Summary
Um protocolo específico e rápido para pesquisar, simultaneamente, a função cardíaca direita, inflamação pulmonar, e da resposta imunológica é descrito como uma ferramenta de aprendizagem. Vídeo e figuras descrevem fisiologia e técnicas de microdissecção em um grupo organizado abordagem, que é adaptável a ser utilizado para as pequenas e grandes estudos porte.
Abstract
A função do coração é bombear direito o sangue através dos pulmões, que liga a fisiologia do coração direito e fisiologia vascular pulmonar. A inflamação é um modificador comum do coração e da função do pulmão, através da elaboração de infiltrado celular, produção de citocinas e factores de crescimento, e, iniciando processos de remodelação 1.
Em comparação com o ventrículo esquerdo, o ventrículo direito é uma bomba de baixa pressão, que funciona de uma zona relativamente estreita de mudanças de pressão. O aumento das pressões de artéria pulmonar estão associados com aumento da pressão no leito vascular pulmonar e hipertensão pulmonar 2. A hipertensão pulmonar é frequentemente associada a doenças pulmonares inflamatórias, por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica, doenças auto-imunes ou 3. Como a hipertensão pulmonar confere um prognóstico ruim para a qualidade de vida ea expectativa de vida, muita pesquisa é direcionada para a compreensão dos mecanismos que might ser alvos para 4 intervenção farmacêutica. O principal desafio para o desenvolvimento de ferramentas de gestão eficazes para a hipertensão pulmonar permanece a complexidade da compreensão simultânea de alterações moleculares e celulares no coração direito, os pulmões eo sistema imunológico.
Aqui, nós apresentamos um fluxo de trabalho de procedimento para a medição rápida e precisa de mudanças de pressão no coração direito de ratos e a colheita de amostras em simultâneo a partir de coração, pulmões e tecidos imunes. O método baseia-se no cateterismo directa do ventrículo direito através da veia jugular em estreita de peito ratinhos, desenvolvido pela primeira vez na década de 1990, como medida substituta da pressão na artéria pulmonar 5-13. A equipe de abordagem organizada facilita muito rápida técnica de cateterismo do coração direito. Isto faz com que seja possível realizar as medições em ratos que respiram espontaneamente com ar ambiente. A organização do fluxo de trabalho em diferentes áreas de trabalho-reduz o tempo de atraso e abre a possibilidade de realizar simultaneamente experimentos de fisiologia e colher tecidos do coração, pulmão e imune.
O fluxo de trabalho de processo descrito aqui pode ser adaptado para uma grande variedade de ambientes de laboratório e desenhos de estudo, desde pequenas experiências orientadas, para testes de rastreio grandes drogas. A aquisição simultânea de dados da fisiologia cardíaca que pode ser expandida para incluir a ecocardiografia 5,14-17 e colheita de tecidos de pulmão, coração e imunológico, reduz o número de animais necessários para obter os dados que se movem a partir do conhecimento científico para a frente. O fluxo de trabalho processual apresentada aqui também fornece uma base ideal para ganhar o conhecimento das redes de ligação de pulmão, imune e função cardíaca. Os mesmos princípios aqui descritos podem ser adaptados para estudar outros órgãos ou adicionais, se necessário.
Protocol
1. Preparação
- Preparar as seguintes soluções e tubos (Tabela 1) como se segue:
- Hanks, solução sem cálcio e magnésio, ou com o indicador de penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 mg / ml).
- Salina tamponada com fosfato (PBS), 1x, sem cálcio, nenhum magnésio.
- Etanol, 70%, perfazer 500 ml.
- Formol tamponado, 7-10% com PBS, perfazer 500 ml.
