Summary
Ektopisk udtryk er en teknik til at belyse microRNA rolle i hjernens udvikling. Men rettet mod specifikke områder ved hjælp af in ovo elektroporation er udfordrende. Her viser vi en effektiv måde til selektivt elektroporere ventrale og dorsale midthjernen regioner.
Abstract
Ikke-kodende RNA er yderligere spillere i regulering af genekspression. Målrettet in ovo elektroporation specifikke områder giver et unikt værktøj til rumlige og tidsmæssige styring af ektopisk microRNA udtryk. Men er temmelig svært at nå for eventuelle manipulationer ventrale hjernens strukturer som ventrale midthjernen. Her viser vi en effektiv måde at elektroporere miRNA i ventrale midthjernen hjælp af tynde platinelektroder. Denne metode giver en pålidelig måde til at transficere bestemte områder af midthjernen og et nyttigt redskab til in vivo-undersøgelser.
Introduction
Anerkendelsen af små ikke-kodende RNA som ekstra spillere til genekspression lanceret en ny kompleksitet til genomisk programmering / genregulering. Forskellige arter af ikke-kodende RNA har funktionel betydning i neurale celler, herunder små ikke-kodende RNA 1-4. MicroRNA (MIR eller miRNA) for eksempel viser forskellige og skiftende udtryk profiler i udviklingslandene hjerner 5. