Summary
Een specifieke en snelle protocol tegelijkertijd onderzoeken juiste hartfunctie, longontsteking en de immuunrespons wordt beschreven als leermiddel. Video en cijfers beschrijven fysiologie en microdissectie technieken in een georganiseerd team-aanpak die aanpasbaar is om te worden gebruikt voor kleine tot grote studies.
Abstract
De functie van de rechter hart is om bloed rond te pompen door de longen, waardoor het koppelen van rechter hart fysiologie en pulmonaire vasculaire fysiologie. Ontsteking is een gemeenschappelijke modifier van hart en longfunctie, door de uitwerking van cellulaire infiltratie, de productie van cytokines en groeifactoren, en door te remodeling processen 1.
Vergeleken met de linker ventrikel, rechter ventrikel het een lage druk pomp die werkt in een relatief smalle zone van drukveranderingen. Verhoogde pulmonale arteriële bloeddruk gepaard gaan met hogere druk in de long vaatbed en pulmonale hypertensie 2. Pulmonale hypertensie wordt vaak geassocieerd met inflammatoire longziekten, zoals chronische obstructieve longziekte, of auto-immuunziekten 3. Omdat pulmonale hypertensie geeft een slechte prognose voor de kwaliteit van leven en de levensverwachting, is veel onderzoek gericht op het begrijpen van de mechanismen die might doelwit zijn van farmaceutische interventie 4. De voornaamste uitdaging voor de ontwikkeling van effectieve beheersinstrumenten voor pulmonale hypertensie blijft de complexiteit van de gelijktijdige begrip van moleculaire en cellulaire veranderingen in het rechter hart, de longen en het immuunsysteem.
Hier geven we een procedurele workflow voor snelle en nauwkeurige meting van drukveranderingen in het rechter hart van muizen en de gelijktijdige oogst van monsters van hart, longen en immune weefsels. De methode is gebaseerd op de directe catheterisatie van de rechter ventrikel via de halsader in close-chested muizen eerst ontwikkeld in de late jaren 1990 als surrogaat maat voor de druk in de longslagader 5-13. De georganiseerde team-aanpak vergemakkelijkt een zeer snelle recht hartkatheterisatie techniek. Dit maakt het mogelijk de metingen uit te voeren in muizen die spontaan ademen kamerlucht. De organisatie van de work-flow in verschillende werk-gebiedenvermindert de vertraging en opent de mogelijkheid om gelijktijdig uit te voeren fysiologie experimenten en oogst immuunsysteem, hart en longen.
De workflow hier geschetste procedure kan worden aangepast voor een groot aantal laboratoriumsituatie en studie ontwerpen van kleine, gerichte experimenten om grote drugtesten. De gelijktijdige aankoop van hartfysiologie gegevens die kunnen worden uitgebreid tot echocardiografie 5,14-17 en oogst van hart-, long-en immuunsysteem weefsels bevatten vermindert het aantal dieren dat nodig is om de gegevens die de wetenschappelijke kennisbasis vooruit te krijgen. De procedurele workflow hier gepresenteerde biedt ook een ideale basis voor het verwerven van kennis van de netwerken die immuun-, long-en hartfunctie te koppelen. Dezelfde principes hier beschreven kan worden aangepast aan andere of aanvullende organen bestuderen nodig.
Protocol
1. Voorbereiding
- Bereid de volgende oplossingen en buizen (Tabel 1) als volgt:
- Hanks oplossing, geen calcium, magnesium of indicator met penicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 mg / ml).
- Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 1x, geen calcium, magnesium no.
- Ethanol, 70%, 500 ml maken.
- Gebufferde formaldehyde, 7-10% met PBS, maken 500 ml.
- Anesthesie-oplossingen:
- Avertin. Voeg voorzichtig 5 ml 2-Methyl-2-butanol met 5 g 2,2,2-tribroomethanol. Na oplossen houden stock oplossing bij kamertemperatuur in het donker. Neem 0,25 ml van de stamoplossing en verdun het met 10 ml 1xPBS in glazen bodem fles. Wikkel de fles met aluminiumfolie, plaats bij 37 ° C opgelost en vervolgens tot aliquot in 5 ml polypropyleenbuisjes en bewaar in de koelkast. Warm een aliquot op de ochtend van het experiment.