- Anestesia soluções:
- Avertin. Adiciona-se cuidadosamente 5 ml de 2-metil-2-butanol a 5 g de 2,2,2-tribromoetanol. Uma vez dissolvido, mantenha solução estoque, à temperatura ambiente, no escuro. Tomar 0,25 ml da solução-mãe e diluir com 10 ml de 1xPBS em frasco com fundo de vidro. Enrole a garrafa com folha de alumínio, lugar a 37 ° C até se dissolver e depois aliquota em 5 ml de tubos de polipropileno e manter no refrigerador. Aquecer uma alíquota, na manhã da experiência.
- Barbitúricos. Diluir solução-mãe com PBS para dar origem a 2,6% barbitúrico solution. Colocar alíquotas de 3-4 ml em tubos de polipropileno.
- Organizar três trabalhos-áreas (Figura 1).
- Área A: Organizar os seguintes itens: a forma de estudo para registrar o número de estudo de identificação, data, peso corporal, peso de coração direito, coração esquerdo e septo, balança de precisão (0-50 g de precisão de 0,01 g) para determinar o peso corporal; escala micro para determinar peso do coração em 0,001 g de precisão; pesar barcos; anestesia soluções (claramente marcado); dewar pequena com nitrogênio líquido; recipiente isolado com gelo, tubos e 24-bem placa para coletar sangue e amostras de tecidos (Tabela 1), instrumentos cirúrgicos ( A Tabela 2, Figura 2), e as soluções para limpar os instrumentos (Tabela 1).
- Área B: Preparar os seguintes itens: microscópio de dissecação, cateter ventricular direita ligada a uma unidade de controlo de pressão que está conectado a um amplificador e um computador portátil. O cateter é colocadoum copo contendo água. Organizar instrumentos cirúrgicos (Tabela 2), pedaços de corte de sutura para tamanho ideal e colocado em um barco pesar; fita (fita de autoclave é ótima) cortados em comprimento e largura ideal e alinhados no banco ou microscópio de laboratório para o acesso fácil, cotonetes e solução de removedor de pêlos. Calibra-se o cateter no início do estudo.
- Área C: Organizar os seguintes itens: lupa; cânula traqueal; seringas de 1 ml; corte de sutura para tamanho ideal e colocado em um barco pesar; dewar pequena com nitrogênio líquido; recipiente isolado com gelo, tubos e 24-bem placa de recolher BAL e amostras de tecido (Tabela 1), instrumentos cirúrgicos (Tabela 2), soluções para realizar BAL e para limpar a cânula traqueal e os instrumentos (Tabela 1).
2. Cateterismo Cardíaco Direito
- Pesar mouse usando uma balança de precisão delicadamente colocando o mouse em um pesar baveia. Certifique-se de lidar com o animal suavemente e silenciosamente. Grave peso. O protocolo descrito funciona melhor para ratinhos que são de 20 g ou mais, porque o diâmetro da veia jugular tem de acomodar o cateter de pressão, é possível a cateterização ratos pequenos (17 g ou mais), enquanto a veia é suficientemente grande.
- Anestesiar o rato por injecção com Avertin, dependendo do peso corporal (10 ul / g), por exemplo, para dar 20 g 200 ul, para dar 25 g 250 ul, para dar 30 g 300 ml. O volume de injecção exacta tem de ser ajustado, dependendo da estirpe do rato. Certifique-se de lidar com o animal suavemente e silenciosamente porque o estresse pode alterar a resposta ao anestésico.
- Uma vez que o mouse é sedado lugar, em duplo papel de seda plissada. Note o número de identificação do artigo. Suavemente esfregue loção depilação no aspecto ventral do pescoço para limpar o campo cirúrgico. Posicione o mouse de volta para o papel e esperar por 1-2 min.
- Remover os pêlos da face ventralno pescoço, acariciando o cabelo contra o sentido do crescimento do cabelo com cotonetes.
- Cuidadosamente determinar a profundidade suficiente de anestesia, verificando a ausência do reflexo de pés: o mouse não reagir a beliscar de seus dedos.
- Trabalhando rapidamente e descontraído, o restante do cateterismo cardíaco direito não deve levar mais de 10 minutos, de forma otimizada 3-6 min. É importante que o tecido não seca, porque o catéter tem de deslizar para dentro da veia e mover-se para dentro da veia em uma camada de humidade. Tempo consistente do processo é importante para a geração de dados que são comparáveis entre os dois grupos.
- Voltar lugar do mouse em papel de seda e de transferência com papel de seda em isopor bordo. Corrigir as patas ea cabeça no lugar usando fita autoclave.
- Faça uma incisão de pele de mandíbulas para esterno (osso do peito).
- Dissecar cuidadosamente para cima da tireóide grandes para as mandíbulas para expor a veia jugular direita umª traquéia.
- Lugar de isopor placa segurando o mouse sob o microscópio de dissecção com o plano de foco já está em vigor e as lentes em aproximadamente 0,8 x ampliação (ampliação total [lente ocular x] é de cerca de 8x.
- Microdissect cuidadosamente da veia jugular direita, removendo circundante tecido conjuntivo com pinça cirúrgica.
- Colocar duas partes de fio de sutura na parte superior da veia jugular direita. Atar o fio de sutura mais próximo das mandíbulas para fechar o fluxo de sangue na veia de um fio pequeno, colocar o fio de sutura que está mais próxima do esterno / esterno em um nó frouxo em torno da veia. Pode-se usar as gotas pequenas de sangue para posterior encontrar o furo na veia, caso seja necessário.
- Respire e relaxe (soltar os músculos do pescoço e da mandíbula) para manter seus olhos na veia através da ocular. Isso irá garantir que suas mãos e dedos vai passar de forma segura, suave e relaxante. Enquanto mantém a veia com uma pinça no lado mais próximoas mandíbulas, um furo na veia entre as duas suturas usando micro-tesoura operados por outro lado. Coloque as tesouras micro-, e manter essa relaxada mão, sentir o cateter. Suavemente recuperar o cateter segurando-o entre o polegar eo dedo indicador (Figura 3). Introduzir o cateter no orifício da veia.
- Suavemente avançar o cateter no interior do coração direito (Figura 3). Observar as marcas no cateter que dão um índice aproximado de quão longe o catéter tem de ser inserida e observar o monitor. Uma vez que as curvas de pressão são apresentados, apertar ligeiramente inferior a sutura em torno do cateter. Uma vez que o cateter tem uma resistência à tracção que lhe confere uma bobina, e porque a batida do coração e de respiração do rato adicionar movimento, adicionalmente fixar o cateter com fita.
- Grave medições de pressão, durante 2 minutos para análise posterior (Figura 4).
- Abrir o suporte da sutura do cateter e então suavemente retrieve cateter. Limpar a parte de trás do transdutor de pressão, local de volta para o recipiente com água. Não toque no transdutor de pressão.
- Transferir o rato em cima do papel de tecido para a área A para a eutanásia, a recolha de sangue e tecido do baço. Limpar instrumentos cirúrgicos.
- Iniciar o procedimento com o próximo animal. Quando o tempo permite, injetar o anestésico enquanto espera para gravar a curva de pressão (2,15).
3. Coleta de amostras de sangue e Baço
- Injectar solução barbitúricos, 400 ul por rato e espere por 1-2 min. Isto é realizado rotineiramente no nosso laboratório a fim de evitar a possibilidade de que, inadvertidamente, os ratos recuperar da anestesia, enquanto avertina-de sangrado. Normalização adequada do experimento é conseguido através da injecção da mesma dose de solução de barbiturato por rato, e pela espera a mesma quantidade de tempo antes da colheita de sangue. Se for permitido pelo Animal Care Institucional e Comitê Use econtanto que os animais são cuidadosamente monitorizados quanto a profundidade da anestesia antes da sangria, esta etapa pode ser omitida.
- Faça uma incisão no abdômen. Abrir a veia caudal (veia cava), e colheita de sangue utilizando uma pipeta de transferência.
- Remover o baço, ou uma parte do baço para dentro do tubo de Eppendorf e congelamento em azoto líquido, pressão, ou para a placa de 24 poços para um tampão de Hanks contendo bem para a preparação posterior de células individuais.
- Transferir o rato em cima do papel de seda a área de trabalho-C para a recolha de BAL, o nodo de drenagem linfática de pulmão, pulmão, e os tecidos do coração. Limpar instrumentos cirúrgicos.
4. Recolha de amostras de pulmão e do coração
- Dissecar o livre traquéia de músculo e tecido conjuntivo. Fórceps colocação sob a traquéia, puxe através de sutura. Gentilmente gerar trecho suficiente para cortar um buraco. Manter o alongamento suave, inserir a cânula traqueal com um movimento ligeiramente girando, e sutura cânula intó lugar. Para a inserção da cânula traqueal, certifique-se de que a traqueia seja húmido, se necessário adicionar uma gota de solução de Hanks. Durante todo o processo, respirar, relaxar músculos do pescoço e da mandíbula, para manter os movimentos da mão segura e suave.
- Dissecar abrir a caixa torácica, removendo cuidadosamente o esterno a partir da extremidade abdominal. Não perturbe o conteúdo do tórax, porque isso irá torná-lo muito difícil encontrar o nó de linfa.
- Realizar lavado broncoalveolar (LBA) por inserção suavemente 1 ml de tampão de Hanks, vire suavemente a seringa e recuperar fluidos BAL. Repetir 3 vezes, o tubo estreito e colocar em gelo. Durante todo o processo, manter os olhos na extremidade da cânula traqueal que se conecta à seringa. Olhar para observar o tórax inflação e deflação dos pulmões.
- Colheita linfonodo pulmão mantendo parede costelas com um conjunto de pinças, encontrar e recuperar o nó de linfa com outros fórceps. Nó de linfa lugar em 24 placa bem. É importante kagora onde procurar: a partir do pescoço, encontrar a entrada da caixa torácica a partir do lado direito do rato e olhar por cima da coluna (Figura 5).
- Colheita coração e coloque em papel de seda. Isolar o coração direito, cuidadosamente dissecar ao lado do septo. Transferência para área de trabalho-A pesar, registrar o peso e colocar nos tubos de eppendorf para tirar congelamento em nitrogênio líquido.
- Coloque sutura em torno do lobo do pulmão esquerdo para fechar o brônquio principal. Dissecar o pulmão esquerdo lobo livre, em lugar do tubo eppendorf e congelamento de encaixe em azoto líquido, ou local dentro de um poço de uma placa de 24 poços contendo uma solução de Hanks para o isolamento posterior de suspensões de células individuais.
- Insira aprox. 0,5 ml solução de formol tamponado através da cânula traqueal para os lobos pulmonares restantes. Depois de inflação, dissecar os lobos pulmonares para fora do tórax e coloque em tubo de 50 ml contendo solução de formaldeído. Para um projeto de estudo alternativo, os pulmões podem ser inflados com otimismomal meios de corte (OCT, diluído a 1:4 com PBS) e congelados em um molde contendo outubro não diluídas para a preparação posterior de secções congeladas. Outro projeto de estudo pode exigir a obtenção de pressão tecido pulmonar congelado e suspensões de células individuais dos pulmões. Nesse caso, não é necessária a inflação: dissecar os lobos pulmonares restantes; recuperá-los a partir do tórax e do lugar para a placa de 24 poços para um tampão de Hanks contendo bem.
- Remover cânula traqueal, limpo por lavagem com tampão de Hanks, limpar instrumentos cirúrgicos.
5. Análise de curvas de pressão gerada a partir do cateter do coração direito
Os gravados dados de pressão do ventrículo direito são analisados usando LabChart 7 software sem conhecimento da identidade de grupo de cada gravação. Mais de 20 curvas são seleccionados de forma aleatória e que a diferença entre máximo e mínimo de pressão ventricular medido para cada curva (AP). O AP média é calculada para dar o v direitapressão sistólica entricular.
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Representative Results
O desfecho primário para a obtenção de curvas de pressão direito do coração é conseguido por a posição correcta do cateter ventricular direita. A forma das curvas de tempo de pressão é crítica, porque a correcta colocação do cateter no interior do ventrículo direito irão resultar em patamares de pressão (Figura 4). Curvas de picos, em vez disso, indicam um cateter que é movida pela respiração ou movimento batida do coração contra a parede do ventrículo direito. Para detectar possíveis problemas com a fase de sobrevivência dos animais, o desvio padrão do AP, e a frequência cardíaca tem de ser calculada. Ambos os valores são esperados para não ser significativamente diferente entre os grupos de tratamento. Além disso, espera-se que os valores de AP e a frequência cardíaca não apresentam um desvio entre o tempo de gravação. Por exemplo, aumentando lentamente valores õP indicaria a vasoconstrição pulmonar hipóxica 18-20. Diminuição da frequência cardíaca seria indicandoe que o nível de anestesia é demasiado elevada, levando à morte do animal. No nosso laboratório pessoas diferentes realizar o procedimento. Em todos os grupos de ratos que rotineiramente alcançar taxas de sucesso 90-95% na obtenção de dados de pressão do ventrículo direito.
Enquanto aprender o procedimento, o melhor é começar com os mais velhos ratos fêmeas (25-30 g e mais) que têm uma maior veia jugular e tendem a ter menos depósitos de gordura subcutânea do que os ratos do sexo masculino. A melhor forma de determinar o posicionamento do cateter está a eutanásia do animal, logo que o cateter é fixado no interior da veia. Dissecar o animal a partir do coração para visualizar diretamente a colocação do cateter. Isso facilitará a solução de problemas.
O primeiro resultado para a obtenção de LBA é o correto posicionamento da cânula traqueal. Isto é indicado pela insuflação dos pulmões quando tampão Hanks é instilado e deflação dos pulmões quando o lustreer é removido. A recuperação esperada é de 70-80% do volume instilado nos animais de controlo, menos (até 50%) em animais que têm inflamação pulmonar. Espuma no topo do fluido BAL recuperado indica a presença de surfactante. Contaminação sanguínea do fluido BAL recuperadas ou ocorre por causa da presença de inflamação pulmonar significativa, ou porque a instilação e a recuperação do fluido de lavagem foi muito rápido. É de notar que algumas medidas de lesão aguda no pulmão pode ser induzida pelo procedimento BAL. Se o projeto experimental é entender esses parâmetros lesão aguda e exame do LBA também é importante, então, um lobo necessita de ser amarrado e removidos antes da realização do LBA.
No âmbito do processo aqui apresentado, colhemos tecidos pulmonares para histologia sem inflação padronizada e perfusão dos pulmões. Nos casos em que a morfometria histológica exata é o grande leia-out, os pulmões devem estar calibrados através da traquéia, e perfusion deve ser realizada através da artéria pulmonar, toda a pressão normalizada.
No protocolo mostrado, o coração é dissecada para fornecer o índice Fulton como medida da hipertrofia do coração direito (peso do ventrículo direito / peso do ventrículo esquerdo e septo). Além disso, os novos métodos estão a ser desenvolvidos, que são baseados em avaliação histológica do coração direito. Emergentes medidas histológicas de hipertrofia cardíaca direita são: a) o número de núcleos dentro de uma área definida de selecionados aleatoriamente coração direito e, b) a contagem de navios, e índice de fibrose por área do coração.
