Summary
Eine spezifische und schnelle Protokoll gleichzeitig zu untersuchen Funktion der rechten Herzkammer, Lungenentzündung, und die Immunantwort als Lernwerkzeug beschrieben. Video und Figuren beschreiben Physiologie und Mikrodissektion Techniken in einer organisierten Team-Ansatz, anpassungsfähig an für kleine bis große Studien verwendet werden soll.
Abstract
Die Funktion der rechten Herz ist, um Blut durch die Lunge zu pumpen, was eine Verknüpfung rechte Herz Physiologie und pulmonalvaskulären Physiologie. Die Entzündung ist eine gemeinsame Modifizierer von Herz-und Lungenfunktion, durch Ausarbeitung Zellinfiltration, Produktion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, und durch Initiieren Umbauprozesse ein.
Im Vergleich zu dem linken Ventrikel, der rechte Ventrikel eine Niederdruck-Pumpe, die in einem relativ schmalen Bereich von Druckänderungen arbeitet. Erhöhte Lungenarteriendrucks sind mit erhöhten Druck in der Lunge Gefäßbett und pulmonaler Hypertonie 2 zugeordnet. Pulmonaler Hypertonie ist oft mit entzündlichen Lungenerkrankungen, z. B. chronische obstruktive Lungenerkrankung oder Autoimmunerkrankungen 3 zugeordnet. Da pulmonale Hypertonie verleiht eine schlechte Prognose für die Lebensqualität und die Lebenserwartung ist viel Forschung zum Verständnis der Mechanismen, die mig gerichtetht Ziele für pharmazeutische Interventionen 4 sein. Die größte Herausforderung für die Entwicklung von wirksamen Management-Tools für die pulmonale Hypertonie bleibt die Komplexität der gleichzeitigen Verständnis der molekularen und zellulären Veränderungen im rechten Herzen, der Lunge und des Immunsystems.
Hier präsentieren wir eine prozedurale Workflow für die schnelle und präzise Messung von Druckänderungen im rechten Herzen von Mäusen und die gleichzeitige Ernte von Proben aus Herz, Lunge und Immunsystem Gewebe. Die Methode beruht auf der direkten Katheterisierung des rechten Ventrikels über die Jugularvene in enger Oberkörper Mäuse, erstmals in den späten 1990er Jahren als Surrogat Maß für Druck in den Lungenarterien 5-13 entwickelt wurde. Die organisierte Team-Ansatz ermöglicht eine sehr schnelle rechten Herzkatheter-Technik. Dies macht es möglich, die Messungen bei Mäusen, die spontan atmen Raumluft durchzuführen. Die Organisation des Work-Flow in verschiedenen Work-Bereichereduziert Zeitverzögerung und eröffnet die Möglichkeit, gleichzeitig Physiologie Experimente und Ernte Immunsystems, Herz-und Lungengewebe.
Die prozedurale Workflow hier skizzierten kann für eine Vielzahl von Labor und Studiendesigns angepasst werden, von kleinen, gezielten Experimenten bis hin zu großen Drogen-Screening-Assays. Die gleichzeitige Erfassung von Herzphysiologie Daten erweitert, um Echokardiographie 5,14-17 und Ernte von Herz, Lunge und Immunsystem Gewebe umfassen kann reduziert die Anzahl von Tieren benötigt, um Daten, die die wissenschaftliche Wissensbasis vorwärts bewegen zu erhalten. Die prozedurale Workflow präsentiert auch hier eine ideale Basis zur Erkenntnisgewinnung der Netzwerke, die Immun-, Lungen-und Herzfunktion zu verknüpfen. Die gleichen Prinzipien hier skizzierten lässt sich an andere oder zusätzliche Organe zu studieren, wie benötigt werden.
Protocol
Ein. Vorbereitung
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen und Rohre (Tabelle 1) wie folgt:
- Hanks-Lösung, kein Kalzium, Magnesium oder Indikators mit Penicillin (100 U / ml) / Streptomycin (100 mg / ml).
- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x, kein Kalzium, kein Magnesium.
- Ethanol, 70%, 500 ml machen.
- Gepuffertem Formaldehyd, 7-10% mit PBS, 500 ml machen.
- Anästhesie-Lösungen:
- Avertin. Vorsichtig mit 5 ml 2-Methyl-2-Butanol bis 5 g 2,2,2-Tribromethanol. Einmal gelöst, halten Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nehmen 0,25 ml der Stammlösung und verdünnen Sie es mit 10 ml 1xPBS in Glasboden Flasche. Wickeln Sie die Flasche mit Aluminiumfolie, bei 37 ° C, bis sie gelöst und dann Aliquot in 5 ml Polypropylen-Röhrchen und halten im Kühlschrank. Wärmen ein Aliquot am Morgen des Experiments.
- Barbiturate. Verdünnen Stammlösung mit PBS zu geben 2,6% Barbiturat solution. Zeigen 3-4 ml Aliquots in Polypropylenröhrchen.
- Organisieren drei Work-Bereiche (Abb. 1).
- Bereich A: Ordnen Sie die folgenden Punkte: Studie Formular Studie Identifikationsnummer, Datum, Körpergewicht, Gewicht der rechten Herzens, linke Herz und Septum aufzuzeichnen; Präzisionswaage (0-50 g auf 0,01 g genau), um das Körpergewicht zu bestimmen; Mikroebene zu Herzen Gewichte bei 0,001 g genau zu bestimmen; wiegen Boote; Anästhesie-Lösungen (eindeutig gekennzeichnet), kleine Dewar mit flüssigem Stickstoff; isolierten Behälter mit Eis, Rohre und 24-Well-Platte mit Blut und Gewebeproben (Tabelle 1) zu sammeln; chirurgische Instrumente ( Tabelle 2, Abbildung 2) und Lösungen für die Instrumente (Tabelle 1) zu reinigen.
- Bereich B: Ordnen Sie die folgenden Punkte: Binokular, rechts Herzkatheter mit einem Druck Steuereinheit, die mit einem Verstärker und Laptop-Computer angeschlossen ist. Der Katheter wird in platziertein Becherglas mit Wasser. Vereinbaren chirurgische Instrumente (Tabelle 2), Teile der Naht abgeschnitten, um eine optimale Länge und in einen Wiegeschiffchen; Band (Autoklav Band ist optimal), um eine optimale Länge und Breite geschnitten und aufgereiht auf Mikroskop oder Labortisch für einfachen Zugang, Wattestäbchen und Haarentferner Lösung. Kalibrieren des Katheters zu Beginn der Studie.
- Bereich C: Ordnen Sie die folgenden Punkte: Lupe Linse; Trachealkanüle; 1 ml Spritzen; Naht abgeschnitten, um eine optimale Länge und in eine Wiegeschiffchen, kleine Dewar mit flüssigem Stickstoff; isolierten Behälter mit Eis, Rohre und 24-Well-Platte zu sammeln BAL und Gewebeproben (Tabelle 1); chirurgische Instrumente (Tabelle 2); Lösungen durchzuführen BAL und die Trachealkanüle und die Instrumente (Tabelle 1) zu reinigen.
2. Rechts Herzkatheter
- Wiegen mit der Maus über eine Präzisionswaage durch sanftes Auflegen Maus in eine Waage bHafer. Achten Sie darauf, das Tier sanft und leise zu behandeln. Notieren Gewicht. Die beschriebene Protokoll funktioniert am besten für Mäuse, die 20 g oder mehr sind, weil der Durchmesser der Jugularvene hat, um den Druck Katheters aufzunehmen, es ist möglich, kleinere Mäuse (17 g oder mehr), so lange wie die Vene katheterisieren groß genug ist.
- Betäuben die Maus durch Injektion mit Avertin je nach Körpergewicht (10 ul / g), z. B. für 20 g geben 200 ul, für 25 g geben 250 ul, 30 g geben 300 ul. Die genaue Injektionsvolumen muss angepasst je nach Mausstamm werden. Stellen Sie sicher, um das Tier schonend und leise handhaben, weil die Reaktion auf Stress des Anästhetikums verändern kann.
- Sobald die Maus sediert, am Doppel-plissierte Seidenpapier. Beachten Sie die ID-Nummer auf dem Papier. Reiben Haarentfernung Lotion in der ventralen Seite des Halses auf das Operationsfeld zu löschen. Platzieren Sie die Maus wieder auf dem Papier und warten 1-2 min.
- Entfernen Sie Haare aus dem ventralendes Halses durch sanft streichelte das Haar gegen die Richtung des Haarwuchses mit Wattestäbchen.
- Sorgfältig bestimmen die ausreichende Tiefe der Anästhesie durch Prüfen auf die Abwesenheit der Zehe Reflex: die Maus nicht, um ein Quetschen der Zehen reagieren.
- Arbeitet schnell und entspannt, sollte der Rest des rechten Herzkatheter nicht länger als 10 Minuten, 3-6 min optimal. Es ist wichtig, dass das Gewebe nicht austrocknet, da der Katheter muss in die Vene gleiten und bewegen sich in der Vene auf einer Schicht von Feuchtigkeit. Konsistenten Timing des Verfahrens ist zur Erzeugung von Daten, die zwischen den Gruppen vergleichbar sind wichtig.
- Bewegen Sie die Maus wieder auf Seidenpapier und Transfer mit Seidenpapier auf Styropor Bord. Fix Pfoten und Kopf in Ort mit Autoklaven Band.
- Machen Inzision der Haut von Mandibeln bis zum Brustbein (Brustbein).
- Sorgfältig sezieren die Schilddrüse grand nach oben zu den Unterkiefer, um die rechte Jugularvene eine freizulegennd Luftröhre.
- Ort Styropor Bord halten Sie die Maustaste unter dem Dissektionsmikroskop mit der Fokusebene bereits vor Ort und die Linse auf etwa 0,8 x Vergrößerung (totale Vergrößerung [Objektiv x Okular] ist ca. 8x.
- Sorgfältig microdissect die rechte Jugularvene durch Entfernen umliegenden Bindegewebes mit chirurgische Pinzette.
- Legen Sie zwei Stück der Naht auf der rechten Halsschlagader. Tie das Nahtmaterial am nächsten zu den Unterkiefer zum Verschließen des Blutflusses in der Vene zu einem winzigen rieseln, platzieren die Naht, die an dem Brustbein / Brustbein zu einem lockeren Knoten um die Vene am nächsten ist. Man kann die winzige Blutrinnsal verwenden, um später feststellen das Loch in der Vene, sollte dies notwendig werden.
- Atmen und zu entspannen (lockern die Muskeln im Nacken-und Unterkiefer), die Augen auf die Vene durch das Okular zu halten. Dadurch wird sichergestellt, dass Ihre Hände und Finger werden sicher bewegen, sanft und entspannt. Halten Sie die Vene mit einer Pinzette an der Seite am nächstendie Mandibeln, schnitt ein Loch in die Vene zwischen den beiden Fäden mittels Mikro-Schere mit der anderen Hand bedient. Legen Sie die Mikro-Schere, und halten diese Hand entspannt, für den Katheter spüren. Vorsichtig holen den Katheter hält ihn zwischen Daumen und Zeigefinger (Abb. 3). Legen des Katheters in das Loch der Vene.
- Gently voranzutreiben den Katheter in das rechte Herz (Abbildung 3). Beachten Sie die Kennzeichnungen in den Katheter, der einen ungefähren Index dafür, wie weit der Katheter muss eingesetzt werden geben und beobachten das Monitor. Sobald die Druckkurven angezeigt werden, vorsichtig den unteren Naht um den Katheter. Weil der Katheter eine Zugfestigkeit, die ihm eine Spule, und weil der Atmung und Herzschlag des Maus hinzuzufügen Bewegung zusätzlich Anbringung des Katheters mittels Klebeband.
- Nimm Druckmessungen für 2 Minuten für die spätere Analyse (Abbildung 4).
- Öffnen Sie die Fadenhaltemittel den Katheter, dann sanft Retrieve Katheters. Wischen Sie den Teil hinter dem Druckaufnehmer legen zurück in den Becher mit Wasser. Berühren Sie nicht die Druckaufnehmer.
- Übertragen Sie die Maus auf das Tissue-Papier zur Fläche A für die Euthanasie, Gewinnung von Blut und Milz Gewebe. Reinigen chirurgische Instrumente.
- Starten Sie den Vorgang mit dem nächsten Tier. Wenn das Timing erlaubt, injizieren die Narkose während des Wartens auf den Druckverlauf (2,15) aufzeichnen.
3. Gewinnung von Blut und Milz Proben
- Inject Barbiturat-Lösung, 400 ul pro Maus und warten 1-2 min. Diese wird routinemäßig in unserem Labor durchgeführt, um die Möglichkeit, dass die Mäuse versehentlich aus avertin-Anästhesie erholen, während ausgeblutet zu vermeiden. Entsprechende Normierung des Versuchs wird durch Einspritzen des gleichen Dosis Barbiturat Lösung pro Maus und durch Warten dieselbe Zeitdauer vor der Ernte von Blut erreicht. Wenn durch die Institutional Animal Care zulässig und Verwenden Ausschuss undSolange die Tiere sorgfältig für die Narkosetiefe vor Ausbluten überwacht, kann dieser Schritt weggelassen werden.
- Machen Einschnitt in den Unterleib. Öffnen Sie die Schwanzvene (Vena cava) und sammeln Blut mit einer Pipette.