- Barbituraat. Verdun voorraad oplossing met PBS met 2,6% te geven barbituraat solution. Plaats 3-4 ml porties in polypropyleenbuisjes.
- Organiseer drie werken-gebieden (figuur 1).
- Gebied A: Leg de volgende items: studie vorm te studeren identificatienummer, datum, het lichaamsgewicht, het gewicht van rechts hart, linker hart en septum te registreren; precisieweegschaal (0-50 g op 0,01 g nauwkeurig) om het lichaamsgewicht te bepalen; micro-schaal tot hart gewichten bepalen bij 0,001 g nauwkeurig, wegen boten, anesthesieoplossingen (duidelijk aangegeven); kleine dewar met vloeibare stikstof, geïsoleerde container met ijs buizen, 24-well plaat bloed en weefselmonsters (tabel 1) te verzamelen; chirurgische instrumenten ( tabel 2, figuur 2) en oplossingen voor de instrumenten (tabel 1) reinigen.
- Gebied B: Leg de volgende items: dissectiemicroscoop, rechts Hartkatheter verbonden met een druk regeleenheid die is verbonden met een versterker en laptop computer. De katheter wordt geplaatst ineen beker met water. Schik chirurgische instrumenten (tabel 2), stukjes hechtdraad gesneden om een optimale lengte en geplaatst in een af te wegen boot, tape (autoclaaf tape is optimaal) gesneden optimale lengte en breedte en opgesteld op microscoop of labtafel voor een gemakkelijke toegang, wattenstaafjes en haar remover oplossing. Kalibreer de catheter aan het begin van de studie.
- Gebied C: Leg de volgende items: magnifier lens; tracheacanule; 1 ml spuiten; hechtdraad gesneden om een optimale lengte en geplaatst in een af te wegen boot, kleine dewar met vloeibare stikstof; geïsoleerde container met ijs; buizen en 24-well plaat te verzamelen BAL en weefselmonsters (tabel 1), chirurgische instrumenten (tabel 2); oplossingen uitvoeren BAL en de tracheale canule en de instrumenten (tabel 1) reinigen.
2. Rechts hartkatheterisatie
- Weeg muis met behulp van een precisie schaal door voorzichtig het plaatsen van de muis in een wegen bhaver. Zorg ervoor dat u het dier te behandelen vriendelijk en rustig. Record gewicht. De beschreven protocol werkt het beste voor muizen die 20 g of meer omdat de diameter van de halsslagader te bieden aan de druk catheter, is het mogelijk om kleinere muizen (17 g of meer) zolang katheteriseren de ader groot genoeg is.
- Verdoven de muis door injectie met Avertin afhankelijk van het lichaamsgewicht (10 ul / g), bijv. voor 20 g 200 ul, 25 g 250 ul, 30 g 300 pl. Het exacte injectievolume moet worden aangepast aan de muizenstam. Zorg ervoor dat u het dier te behandelen vriendelijk en rustig, omdat stress kan de reactie op de verdoving te veranderen.
- Zodra de muis wordt verdoofd, plaats op dubbel-geplooid vloeipapier. Noteer het ID-nummer op het papier. Wrijf zachtjes over ontharen lotion in het ventrale aspect van de nek tot de chirurgische veld te wissen. Plaats de muis op het papier en wacht 1-2 minuten.
- Haal haar uit de ventrale aspectvan de nek door zachtjes strelen van de haren tegen de richting van de haargroei met een wattenstaafje.
- Voorzichtig de voldoende diepte van de anesthesie te bepalen door te controleren op de afwezigheid van de teen reflex: de muis reageert niet op knijpen van haar tenen.
