı üzerine köpük yüzey aktif varlığını gösterir. Kurtarılan BAL sıvısının kan kontaminasyonu ya çünkü önemli akciğer iltihabı varlığı nedeniyle oluşur, ya instillasyon ve yıkama sıvısının geri kazanımı çok hızlı çünkü. Bu, akciğer içinde yaralanma bir akut önlemler BAL prosedür ile gerçekleştirilebilir ki not etmektedir. Deneysel tasarım bu akut yaralanma parametreleri ve BAL incelenmesi de önemlidir anlamak için ise, o zaman bir akciğer lobu kapatma bağlı ve BAL uygulanmadan önce kaldırılması gerekiyor.
Burada gösterilen prosedürü, biz akciğerlerin standardize enflasyon ve perfüzyon olmadan histoloji için akciğer dokusu hasat. Tam histolojik morfometri okuması büyük olduğu durumlarda, akciğer, trake, ve pe yolu ile şişirilmiş olmalıdırrfusion tüm standartlaştırılmış basınç altında pulmoner arter yoluyla yapılmalıdır.
Gösterilen protokol, kalbin sağ kalp hipertrofisi ölçüsü (sol ventrikül ve septum sağ ventrikül / ağırlık oranı) olarak Fulton dizin sağlamaktır disseke edilir. Buna ek olarak, yeni yöntemler sağ kalp histolojik değerlendirmeye dayandığını geliştirilmektedir. Sağ kalp hipertrofisi Gelişen histolojik önlemler rastgele seçilmiş sağ kalp tanımlanmış bir alanda) çekirdeklerinin sayısı, ve b) damarları, kalp ve alan başına fibrotik indeks sayıları.
Bu dokularda kontrol fareler çok küçük olduğundan Laboratuvarımızda, mediastinal ve trakeobronşiyal lenf düğümleri (Şekil 5) drene akciğer doğru kurtarma rutin flow sitometri ile doğrulanır. Bununla birlikte, tesis ve ev hayvanların yaşı, unchallen de lenf düğümleri boyutu mikrobiyomları bağlı olarakged, kontrol fareler sadece görsel onay için yeterince büyük olabilir. Akış sitometrisi tarafından doğrulanması zaman, lenf düğümü hücreleri timositlerde ayırt edilmesi gerekir. Timus ve lenf düğümleri birbirine yakın bulunan ve göğüs kafesi içinde bulunan nedeniyle kaza olarak, timus kolayca lenf nodu ile birlikte tadılabilir. Ayrım timus yakın göğüs kemiği ve omurga yakın lenf nodu yer olmasıdır. Daha zorlu timus küçük lenf bezleri çok daha fazla hücre içeren, çok büyük olmasıdır. Timositleri kolayca akım sitometri ve CD3, CD4 ve CD8 belirteçleri kullanılarak lenf düğümü hücreleri ayırt edilebilir. Lenf düğümleri karakteristik CD3 + hücreler var, çoğunluğu CD4 veya CD8 için de olumludur. Buna karşılık, timositlerde çoğunluğu her üç belirteçler için pozitif olan (CD3 +, CD4 +, CD8 +). Fare lenf nodlarının lokalizasyonu ile ilgili derinlemesine bilgi daha ileri tarafından el yazması bulunabilirvan den Broeck, et al. 21.
Her bir ana prosedür adımı (kalp kateterizasyonu, kan ve dalak kurtarma, BAL, akciğer ve kalp dokularında hasat) Tutarlı zamanlaması tedavi grupları arasında sağlam bir karşılaştırma için izin veri üretimi için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, en azından iki, üç ve en iyi şekilde, araştırmacılar deney yapmak için işbirliği tavsiye edilir. Ayrıca, araştırmacılar hayvanların grup kimliğini bilmeden yordamı gerçekleştirmek önemlidir. Bu nedenle, verilerin tanımlanması grup kimliği gizleyen bir şekilde yapılması gerekmektedir. Son olarak, hayvan incelenmiştir sıradır randomize olduğu da önemlidir. Örneğin, basit bir tanımlayıcı hayvanların numaralandırma deney ve ardışık tarihtir. Hayvanlar 4 gruba (AD), örneğin varsa, kimlik atamak ve aşağıdaki sırayla hayvanlar eğitim: datE_1: Aa, tarih_2: Ba, date_3: Ca, date_4: Da, date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: Cb, vb.
Bu deneysel akış akciğer iltihabı ve sağ kalp fonksiyonunu kontrol eden moleküler mekanizmaları derinlemesine bir, eş zamanlı çalışma için izin verir. Eş zamanlı veri ve örnek toplama iyi moleküler ağlar içgörüler ve yeni biyolojik bilgi edinmek için hayvan sayısında bir azalma sağlıyor.
| Tüp / kabı tipi | Çözüm (hacim) | Kullanım | |||
| Kan İşleme | |||||
| Eppendorf, 1.5 ml | Serum için kan | ||||
| EDTA kaplamalı 2.0 ml | Plazma için kan | ||||
| Eppendorf, 0.5 ml | Freeze serum veya plazma | BAL İşleme | |||
| Polipropilen, yuvarlak dipli, 4,5 ml | Bronkoalveoler lavaj toplayın | ||||
| Polipropilen, yuvarlak dipli, 4,5 ml | BAL süpernatant dondur | ||||
| 96-kuyu plakası, etekli | BAL hücrelerinin | ||||
| Doku İşleme | |||||
| Polipropilen, 50 mL | Formaldehit, 7.5 ml | Akciğer dokusunda Fix | |||
| Eppendorf, 1.5 ml | Donma lobun Şak | ||||
| Eppendorf, 1.5 ml | Donma sağ kalp Şak | ||||
| Eppendorf, 1.5 ml | Dondurma sol kalp Şak | ||||
| 24-kuyulu plakalı | Hanks tamponu, 0.5-1 ml | Daha sonra i akciğer lobu Hızlı depolamatek hücre solation | |||
| 24-kuyulu plakalı | Hanks tamponu, 0.5-1 ml | Tek hücre sonraki izolasyonu için dalak Hızlı depolama | |||
| 24-kuyulu plakalı | Hanks tamponu, 0.5-1 ml | Tek hücre sonraki izolasyonu için lenf nodlarının Hızlı depolama | |||
| Işlemlerde | |||||
| Cam beher, 300 ml | Otoklavlanmış su | Kateter Nemlendirici ve temizleme | |||
| Polipropilen tüp, 50 mL | Hanks tamponu, 50 ml | BAL gerçekleştirin | |||
| Polipropilen tüp, 50 mL | Hanks tamponu, 50 ml | Trakeal kanül yıkayın | |||
| Polipropilen tüp, 50 mL | Dezenfektan solüsyonu | Aletleri Temizleme | |||
| Polipropilen tüp, 50 mL | % 70 etanol | Cleaning aletleri | |||
| Polipropilen tüp, 50 mL | Su dokunun | Aletleri Temizleme | |||
Tablo 1. Hazırlama ve tüpler ve çözümleri organizasyon.
| Alet | Tanım | Kullanmak |
| Makas | yuvarlak veya düz 5.5 inç yuvarlak veya sivri uçlu | Alan A |
| Makas | 4.0 inç, keskin uçları yuvarlatılmış | |
| Forseps | Düz, doyumsuz uçları 4.5 inç, bükülmüş, | |
| Forseps | Düz, doyumsuz uçları 4.0 inç, bükülmüş, | |
| Makas | İnce Blades/Angled- 9 cm | Bölgesi Yatak |
| Mikro-makas | Kamyonetnas Bahar Makas - 2 mm Bıçak | |
| Forseps | forseps (Dumon # 5 Güzel) | |
| Forseps | Düz, doyumsuz uçları 4.0 inç, bükülmüş, | |
| Forseps | 4.0 inç, düz, düz, açgözlü biter | |
| Dikin | Örgülü İpek Sütür 6-0 | |
| Sonda | Basınç kateter | |
| Makas | yuvarlak veya düz 5.5 inç yuvarlak veya sivri uçlu | Alan C |
| Makas | 4.0 inç, keskin uçları yuvarlatılmış | |
| Forseps | Düz, doyumsuz uçları 4.5 inç, bükülmüş, | |
| Forseps | Düz, doyumsuz uçları 4.0 inç, bükülmüş, | |
| Kanül | Trakeal kanül | |
| Dikin | Örgülü İpek Sütür4-0 |
Araçların Tablo 2. Örgütü, dikiş, kateter, trakeal kanül.
Şekil 1. Işlikler şematik çizimi. A) Çalışma alan bir kayıt için, tartım, kan ve dalak doku ve hayvanlar için geçici tutarak alanı koleksiyonu. Sağ kalp kateterizasyonu B) İş alan B. C) BAL, akciğer, akciğer lenf nodu, ve kalp dokuların hasat için iş-C alanı.
.. Işlik işlemi için kullanılan Şekil 2 Aletleri A) Araçlar A, B) sağ kalp kateterizasyonu (işlik B) için araçlar; C) insişlik C. D truments) Trakeal kanüller. Cetvel araçların boyutunu gösterir.
Şekil 3. Sağ kalp kateteri. Sağ kalp kateteri işaretleri ve bant (A) ile gösterilir, veya el (B) tarafından düzenlenen. Kalem kateter (A) yapılan işaretleri işaret. Kateter yerleştirilmesi (CE): sağ juguler ven (C) temizleme; forseps ile düzenlenen dikildi ven kateteri önceden ven (D) içine yapılmış bir deliğe doğru ilerledi ediliyor; kateter ven (E) içine yerleştirilmesinin ardından. Oklar kateter (D, E) işaret.