- Entfernen der Milz, oder ein Stück der Milz in das Eppendorf-Röhrchen und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff oder in die 24-Well-Platte in eine Vertiefung, die Hanks Puffer zur späteren Herstellung von Einzelzellen.
- Übertragen der Maus auf dem Papiertuch Work-Bereich C zum Sammeln von BAL-, Lungen drainierenden Lymphknoten, Lunge und Herz Geweben. Reinigen chirurgische Instrumente.
4. Sammlung von Lunge und Herz Proben
- Sezieren die Luftröhre frei von Muskel-und Bindegewebe. Platzieren Pinzette unter der Luftröhre, ziehen Faden durch. Gently erzeugen genügend strecken, um ein Loch zu schneiden. Aufrechterhaltung der sanfte Dehnung, legen Sie die Trachealkanüle mit einem leicht Drehbewegung und Nahtmaterial Kanüle into Ort. Zum Einsetzen der Trachealkanüle, stellen Sie sicher, dass die Luftröhre feucht ist, wenn nötig einen Tropfen Hanks Lösung. Während des gesamten Verfahrens, atmen, entspannen Nacken und Kiefermuskeln zu halten Handbewegungen sicher und glatt.
- Dissect öffnen den Brustkorb durch vorsichtiges Entfernen des Brustbein ab dem abdominalen Ende. Bitte nicht stören den Inhalt des Thorax, weil das macht es sehr schwer, den Lymphknoten zu finden.
- Führen bronchoalveolären Lavage (BAL) durch vorsichtiges Einführen 1 ml Hanks-Puffer, sanft drehen Sie die Spritze und abrufen BAL. 3 Mal wiederholen, in der Nähe Rohr und auf Eis stellen. Während des gesamten Verfahrens beibehalten Augen auf dem Ende der Trachealkanüle, die mit der Spritze verbindet. Blick zum Brustkorb, um die Inflation und Deflation der Lunge zu beobachten.
- Ernte Lunge Lymphknoten durch Halterippe Käfigwand mit einem Satz von Zangen, Auffinden und Abrufen des Lymphknotens mit weiteren Pinzette. Ort Lymphknoten in 24-Well-Platte. Es ist wichtig, kJetzt, wo zu suchen: ab dem Hals, der Eingang des Brustkorbs von der rechten Seite der Maus und siehe oben der Wirbelsäule (Abbildung 5).
- Ernte Herzen und auf Seidenpapier. Isolieren Sie das rechte Herz durch vorsichtiges Sezieren neben dem Septum. Transfer zum Work-Bereich A wiegen, um das Gewicht protokollieren und Platz in Eppendorf-Röhrchen, um Einfrieren in flüssigem Stickstoff einrasten.
- Zeigen Naht um den linken Lungenflügel, die Hauptbronchus zu schließen. Sezieren den linken Lungenflügel befreit, erfolgt in Eppendorf-Röhrchen und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff, oder Ort in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Hanks-Lösung für eine spätere Isolierung einzelner Zellsuspensionen.
- Legen Sie ca. 0,5 ml gepufferter Formaldehydlösung durch die Trachealkanüle in die verbleibenden Lungenlappen. Nach Inflation, sezieren die Lungenlappen aus dem Thorax und Ort in 50 ml Röhrchen mit Formaldehyd-Lösung. Für eine alternative Studiendesigns, kann die Lunge mit opti aufgeblasen werdenmal schneiden Medien (OCT, 1:4 verdünnt mit PBS) und eingefroren in einer Form, die das unverwässerte Oktober für die spätere Herstellung von Gefrierschnitten. Eine andere Studie Design könnte notwendig Erhalt Snap gefrorenen Lungengewebe und einzelne Zellsuspensionen aus den Lungen. In diesem Fall ist keine Inflation notwendig: sezieren die verbleibenden Lungenlappen; Abrufen über dem Thorax und ebenfalls in den 24-Well-Platte in eine Vertiefung, die Hanks Puffer.
- Entfernen Trachealkanüle, sauber durch Spülen mit Hanks-Puffer, reinigen chirurgische Instrumente.
5. Analyse der Druckkurven aus dem rechten Herz-Katheter Generated
Die aufgezeichneten rechtsventrikulären Druckdaten werden mit Hilfe LabChart 7-Software ohne Wissen der Gruppe Identität jeder Aufnahme. Mehr als 20 Kurven werden zufällig ausgewählt und die Differenz zwischen maximaler und minimaler ventrikulären Drucks für jede Kurve gemessen (AP). Die durchschnittliche AP berechnet wird, um das Recht geben, ventricular systolischen Druck.
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Representative Results
Der primäre Endpunkt zum Erhalten rechte Herz Druckkurven wird durch die korrekte Position des rechten Herzens Katheters erreicht. Die Form der Druck-Zeit-Kurven ist kritisch, da die richtige Plazierung des Katheters im Inneren des rechten Ventrikels in Druckplateaus führen wird (Abbildung 4). Spiky Kurven stattdessen zeigen einen Katheter, der durch die Atmung oder Herzschlag Bewegung gegen die Wand des rechten Ventrikels bewegt wird. Um mögliche Schwierigkeiten bei der Stufe der Überleben der Tiere zu erfassen, muss die Standardabweichung des AP und der Herzfrequenz zu berechnen. Beide Werte werden voraussichtlich nicht signifikant unterschiedlich zwischen den Behandlungsgruppen. Darüber hinaus ist die Erwartung, dass die AP-Werte und die Herzfrequenz zeigen keine Drift über die Aufnahmezeit. Zum Beispiel würde langsam ansteigenden AP Werte zeigen hypoxische pulmonale Vasokonstriktion 18-20. Sinkende Herzfrequenz würde indicate, dass das Niveau der Narkose zu hoch, die zum Tod des Tieres ist. In unserem Labor verschiedene Menschen führen Sie das Verfahren. Über alle Gruppen von Mäusen wir routinemäßig zu erreichen 90-95% Erfolgsquote bei der Erlangung des rechten Ventrikels Druckdaten.
Obwohl das Erlernen des Verfahrens ist es am besten mit älteren weiblichen Mäusen (25-30 g und mehr), die eine größere Halsschlagader haben und dazu neigen, weniger subkutanen Fettdepots als männliche Mäuse haben zu starten. Der beste Weg, um die Platzierung des Katheters zu ermitteln ist, um das Tier, sobald der Katheter in der Vene gesichert euthanize. Präparieren des Tieres ausgehend von dem Herzen direkt zu visualisieren die Platzierung des Katheters. Dies wird dadurch wesentlich erleichtert Problemlösung.
Das erste Ergebnis zum Erhalten BAL-Flüssigkeit ist die korrekte Platzierung der Trachealkanüle. Dies wird durch das Aufblasen der Lunge, wenn Hanks Puffer eingeflößt wird, und Ablassen der Lungen indiziert, wenn die Schwabbelscheibeer entfernt wird. Die erwartete Erholung liegt bei 70-80% der instillierte Volumen bei den Kontrolltieren, weniger (bis zu 50%) bei Tieren, die Entzündung der Lunge haben. Schaum auf der Oberseite der BAL-Flüssigkeit gewonnen zeigt die Anwesenheit von Tensid ist. Blutkontamination des wiedergewonnenen BAL-Flüssigkeit erfolgt entweder aufgrund des Vorhandenseins von signifikanten Lungenentzündung, oder weil Instillation und Rückgewinnung der Waschflüssigkeit zu schnell. Es ist bemerkenswert, dass einige akute Maßnahmen von Verletzungen in der Lunge durch die BAL Verfahren induziert werden kann. Wenn die experimentellen Designs ist es, diese akute Verletzung Parameter und Prüfung der BAL ist auch wichtig, zu verstehen, dann ein Lungenflügel muss abgebunden und vor der Durchführung BAL entfernt.
In der hier gezeigte Verfahren, ernten wir Lungengewebe für die Histologie ohne standardisierte Inflation und Durchblutung der Lunge. In Fällen, wo exakte histologische Morphometrie ist die große Auslesen, sollte die Lungen über die Luftröhre, und pe aufgeblasen werdenrfusion sollte über die Lungenarterie, die alle unter standardisierten Druck durchgeführt werden.
Im Protokoll angezeigt, wird das Herz präpariert, um den Fulton Index als Maß für rechte Herz-Hypertrophie (Gewicht der rechten Herzkammer / Gewicht des linken Ventrikels und Septum) bereitzustellen. Darüber hinaus werden neue Verfahren entwickelt, die auf histologische Untersuchung des rechten Herzens basiert. Emerging histologischen Maßnahmen rechten Herzhypertrophie sind a) die Anzahl der Kerne in einem definierten Bereich von zufällig ausgewählten rechten Herzen, und b) Zählungen von Gefäßen und fibrotischer Index pro Fläche des Herzens.