- Werken snel en ontspannen, moet de rest van het rechter hart catheterisatie niet meer dan 10 minuten, optimaal 3 tot 6 minuten. Het is belangrijk dat het weefsel niet uitdroogt omdat de katheter moet glijden in de ader en de binnenkant van de ader verder een laag vochtgehalte. Consistent timing van de procedure is belangrijk voor het genereren van vergelijkbare gegevens tussen groepen.
- Plaats de muis terug op vloeipapier en overdracht met tissue papier op piepschuim boord. Fix poten en kop op zijn plaats met behulp van autoclaaf tape.
- Maak incisie van de huid van kaken naar sternum (borstbeen).
- Voorzichtig ontleden de schildklier grote omhoog naar de kaken naar rechts halsader een blootnd trachea.
- Plaats piepschuim bord met de muis onder de dissectie microscoop met de focus vliegtuig al op zijn plaats en het objectief op ongeveer 0,8 x vergroting (totale vergroting [lens x oculair] is ongeveer 8x.
- Voorzichtig microdissect het recht halsader door het verwijderen van de omliggende bindweefsel met chirurgische pincet.
- Plaats twee stukken hechtdraad bovenop de rechter halsader. Bind de hechting dichtst bij de onderkaak af te sluiten bloedstroom in de ader met een kleine trickle plaatst de hechtdraad die aan het borstbeen / borstbeen dichtst bij een losse knoop rond de ader. Men kan de kleine straaltje bloed gebruikt om het gat later te vinden in de ader dient dit nodig.
- Adem en ontspannen (draai de spieren in de nek en kaak) om uw ogen op de ader door het oculair. Dit zal ervoor zorgen dat uw handen en vingers stevig zal bewegen, soepel en ontspannen. Terwijl de ader met forceps aan de zijde het dichtst bijde kaken, een gat in de ader tussen de twee hechtingen met behulp van micro-schaar die door de andere hand. Leg de micro-schaar, en het houden van die hand ontspannen, te voelen voor de katheter. Voorzichtig ophalen van de katheter vast te houden tussen duim en wijsvinger (figuur 3). Breng de katheter in de opening van de ader.
- Voorzichtig de katheter in de rechter hart (figuur 3). Let op de markeringen op de katheter, dat een geschatte index van hoe ver de katheter moet worden ingebracht te geven en zich aan de monitor. Zodra de druk curven worden weergegeven voorzichtig haal de onderste hechting rond de katheter. Omdat de katheter heeft treksterkte, dat geeft het een spoel, en omdat de ademhaling en hartslag van de muis toe te voegen beweging, bovendien brengt de katheter met tape.
- Record drukmetingen gedurende 2 minuten later analyse (Figuur 4).
- Open het hechtingsvasthoudelement de katheter vervolgens voorzichtig Retrieve catheter. Veeg het gedeelte achter de drukopnemer, terug te plaatsen in het bekerglas met water. Raak de drukopnemer.
- Breng de muis bovenop het tissuepapier gebied A om euthanasie, de verzameling van bloed en miltweefsel. Reinig chirurgische instrumenten.
- Start de procedure met de volgende dier. Als de timing toelaat, injecteer de verdoving tijdens het wachten op de druk curve (2.15) op te nemen.
3. Inzameling van bloed en milt monsters
- Injecteer barbituraat oplossing, 400 ul per muis en wacht 1-2 minuten. Dit wordt routinematig uitgevoerd in ons laboratorium om de mogelijkheid dat de muizen onbedoeld herstellen Avertin-anesthesie tijdens uitgebloed voorkomen. Geschikte normalisatie van het experiment wordt verkregen door injectie dezelfde dosis barbituraat oplossing per muis, en door te wachten dezelfde hoeveelheid tijd voor de oogst van bloed. Indien toegestaan door de Institutional Animal Care en gebruik Comite enZolang de dieren zorgvuldig gecontroleerd op de diepte van de anesthesie vóór leegbloeden, kan deze stap worden weggelaten.
- Maak incisie in de buik. Open de caudale ader (vena cava) en het verzamelen van bloed met behulp van een overdracht pipet.
- Verwijder de milt, of een stuk van de milt in de Eppendorf buis en snap bevriezen in vloeibare stikstof of in de plaat met 24 putjes in een putje met Hanks buffer voor later bereiding van enkelvoudige cellen.