No nosso laboratório, a recuperação correcta do pulmão drenagem linfática mediastinal e traqueobrônquico (Figura 5) é verificada rotineiramente por citometria de fluxo, porque estes tecidos são muito pequenas em ratinhos de controlo. No entanto, dependendo do microbioma na instalação de alojamento e a idade dos animais, o tamanho dos nodos linfáticos na unchallenGED, camundongos de controle pode ser suficientemente grande para apenas uma confirmação visual. Ao verificar por citometria de fluxo, as células de nódulos linfáticos de ser distinguidos dos timócitos. Por acidente, o timo pode ser facilmente amostrados em conjunto com o nó de linfa porque o timo e os gânglios linfáticos estão localizados próximos uns dos outros e estão contidos dentro da caixa torácica. A diferença é que o timo situa-se perto do esterno e do nó de linfa perto da coluna vertebral. Ainda mais difícil é que o timo seja muito grande, contendo células muito mais do que os gânglios linfáticos pequenos. Timócitos podem ser facilmente distinguidas a partir de células de nódulos linfáticos, utilizando citometria de fluxo e de CD3, CD4, CD8 e marcadores. Os gânglios linfáticos têm caracteristicamente células CD3 +, a maioria das quais são positivos para CD4 ou CD8. Em contraste, a maioria dos timócitos são positivos para todos os três marcadores (CD3 +, CD4 +, CD8 +). Ainda mais em profundidade as informações relativas à localização dos nódulos linfáticos do rato podem ser encontrados no manuscrito porvan den Broeck et al. 21.
Temporização consistentes de cada etapa processual principal (cateterização cardíaca, a recuperação de sangue e do baço, a colheita de pulmões, BAL e tecidos do coração) é essencial para a geração de dados que permite estabelecer a comparação entre os grupos de tratamento robusto. Portanto, recomenda-se que pelo menos dois, e mais três, os investigadores colaboram para realizar a experiência. Além disso, é essencial que os investigadores realizar o procedimento sem o conhecimento da identidade do grupo dos animais. Portanto, a identificação dos dados tem de ser feita de uma maneira que obscureça a identidade do grupo. Finalmente, é também importante que a ordem em que os animais são analisados é aleatorizado. Por exemplo, um identificador simples é a data da experiência e numeração consecutiva dos animais. Se existirem, por exemplo, quatro grupos de animais (AD), atribua a identificação e estudar os animais, na seguinte ordem: date_1: Aa, date_2: Ba, date_3: Ca, date_4: Da, date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: Cb, e assim por diante.
Este fluxo experimental permite um estudo em profundidade, simultânea dos mecanismos moleculares que controlam a inflamação do pulmão e da função cardíaca direita. Os dados simultâneos e coleta de amostra atinge uma melhor visão de redes moleculares, e uma redução no número de animais necessários para a obtenção de conhecimento biológico romance.
| Tipo de tubo / proveta | Solução (volume) | Utilização | |||
| Processamento do sangue | |||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Sangue para soro | ||||
| EDTA 2,0 ml revestido | Sangue para plasma | ||||
| Eppendorf, 0,5 ml | Congelamento de soro ou plasma | Processamento de BAL | |||
| Fundo de polipropileno, redondo, 4,5 ml | Colete lavado broncoalveolar | ||||
| Fundo de polipropileno, redondo, 4,5 ml | Congelar BAL sobrenadante | ||||
| Placa de 96 poços, contornado | Células do LBA | ||||
| Processamento de tecido | |||||
| Polipropileno, 50 ml | Formaldeído, 7,5 ml | Fixe o tecido pulmonar | |||
| Eppendorf, 1,5 ml | Encaixe lobo congelamento | ||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Encaixe coração congelamento direito | ||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Encaixe coração congelamento esquerda | ||||
| Placa de 24 poços | Tampão de Hanks, 0,5-1 ml | Quick-armazenamento de lobos pulmonares para depois eusolation de células individuais | |||
| Placa de 24 poços | Tampão de Hanks, 0,5-1 ml | Armazenamento rápido de baços de isolamento depois de células individuais | |||
| Placa de 24 poços | Tampão de Hanks, 0,5-1 ml | Armazenamento rápido dos linfonodos para isolamento depois de células individuais | |||
| Para os procedimentos | |||||
| Copo de vidro, de 300 ml | Água esterilizada | Hidratação e limpeza de cateter | |||
| Tubo de polipropileno de 50 ml | Tampão de Hanks, 50 ml | Realize BAL | |||
| Tubo de polipropileno de 50 ml | Tampão de Hanks, 50 ml | Lave cânula traqueal | |||
| Tubo de polipropileno de 50 ml | Solução desinfetante | Limpeza de instrumentos | |||
| Tubo de polipropileno de 50 ml | Etanol a 70% | Clinstrumentos eaning | |||
| Tubo de polipropileno de 50 ml | Água de torneira | Limpeza de instrumentos | |||
Tabela 1. Preparação e organização de tubos e soluções.