In unserem Labor wird die korrekte Wiederherstellung der Lunge Entleerung mediastinalen und tracheobronchialen Lymphknoten (Abbildung 5) routinemäßig mittels Durchflusszytometrie überprüft werden, da diese Gewebe sind sehr klein in Kontrollmäusen. Jedoch, je nach Mikrobioms im Gehäuse der Anlage und Alter der Tiere, die Größe der Lymphknoten in unchallenged kann Kontrollmäusen ausreichend groß für nur eine visuelle Bestätigung. Bei der Überprüfung mittels Durchflusszytometrie, müssen Lymphknotenzellen von Thymozyten unterscheiden. Durch Zufall kann der Thymus leicht zusammen mit den Lymphknoten abgetastet werden, da der Thymus und die Lymphknoten in der Nähe zueinander und befinden sich innerhalb des Brustkorbs enthalten. Der Unterschied ist, dass die Thymusdrüse der Nähe des Brustbeins und der Lymphknoten nahe der Wirbelsäule angeordnet ist. Weitere Herausforderung ist, dass die Thymusdrüse sehr groß ist, enthält viel mehr Zellen als die kleinen Lymphknoten. Thymozyten leicht aus Lymphknotenzellen mit Durchflusszytometrie und CD3, CD4 und CD8-Marker unterschieden werden. Lymphknoten haben charakteristisch CD3 +-Zellen, sind die meisten davon entweder positiv für CD4 oder CD8. Im Gegensatz dazu ist die Mehrzahl von Thymozyten für alle drei Marker positiv (CD3 +, CD4 +, CD8 +). Weitere ausführliche Informationen über die Lokalisation der Maus Lymphknoten können im Manuskript gefunden werden durchvan den Broeck et al. 21.
Konsistenten Zeitsteuerung jedes Haupt Verfahrensschritt (Herzkatheter, Rückgewinnung von Blut und Milz, Ernte der BAL-, Lungen und Herzgeweben) ist entscheidend für die Erzeugung von Daten, die für robuste Vergleichs zwischen Behandlungsgruppen ermöglicht. Daher empfiehlt es sich, mindestens zwei und drei besten Ermittler, um das Experiment zu erreichen zusammenarbeiten. Weiterhin ist es wichtig, dass die Forscher die Verfahren ausführen, ohne Kenntnis der Identität der Gruppe der Tiere. Daher hat die Identifizierung der Daten in einer Weise, die die Gruppenidentität verdeckt erfolgen. Schließlich ist es auch wichtig, dass die Reihenfolge, in der die Tiere randomisiert werden analysiert ist. Beispielsweise ist eine einfache Identifikator das Datum des Experiments und fortlaufende Numerierung der Tiere. Wenn es zum Beispiel gibt 4 Gruppen von Tieren (AD), weisen Identifizierung und Untersuchung der Tiere in der folgenden Reihenfolge: date_1: Aa, date_2: Ba, date_3: Ca, date_4: Da, date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: Cb, und so weiter.
Diese experimentelle Flow ermöglicht eine in-Tiefe, die gleichzeitige Untersuchung der molekularen Mechanismen, die Lungenentzündung und Funktion der rechten Herzkammer zu kontrollieren. Die gleichzeitige Daten-und Probennahme erzielt bessere Erkenntnisse über molekulare Netzwerke, und eine Verringerung in der Anzahl der Tiere erforderlich, um neue biologische Wissen erhalten.
| Art der Rohr / Becher | Solution (Volumen) | Nutzung | |||
| Verarbeitung von Blut | |||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Blut für Serum | ||||
| EDTA beschichteten 2,0 ml | Blood for plasma | ||||
| Eppendorf, 0,5 ml | Einfrieren Serum oder Plasma | Verarbeitung von BAL | |||
| Polypropylen, runder Boden, 4,5 ml | Sammle Bronchalveolarlavages | ||||
| Polypropylen, runder Boden, 4,5 ml | Frieren BAL Überstand | ||||
| 96-Well-Platte, skirted | BAL-Zellen | ||||
| Verarbeitung von Gewebe | |||||
| Polypropylen, 50 ml | Formaldehyd, 7,5 ml | Fix Lungengewebe | |||
| Eppendorf, 1,5 ml | Schnellfrostmedium Lungenflügel | ||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Schnellfrostmedium rechten Herzens | ||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Schnellfrostmedium linken Herzens | ||||
| 24-Well-Platte | Hanks-Puffer, 0,5-1 ml | Quick-Speicherung von Lungenlappen für spätere isolation von Einzelzellen | |||
| 24-Well-Platte | Hanks-Puffer, 0,5-1 ml | Schnelle Speicherung von Milz für die spätere Isolierung einzelner Zellen | |||
| 24-Well-Platte | Hanks-Puffer, 0,5-1 ml | Schnelle Speicherung von Lymphknoten für die spätere Isolierung einzelner Zellen | |||
| Zum Verfahren | |||||
| Becherglas, 300 ml | Wasser autoklaviert | Feuchtigkeitsspendende und Reinigung Katheters | |||
| Polypropylenrohr, 50 ml | Hanks-Puffer, 50 ml | Führen BAL | |||
| Polypropylenrohr, 50 ml | Hanks-Puffer, 50 ml | Waschen Trachealkanüle | |||
| Polypropylenrohr, 50 ml | Desinfektionslösung | Reinigung von Instrumenten | |||
| Polypropylenrohr, 50 ml | 70% Ethanol | Cleaning Instrumenten | |||
| Polypropylenrohr, 50 ml | Leitungswasser | Reinigung von Instrumenten | |||
Tabelle 1. Vorbereitung und Organisation von Rohren und Lösungen.