- Breng de muis bovenop het tissuepapier werk-gebied C voor het verzamelen van BAL, long drainerende lymfeklier, long-en hartweefsel. Reinig chirurgische instrumenten.
4. Het verzamelen van longen en het hart Monsters
- Prepareer de luchtpijp vrij van spier-en bindweefsel. Het plaatsen van een tang onder de luchtpijp, trek hechtdraad door. Voorzichtig het genereren van voldoende stretch om een gat te snijden. Het handhaven van de zachte stretch, plaatst u de tracheale canule met een licht draaiende beweging, en hechtdraad canule into plaats. Voor het inbrengen van de tracheale canule, ervoor zorgen dat de trachea vochtig is, eventueel een druppeltje Hanks oplossing. Tijdens de gehele procedure, ademen, ontspannen nek-en kaakspieren, om handbewegingen veilig en glad.
- Prepareer opent de ribbenkast door zorgvuldig verwijderen van het borstbeen vanaf de buik einde. Niet storen de inhoud van de thorax, want dit maakt het zeer moeilijk om de lymfeklier te vinden.
- Voer bronchoalveolaire lavage (BAL) door voorzichtig 1 ml van Hanks buffer, draai de spuit en ophalen BAS vloeistof. Herhaal dit 3 keer, in de buurt buis en plaats op ijs. Gedurende de procedure houdt ogen op het einde van de tracheale canule die is verbonden met de spuit. Blik op thorax aan de inflatie en deflatie van de longen te observeren.
- Oogst long lymfeklier door te oordelen ribbenkast muur met een set van een tang, het vinden en ophalen van de lymfeklier met een andere tang. Plaats lymfeklier in 24 wells plaat. Het is belangrijk knu waar te zoeken: vanaf de nek, de ingang van de ribbenkast te vinden vanaf de rechterkant van de muis en kijk boven de wervelkolom (figuur 5).
- Oogst hart en leg ze op vloeipapier. Isoleer de rechter hart door zorgvuldig ontleden langs het septum. Transfer naar het werk-gebied A te wegen, nemen het gewicht en de plaats in Eppendorf-buisjes te bevriezen breken in vloeibare stikstof.
- Plaats hechtdraad rond de linker long kwab aan de hoofdbronchus sluiten. Ontleden de linker long kwab vrij plaats in Eppendorf buis en snap bevriezen in vloeibare stikstof of plaats in een putje van een 24 wells plaat met Hanks oplossing voor later isolatie van enkel-celsuspensies.
- Plaats ca. 0,5 ml gebufferde formaldehyde oplossing door de trachea canule in de resterende longkwabben. Na de inflatie, ontleden de longkwabben uit de thorax en de plaats in 50 ml buis met formaldehyde-oplossing. Voor een alternatieve studie ontwerp kan de longen worden opgeblazen met optimal snijden media (LGO, verdund 1:4 met PBS) en bevroren in een mal met onverdund LGO voor latere bereiding van bevroren secties. Een andere opzet van het onderzoek kunnen leiden tot het verkrijgen van snap bevroren longweefsel en single cell suspensies uit de longen. In dat geval is geen inflatie nodig: ontleden de resterende longkwabben; daaruit op de thorax en plaats in de plaat met 24 putjes in een putje met Hanks buffer.
- Verwijder tracheacanule, schoon door spoelen met Hanks buffer, schoon chirurgische instrumenten.
5. Analyse van de druk Curves gegenereerd uit de Right Heart Catheter
De opgenomen rechter ventrikel druk gegevens worden geanalyseerd met behulp van LabChart 7 software zonder kennis van de groepsidentiteit van iedere opname. Meer dan 20 bochten willekeurig geselecteerd en het verschil tussen maximale en minimale ventriculaire druk voor elk curve gemeten (AP). De gemiddelde AP wordt berekend om de juiste ventricular systolische druk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het primaire resultaat voor het verkrijgen van goede hart drukcurven wordt bereikt door de juiste positie van het rechter hart katheter. De vorm van de druk tijdcurve is kritiek omdat de juiste plaatsing van de katheter in de rechter ventrikel leidt tot druk plateaus (figuur 4). Spiky curves daarentegen blijkt een katheter die wordt bewogen door de ademhaling of hartslag beweging tegen de wand van de rechter hartkamer. Teneinde mogelijke problemen met de fase van overleving van de dieren, de standaardafwijking van de AP en de hartslag moet worden berekend. Beide waarden worden naar verwachting niet significant verschillend tussen behandelingsgroepen. Bovendien is de verwachting is dat de AP waarden en de hartslag niet blijkt van een afwijking aan de overkant van de opnametijd. Bijvoorbeeld, langzaam toenemende waarden geven AP hypoxische pulmonale vasoconstrictie 18-20. Dalende hartslag zou Aanwijse dat het niveau van anesthesie te hoog leidt tot de dood van het dier. In ons laboratorium verschillende mensen uit te voeren van de procedure. In alle groepen muizen we routinematig te bereiken 90-95% rendement in het verkrijgen van rechter ventrikel drukgegevens.
Het leren van de procedure is het beste om te beginnen met oudere vrouwelijke muizen (25-30 g en meer) die een grotere halsader hebben, vaak minder onderhuids vet dan mannelijke muizen. De beste manier om de plaatsing van de katheter bepalen is het dier euthanaseren zodra de katheter vastgemaakt in de ader. Prepareer het dier vanaf het hart direct visualiseren de plaatsing van de katheter. Dit zal aanzienlijk vergemakkelijken het oplossen van problemen.
Het eerste resultaat voor het verkrijgen van BAL vloeistof is de juiste plaatsing van de tracheale canule. Dit wordt aangegeven door het opblazen van de longen bij Hanks buffer ingedruppeld, en leeglopen van de longen bij de buffer wordt verwijderd. Het verwachte herstel is 70-80% van het toegediende volume in controledieren, minder (tot 50%) in dieren die longontsteking hebben. Schuim op de teruggewonnen BAS vloeistof de aanwezigheid van surfactant. Besmet bloed van de teruggewonnen BAS vloeistof komt omdat de aanwezigheid van significante longontsteking of door instillatie en herstel van de wasvloeistof te snel. Het is opmerkelijk dat een aantal acute maatregelen van schade in de longen kan worden geïnduceerd door de BAL procedure. Als de experimentele opzet is om te begrijpen deze acuut letsel parameters en het onderzoek van BAL is ook belangrijk, dan is een long kwab moet worden afgebonden en verwijderd voorafgaand aan het uitvoeren van BAL.
In de hier getoonde we oogsten longweefsel voor histologie zonder gestandaardiseerde inflatie en perfusie van de longen. Wanneer exact histologische morfometrie is de belangrijkste uitlezen, moet de longen worden opgeblazen via de luchtpijp en perfusion moet worden uitgevoerd via de longslagader allemaal onder gestandaardiseerde druk.
In het getoonde protocol, wordt het hart ontleed aan de Fulton-index als maatstaf voor recht hypertrofie van het hart (gewicht van rechter ventrikel / gewicht van het linker ventrikel en tussenschot). Daarnaast worden nieuwe methoden ontwikkeld die zijn gebaseerd op histologisch onderzoek van het rechter hart. Opkomende histologische maatregelen van het recht van hypertrofie van het hart zijn a) het aantal kernen binnen een bepaald gebied van willekeurig gekozen recht hart, en b) tellingen van schepen, en fibrotische index per gebied van het hart.