| Instrumento | Descrição | Usar |
| Tesoura | extremidades arredondadas ou retas 5,5 polegadas, redondo ou afiado | Área A |
| Tesoura | arredondado 4,0 polegadas, pontas afiadas | |
| Fórceps | 4,5 polegadas, curvados, com extremidades planas, agarrando | |
| Fórceps | 4,0 polegadas, curvados, com extremidades planas, agarrando | |
| Tesoura | Magro Blades/Angled- 9 centímetros | Área B |
| Micro-tesoura | VanNAS Primavera Tesoura - 2 lâminas milímetros | |
| Fórceps | fórceps (Dumon # 5 artes) | |
| Fórceps | 4,0 polegadas, curvados, com extremidades planas, agarrando | |
| Fórceps | 4,0 polegadas, em linha reta, com televisão, acaba agarrando | |
| Suture | Trançado fio de seda 6-0 | |
| Cateter | Cateter de pressão | |
| Tesoura | extremidades arredondadas ou retas 5,5 polegadas, redondo ou afiado | Área C |
| Tesoura | arredondado 4,0 polegadas, pontas afiadas | |
| Fórceps | 4,5 polegadas, curvados, com extremidades planas, agarrando | |
| Fórceps | 4,0 polegadas, curvados, com extremidades planas, agarrando | |
| Cânula | Cânula traqueal | |
| Suture | Sutura de seda trançada4-0 |
Organização Tabela 2. Dos instrumentos, a sutura, o cateter cânula traqueal.
Figura 1. Esboço esquemático das áreas de trabalho-a.)-A área de trabalho para a gravação, pesagem, coleta de sangue e tecido do baço e do espaço de armazenamento temporário para os animais. B) B Trabalho-área para cateterismo cardíaco direito. C) O trabalho da área de C para a colheita de BAL, pulmões, linfonodos, pulmão e tecidos do coração.
.. Figura 2 instrumentos utilizados para o procedimento a) Instrumentos de trabalho da área de a, b) instrumentos para cateterismo cardíaco direito (área de trabalho-B), c) instruments para o trabalho da área de C. D) cânulas traqueais. A régua mostra o tamanho dos instrumentos.
Figura 3. Cateter do coração direito. Cateter do coração direito mostrado com marcas e fita (A), ou na posse de mão (B). Os pontos de lápis para as marcas feitas no cateter (A). Inserção do cateter (CE): limpeza da veia jugular direita (C); veia suturada realizada com uma pinça, o cateter está a ser avançado para um furo previamente feito na veia (D); cateter após inserção na veia (E). As setas apontam para o cateter (D, E).
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Figura 4. Traço Amostra de alterações de pressão no coração direito. Os traços mostram alterações de pressão (mmHg) ao longo do tempo (min: seg), o software mostra cada uma das curvas em duas velocidades diferentes. Os traços de um ratinho de controlo (A), e um ratinho com remodelação inflamação pulmonar induzida hipertensão arterial e (B) são mostrados. As curvas utilizadas para a medição da pressão sistólica ventricular direita são realçados. Observe os platôs pressão clara nas curvas realçadas. A seta aponta para uma curva que tem um pico, indicando um erro técnico. Estes tipos picos de curvas não podem ser usados para medir as pressões sistólica do ventrículo direito. Clique aqui para ver maior figura .