| Instrument | Beschreibung | Verwenden |
| Schere | gerundet oder gerade 5,5 Zoll, rund oder scharfen Enden | Bereich A |
| Schere | Abgerundet 4,0 Zoll, scharfen Enden | |
| Zange | 4,5 Zoll, gebogen, mit flachen, Greifen Enden | |
| Zange | 4,0 Zoll, gebogen, mit flachen, Greifen Enden | |
| Schere | Schlank Blades/Angled- 9 cm | Bereich B |
| Micro-Schere | Lieferwagennas Federschere - 2 mm Blades | |
| Zange | Pinzette (Dumon Nr. 5 Fine) | |
| Zange | 4,0 Zoll, gebogen, mit flachen, Greifen Enden | |
| Zange | 4,0 Zoll, gerade, mit flachen, Greifen Enden | |
| Naht | Braided Seidennaht 6-0 | |
| Katheter | Druckkatheter | |
| Schere | gerundet oder gerade 5,5 Zoll, rund oder scharfen Enden | Area C |
| Schere | Abgerundet 4,0 Zoll, scharfen Enden | |
| Zange | 4,5 Zoll, gebogen, mit flachen, Greifen Enden | |
| Zange | 4,0 Zoll, gebogen, mit flachen, Greifen Enden | |
| Hohlnadel | Trachealkanüle | |
| Naht | Braided Seidennaht4-0 |
Tabelle 2. Organisation der Instrumente, Nahtmaterial, Katheter, Trachealkanüle.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Arbeits-Bereichen. A) Work-Bereich A zur Aufzeichnung, Wiegen, Gewinnung von Blut und Milzgewebe und vorübergehenden Halten Platz für die Tiere. B) Werk-Gebiet B zur rechten Herzkatheter. C) Werk-Bereich C für die Ernte von BAL, Lunge, Lymphknoten-Lungen und Herzgeweben.
.. Abbildung 2 Instruments für das Verfahren a) verwendeten Instrumente für die Arbeit-Bereich A, B) Instrumente zur rechten Herzkatheter (work-Bereich B), C) instruments für Arbeit-Bereich C. D) Trachealkanülen. Das Lineal zeigt die Größe der Instrumente.
Abbildung 3. Rechts Herzkatheter. Rechts-Herzkatheter mit Markierungen und Klebeband (A) gezeigt, oder mit der Hand gehaltene (B). Die Bleistiftspitzen den Markierungen auf dem Katheter (A) hergestellt. Einführen des Katheters (CE): Reinigung der rechten Jugularvene (C); vernäht Vene mit einer Pinzette gehalten wird, wird in Richtung Katheter ein Loch zuvor in die Vene (D) gemacht vorgeschoben; Katheter nach dem Einsetzen in die Vene (E). Pfeile zeigen auf dem Katheter (D, E).
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Abbildung 4. Probe Spur von Druckänderungen in das rechte Herz. Die Spuren zeigen Druckänderungen (mmHg) über die Zeit (min: sec), die Software zeigt jede der Kurven mit zwei verschiedenen Geschwindigkeiten. Die Spuren einer Kontrollmaus (A) und eine Maus mit Entzündung induzierten pulmonalen arteriellen Hypertonie Remodellierung und (B) gezeigt. Kurven für die Messung des rechten ventrikulären systolischen Druck verwendet werden hervorgehoben. Beachten Sie die klare Druckplateaus in den markierten Kurven. Der Pfeil zeigt auf einer Kurve, die eine Spitze, die einen technischen Fehler hat. Diese stacheligen Arten von Kurven können nicht für die Messung der rechtsventrikulären systolischen Drucks verwendet werden. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Abbildung 5. Lage eines mediastinalen / tracheobronchial Lymphknoten relativ zum Brustkorb und Wirbelsäule. Der Pfeil zeigt auf die Lymphknoten.
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Discussion
Die experimentelle Strömung hier skizzierten ermöglicht eine schnelle und gleichzeitige Messung der rechten ventrikulären systolischen Druck und Ernte von Proben für die Analyse der Antworten in der Lunge, des Herzens und des Immunsystems bei Mäusen. Das Verfahren kombiniert Herzen Physiologie Messungen Mikrodissektion und anschließende Gewebe Ernte für Studien an lebenden Zellen, histologische Analyse oder omics-Analyse der Gewebe. Der gesamte Vorgang dauert weniger als 20 Minuten pro Maus. Wegen der Arbeit-Bereich organisierten Workflow können 2-3 Tiere gleichzeitig untersucht werden. Daher ist das Verfahren geeignet für kleine, gezielte Versuche 12 und große Bildschirme in einer Vielzahl von Einstellungen durchgeführt werden, von einem kleinen Labor in einem großen pharmazeutischen Studie.
Die Kombination von Herz Physiologie Messungen und Gewebe Ernte eröffnet die Möglichkeit zur Analyse biologischer Netzwerke, die steuern, nachzuweisen oder zu synchronisieren Herzen durchzuführen, Lungen and Immunfunktion, unter Verwendung transgener und KO-Maus Ressourcen. Ein wichtiger Vorteil der gleichzeitigen Prozedurablauf ist die Verringerung in der Anzahl der Tiere pro Studie erforderlich. Eine weitere Anwendung dieser prozedurale Workflow ist die Möglichkeit, andere oder zusätzliche Organe von demselben Tier zu studieren, wie gebraucht.
Das hier beschriebene Verfahren erzeugt rechten Herzens Druckdaten sehr schnell, innerhalb von 5-10 min Narkose. Dies macht es möglich, die Tiere zu untersuchen, während sie atmet Raumluft werden spontan. Eine Begrenzung des Ansatzes ist, dass sie invasiv ist: die Tiere narkotisiert, werden sie auf den Rücken gelegt, und ein Katheter über die Jugularvene durch das Atrium in den rechten Ventrikel geleitet. Die Begrenzung ergibt sich der Vorteil dieses Verfahrens, da die Daten der direkten Messungen repräsentieren Druckänderungen über die Zeit in dem rechten Ventrikel. Weitere technische Verbesserungen, insbesondere unter Berufung auf die Miniaturisierung des prEssure Katheter, können zulassen, dauerhaft, Verweilkatheter in Mäusen, die für die direkte Aufnahme des Pulmonalarteriendruck über mehrere Wochen Zeit zu ermöglichen, wie dies in 22 bis 24 Ratten und anderen größeren Tieren durchgeführt platzieren. Wenn Einsetzen eines Herz-Katheter durch die Halsschlagader in enger Oberkörper, spontan atmenden Tieren nicht möglich ist, kann eine alternative Aufnahme von rechtsventrikulären systolischen Druck Veränderungen in belüfteten Tieren durch Öffnen des Brustkorbes und platzieren den Druck Katheter durch eine gemacht werden Inzision direkt in den rechten Ventrikel 25. Non-invasive Messungen der Funktion der rechten Herzkammer können mit Echokardiographie werden. Dieser Vorgang kann entweder vor der rechten Herzkatheter durchgeführt werden, oder Mäusen durch Echokardiographie für mehrere Male um den Krankheitsverlauf vor den invasiven Messungen 5,14-17 studieren untersucht werden.
Eine weitere Anwendung dieses Verfahrens ist es, zu erhalten additional Daten. Als ein Beispiel unter Verwendung eines Katheters, der fließt und Druck messen kann, könnte rechte Herz Ausgang gleichzeitig aufgezeichnet werden zusammen mit rechten Herzens Druckänderungen. Das hier beschriebene Verfahren kann auch zur weiteren Verständnis der physiologischen, zellulären und molekularen Veränderungen, die Trigger von Lungenhochdruck andere als die Immunantwort sind z. B. genetischen Mutationen 8,10, Zigarettenrauch Exposition 26 oder mikrobiellen Infektionen 27-29 werden .
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
R01HL082694 (JW);; American Heart Association, Founders affiliate (0855943D, GG); Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG) finanziert Stony Wold - Herbert Fund, New York (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments | ||
References
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