In ons laboratorium, is het juiste herstel van long afvoeren en mediastinale lymfklieren tracheobronchiale (Figuur 5) routinematig gecontroleerd door flowcytometrie omdat deze weefsels zeer klein in controle muizen. Afhankelijk van de microbiome in de behuizing inrichting en de leeftijd van de dieren, de grootte van de lymfeknopen in unchallenged, kan controle muizen groot genoeg zijn voor alleen visuele bevestiging. Het verifiëren door doorstroomcytometrie, lymfknoopcellen moeten worden onderscheiden van thymocyten. Per ongeluk kunnen de thymus eenvoudig worden bemonsterd met de lymfeklier omdat de thymus en de lymfeklieren dicht bij elkaar gelegen en bevinden zich in de ribbenkast. Het verschil is dat de thymus ligt dicht bij het borstbeen en de lymfeklieren dicht bij de wervelkolom bevindt. Verdere uitdagend is dat de thymus is erg groot, met veel meer cellen dan de kleine lymfeklieren. Thymocyten kunnen gemakkelijk worden onderscheiden van lymfeknoopcellen door flowcytometrie en CD3, CD4, en CD8 markers. Lymfeklieren karakteristiek CD3 + cellen, waarvan de meeste zijn positief voor CD4 of CD8. In tegenstelling tot de meeste thymocyten zijn positief voor alle drie markers (CD3 +, CD4 +, CD8 +). Verdere diepgaande informatie over de lokalisatie van de muis lymfeklieren is te vinden in het manuscript vanvan den Broeck et al.. 21.
Consistente timing van elk van de belangrijkste procedurele stap (hartkatheterisatie, herstel van het bloed en de milt, de oogst van BAL-, long-en hart weefsels) is van cruciaal belang voor het genereren van gegevens die het mogelijk maakt voor robuuste vergelijking tussen de behandelingsgroepen. Derhalve wordt aanbevolen dat ten minste twee en drie beste, onderzoekers samenwerken om het experiment te bereiken. Voorts is het essentieel dat de onderzoekers de ingreep zonder kennis van de identiteit van de groep dieren. De identificatie van de gegevens moeten worden uitgevoerd op een wijze dat de groepsidentiteit verduistert. Tenslotte is het ook belangrijk dat de volgorde waarin de dieren worden geanalyseerd willekeurig is. Bijvoorbeeld, een eenvoudige id de datum van het experiment en opeenvolgende nummering van de dieren. Als er bijvoorbeeld 4 groepen van dieren (AD), toe te wijzen identificatie en studie van de dieren in de volgende volgorde: dat-e_1: Aa, datum_2: Ba, date_3: Ca, date_4: Da, date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: Cb, enzovoort.
Deze experimentele stroming zorgt voor een diepgaande, gelijktijdige studie van de moleculaire mechanismen die bepalen longontsteking en rechts hartfunctie. De gelijktijdige gegevens en monsterneming behaalt een beter inzicht in de moleculaire netwerken, en een vermindering van het aantal dieren dat nodig is om nieuwe biologische kennis op te doen.
| Type tube / beker | Oplossing (volume) | Benutting | |||
| Verwerking van bloed | |||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Bloed voor serum | ||||
| EDTA beklede 2,0 ml | Bloed voor plasma | ||||
| Eppendorf, 0,5 ml | Freeze serum of plasma | Verwerking van BAL | |||
| Polypropyleen, ronde bodem, 4,5 ml | Verzamel bronchoalveolaire lavage | ||||
| Polypropyleen, ronde bodem, 4,5 ml | Freeze BAL supernatant | ||||
| 96-well plaat, skirted | BAL-cellen | ||||
| Verwerking van tissue | |||||
| Polypropyleen, 50 ml | Formaldehyde, 7,5 ml | Fix longweefsel | |||
| Eppendorf, 1,5 ml | Snap bevriezen long kwab | ||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Snap bevriezen rechter hart | ||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Snap bevriezen linker hart | ||||
| 24-well plaat | Hanks buffer, 0,5-1 ml | Quick-opslag van longkwabben voor later isolation van enkele cellen | |||
| 24-well plaat | Hanks buffer, 0,5-1 ml | Snelle opslag van de milt voor later isoleren van individuele cellen | |||
| 24-well plaat | Hanks buffer, 0,5-1 ml | Snelle opslag van lymfeknopen voor later isoleren van individuele cellen | |||
| Voor de procedures | |||||
| Glazen beker, 300 ml | Geautoclaveerd water | Hydraterende en schoonmaken katheter | |||
| Polypropyleenbuis, 50 ml | Hanks buffer, 50 ml | Voer BAL | |||
| Polypropyleenbuis, 50 ml | Hanks buffer, 50 ml | Was de tracheacanule | |||
| Polypropyleenbuis, 50 ml | Desinfecterende oplossing | Reiniging instrumenten | |||
| Polypropyleenbuis, 50 ml | 70% ethanol | Cleaning instrumenten | |||
| Polypropyleenbuis, 50 ml | Leidingwater | Reiniging instrumenten | |||
Tabel 1. Voorbereiding en organisatie van buizen en oplossingen.