"/ Files/ftp_upload/50023/50023fig1highres.jpg" />
Şekil 4. Sağ kalp basınç değişiklikleri örnek eser. Izleri zamanla basınç değişiklikleri (mmHg) (dk: sn) gösterir; yazılım iki farklı hızlarda eğrilerinin her biri görüntüler. Bir kontrol faresi (A) izleri; ve enflamasyon kaynaklı akciğer arteryel yeniden modelleme ve hipertansiyon (B) ile bir fare gösterilmiştir. Sağ ventrikül sistolik basınç ölçümü için kullanılan Eğriler vurgulanır. Vurgulanan eğrileri net basınç yaylaları unutmayın. Ok teknik bir hata belirten bir başak olan bir eğriye noktalar. Eğrileri Bu dikenli tip sağ ventrikül sistolik basıncı ölçümü için kullanılamaz. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
0023fig5.jpg "alt =" Şekil 5 "/>
Şekil 5. Kaburga ve omurga göreceli bir trakeobronşiyal / mediastinal lenf nodu Yer. Ok lenf nodu işaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada özetlenen deneysel akışı akciğerler, kalp ve farelerde bağışıklık sistemi tepkilerin analizi için sağ ventrikül sistolik basıncı ve numune hasat hızlı ve eş zamanlı olarak ölçülmesini sağlar. Prosedür kalp fizyolojisi ölçümleri, mikro-diseksiyonu ve canlı hücre çalışmaları, histolojik analizler veya dokuların omics-analizi için sonraki doku hasat birleştirir. Tam prosedürü fare başına az 20 dakika sürer. Çünkü işlik organize iş akışının, 2-3 hayvanların aynı anda incelenebilir. Bu nedenle, işlem küçük bir laboratuarda büyük bir ilaç araştırma için, ayar geniş bir aralığında yapılır küçük, hedeflenmiş deneyler 12 ve büyük ölçekli ekranlar için uygundur.
Kalp fizyolojisi ölçümleri ve doku hasat kombinasyonu akciğer bir, biyolojik ağlar kontrol eden algılamak veya kalp senkronize etmek için tasarlanmıştır analizi gerçekleştirme imkanı açartransgenik ve KO fare kaynaklarını kullanarak nd bağışıklık fonksiyonu. Aynı anda işlem akış önemli bir avantajı çalışma için ihtiyaç duyulan hayvan sayısı azaltılmasıdır. Bu usul iş akışı bir başka uygulama gerekli aynı hayvandan başka veya ilave organları çalışma imkanı vardır.
Burada özetlenen prosedür anestezi indüksiyonu 5-10 dakika içinde, çok hızlı bir şekilde sağ kalp basınç veri üretir. Bu kendiliğinden oda havasında iken mümkün hayvanların çalışma yapar. Yaklaşımın bir kısıtlılığı invazif olmasıdır: hayvanlar anestezi, onlar sırtlarında üzerine yerleştirilen ve kateter sağ ventrikül içine atrium yoluyla juguler ven yoluyla geçirilir. Veri sağ ventrikül zamanla basınç değişiklikleri doğrudan ölçümleri temsil çünkü sınırlama da bu prosedürün avantajdır. Ayrıca teknik gelişmeler, özellikle pr miniaturizing dayanarakessure kateterler, fareler 22-24 ve diğer büyük hayvanların yapılıyor gibi, birkaç hafta zamanla pulmoner arter basıncı doğrudan kayıt için izin farelerde kalıcı, kalıcı kateter yerleştirmek için izin verebilir. Yakın göğüslü yılında juguler ven yoluyla kalp kateter, kendiliğinden hayvanların nefes mümkün değilse, sağ ventrikül sistolik basıncı değişikliklerinin alternatif bir kayıt toraks açılması ve bir ile basınç kateter yerleştirerek havalandırılmış hayvanlarda yapılabilir doğrudan sağ ventrikül 25 içine kesi. Sağ kalp fonksiyon Noninvaziv ölçümler ekokardiyografi kullanılarak yapılabilir. Bu işlem ya sağ kalp kateterizasyonu öncesinde yapılabilir, ya da fare öncesinde invaziv ölçümler 5,14-17 için hastalığın ilerlemesine çalışmak için birden çok kez için ekokardiyografi ile incelenebilir.
Bu prosedürün bir başka uygulama additiona elde etmektirl veri. Bir örnek olarak, akış ve basınç ölçebilen bir kateter kullanarak, sağ kalp çıktısı aynı anda sağ kalp basınç değişiklikleri ile birlikte kaydedilir olabilir. Burada anlatılan prosedür, aynı zamanda daha fazla, örneğin genetik mutasyonlar 8,10, sigara içme 26, veya mikrobik enfeksiyonların 27-29, bağışıklık yanıtı başka pulmoner hipertansiyon tetikler, fizyolojik hücresel ve moleküler değişiklik anlamak için kullanılabilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
R01HL082694 (JW);; Amerikan Kalp Derneği, Kurucular bağlı (0855943D, GG); Bu çalışma Sağlık 1R21HL092370-01 Ulusal Enstitüsü (GG), 1R01 HL095764-01 (GG) tarafından finanse edildi Stony Wold - Herbert Fonu, New York (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments | ||
References
- Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
- Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
- Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
- Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
- Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
- Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
- Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
- West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
- Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
- West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
- Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
- Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
- Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
- Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
- Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
- Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
- Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
- Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
- Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
- Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
- Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
- Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
- Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
- Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
- Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
- Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
- Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
- Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).