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Figura 5. Localização de um linfonodo mediastinal / traqueobrônquica em relação à caixa torácica e da coluna. A seta aponta para o nó de linfa.
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Discussion
O fluxo experimental descrito aqui permite a medição rápida e simultânea da pressão sistólica ventricular direita e colheita de amostras para a análise das respostas no pulmões, do coração e do sistema imune em ratinhos. O procedimento combina medições coração fisiologia, micro-dissecção e colheita de tecidos para estudos posteriores de células vivas, análise histológica, ou omics-análise dos tecidos. O procedimento completo demora menos de 20 minutos por ratinho. Por causa do fluxo de trabalho de trabalho--área organizada, 2-3 animais podem ser estudadas simultaneamente. Portanto, o procedimento é adequado para pequenas experiências orientadas 12 e as telas de grande escala realizados em uma ampla variedade de configurações, a partir de um pequeno laboratório com um amplo estudo farmacêutica.
A combinação de medições coração fisiologia e colheita de tecidos se abre a possibilidade de se realizar a análise concebido para detectar redes biológicas que controlam ou sincronizar o coração, pulmão, umª função imunológica, utilizando transgênica e recursos KO mouse. Uma vantagem importante do processo de fluxo simultâneo é a redução no número de animais necessários, por estudo. Outra aplicação deste fluxo de trabalho processual é a possibilidade de estudar outros órgãos ou adicionais a partir de um mesmo animal, conforme necessário.
O procedimento descrito aqui gera os dados de pressão cardíaco direito muito rapidamente, dentro de 5-10 minutos da indução da anestesia. Isto torna possível o estudo, os animais, enquanto eles estão respirando ar ambiente espontaneamente. Uma limitação da abordagem é que é invasivo: os animais são anestesiados, eles são colocados sobre as costas, e um cateter é passado através da veia jugular através do átrio para o ventrículo direito. A limitação é também a vantagem deste procedimento, porque os dados representam as medidas directas de mudanças de pressão ao longo do tempo no ventrículo direito. Outras melhorias técnicas, principalmente contando com miniaturização do prcateteres Essure, pode permitir colocar permanentes, cateteres permanentes em ratos que permitem a gravação directa da pressão da artéria pulmonar ao longo do tempo de várias semanas, enquanto está a ser realizada em ratos 22-24 e outros animais maiores. Se a inserção de um cateter cardíaco, através da veia jugular em estreita de peito, os animais com respiração espontânea não é possível, uma gravação alternativo de certas alterações da pressão sistólica ventricular pode ser feita em animais foram ventilados com a abertura do tórax e a colocação do cateter por meio de uma pressão incisão diretamente para o ventrículo direito 25. Medições não invasivas da função cardíaca direita pode ser feita usando o ecocardiograma. Este procedimento pode ser realizado antes do cateterismo cardíaco direito, ou mouses podem ser examinados por meio de ecocardiografia por várias vezes para estudar a progressão da doença antes das medidas invasivas 5,14-17.
Outra aplicação deste processo é a obtenção de additional Dados. Como exemplo, utilizando um cateter que pode medir fluxos e de pressão, débito cardíaco direito pode ser gravados simultaneamente em conjunto com alterações de pressão direito do coração. O processo descrito aqui pode também ser usado para melhor compreender as alterações fisiológicas, celulares e moleculares que são disparadores de hipertensão pulmonar que não seja a resposta imune, por exemplo, mutações genéticas, exposição 8,10 fumo do cigarro 26, ou infecções microbianas 27-29 .
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW); American Heart Association, Fundadores da filial (0855943D, GG); Stony Wold - Herbert Fundo, Nova York (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments | ||
References
- Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
- Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
- Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
- Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
- Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
- Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
- Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
- West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
- Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
- West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
- Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
- Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
- Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
- Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
- Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
- Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
- Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
- Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
- Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
- Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
- Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
- Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
- Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
- Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
- Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
- Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
- Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
- Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).