| Instrument | Beschrijving | Gebruiken |
| Schaar | afgeronde of rechte 5,5 inch, rond of scherpe uiteinden | Gebied A |
| Schaar | afgerond 4,0 inch, scherpe uiteinden | |
| Tang | 4,5 inch, gebogen, met vlakke, grijpen uiteinden | |
| Tang | 4,0 inch, gebogen, met vlakke, grijpen uiteinden | |
| Schaar | Slim Blades/Angled- 9 cm | Gebied B |
| Micro-schaar | Busjenas Spring Schaar - 2 mm mesjes | |
| Tang | pincet (Dumon # 5 Fine) | |
| Tang | 4,0 inch, gebogen, met vlakke, grijpen uiteinden | |
| Tang | 4,0 inch, recht, met vlakke, grijpen uiteinden | |
| Hechten | Gevlochten zijden hechtdraad 6-0 | |
| Catheter | Drukkatheter | |
| Schaar | afgeronde of rechte 5,5 inch, rond of scherpe uiteinden | Gebied C |
| Schaar | afgerond 4,0 inch, scherpe uiteinden | |
| Tang | 4,5 inch, gebogen, met vlakke, grijpen uiteinden | |
| Tang | 4,0 inch, gebogen, met vlakke, grijpen uiteinden | |
| Canule | Tracheacanule | |
| Hechten | Gevlochten zijden hechtdraad4-0 |
Tabel 2. Organisatie van instrumenten, hechtdraad, catheter, tracheale canule.
Figuur 1. Schematische tekening van de werk-gebieden. A) Werk-gebied A voor opname, wegen, ophoping van bloed en miltweefsel en tijdelijke houdruimte voor de dieren. B) Werk-gebied B voor rechts hartkatheterisatie. C) Werk-gebied C voor de oogst van BAL, longen, long lymfeklier, en het hart weefsels.
.. Figuur 2 werktuigen die voor de procedure A) Instrumenten voor het werk-gebied A, B) instrumenten voor rechts hartkatheterisatie (werk-gebied B), C) instruments voor werk-gebied C. D) tracheale canules. De liniaal toont de grootte van de instrumenten.
Figuur 3. Recht hart katheter. Rechts hart katheter getoond met merken en tape (A), of aan de hand (B). Het potlood wijst op de merktekens die op de katheter (A). Inbrengen van de katheter (CE): reinigen van de rechter halsader (C) gehecht ader gehouden met forceps, katheter wordt voortbewogen naar een eerder gemaakte gat in de ader (D); catheter na het inbrengen in de ader (E). Pijlen wijzen naar de catheter (D, E).
"/ Files/ftp_upload/50023/50023fig1highres.jpg" />
Figuur 4. Voorbeeld spoor van drukveranderingen in het rechter hart. De sporen laten drukveranderingen (mmHg) tijd (min: sec), de software wordt elk van de curves op twee verschillende snelheden. De sporen van een controle muis (A) en een muis met inflammatie pulmonale arteriële hypertensie remodellering en (B) getoond. Curven voor de meting van de systolische rechter ventrikeldruk worden gemarkeerd. Let op de duidelijke druk plateaus in de gemarkeerde bochten. De pijl wijst naar een curve die een piek geeft een technische fout heeft. Deze stekelige soorten bochten kunnen niet worden gebruikt voor het meten van rechter ventrikel systolische druk. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
0023fig5.jpg "alt =" Figuur 5 "/>
Figuur 5. Locatie van een mediastinale / tracheobronchiale lymfeklieren ten opzichte van ribbenkast en rug. De pijl wijst naar de lymfeklieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De experimentele stroom hier beschreven zorgt voor een snelle en gelijktijdige meting van systolische rechterventriculaire druk en oogsten van monsters voor analyse van de reacties in de longen, het hart en het immuunsysteem in muizen. De procedure combineert hart fysiologie metingen, micro-dissectie en de daaropvolgende weefsel oogst voor levende cellen onderzoeken is een histologische analyse, of omics-analyse van de weefsels. De hele procedure duurt minder dan 20 minuten per muis. Door het werk-gebied georganiseerde workflow kunt vertrouwen 2-3 dieren tegelijkertijd worden bestudeerd. Derhalve is de werkwijze geschikt voor kleine, gerichte experimenten 12 en grootschalige screens uitgevoerd in een breed scala van instellingen van een kleine laboratorium een groot farmaceutisch onderzoek.
De combinatie van hart fysiologie metingen en weefsel oogsten biedt de mogelijkheid analyse ter biologische bestrijding netwerken die detecteren of hart synchroniseren voeren, long eennd het immuunsysteem, met gebruikmaking van transgene en knock-out muizen middelen. Een belangrijk voordeel van de gelijktijdige procedure stroming is de vermindering van het aantal benodigde dieren per studie. Een andere toepassing van deze procedurele workflow is de mogelijkheid om andere of aanvullende organen bestuderen van hetzelfde dier als dat nodig is.
De hier beschreven procedure genereert rechter hart drukgegevens zeer snel, binnen 5-10 minuten van de anesthesie inductie. Dit maakt het mogelijk om de dieren te bestuderen terwijl ze spontaan ademen kamerlucht. Een beperking van deze benadering is dat het invasief is: de dieren verdoofd, worden ze op hun rug en een katheter wordt via de halsader door het atrium in het rechter ventrikel. De beperking is het voordeel van deze procedure omdat de gegevens vertegenwoordigen directe metingen van drukveranderingen in de tijd in het rechterventrikel. Verdere technische verbeteringen, met name een beroep op miniaturisering van de prEssure katheters, een verhoging toestaan van permanente, inwonende katheters plaatsen in muizen die het mogelijk maken voor de directe opname van de pulmonale arteriële druk gedurende een aantal weken de tijd, zoals wordt uitgevoerd bij ratten 22-24 en andere grotere dieren. Wanneer insertie van een hart-katheter via de halsader in close-chested, spontaan ademende dieren is niet mogelijk, een alternatief opname van rechter ventrikel systolische druk veranderingen worden gemaakt geventileerd dieren door het openen van de borstkas en het catheter de druk via een incisie direct in het rechter ventrikel 25. Niet-invasieve metingen van het recht van de hartfunctie kan worden gemaakt met behulp van echocardiografie. Deze procedure kan worden uitgevoerd vóór het recht hartkatheterisatie of muizen kunnen worden onderzocht door echocardiografie voor meerdere malen ziekteprogressie onderzoeken vóór de invasieve metingen 5,14-17.
Een andere toepassing van deze procedure is het verkrijgen additional-gegevens. Als voorbeeld via een katheter die kan meten stromen en druk zou gelijk hartminuutvolume gelijktijdig worden gemeten met rechter ventrikel drukveranderingen. De hier beschreven procedure kan ook worden gebruikt om verder inzicht in de fysiologische, cellulaire en moleculaire veranderingen die triggers van pulmonale hypertensie dan de immuunrespons, bijvoorbeeld genetische mutaties 8,10, sigarettenrook blootstelling 26 of microbiële infecties 27-29 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW); American Heart Association, oprichters affiliate (0855943D, GG); Stony Wold - Herbert Fonds, New York (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments | ||
References
- Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
- Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
- Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
- Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
- Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
- Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
- Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
- West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
- Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
- West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
- Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
- Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
- Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
- Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
- Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
- Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
- Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
- Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
- Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
- Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
- Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
- Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
- Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
- Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
- Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
- Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
- Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
- Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).
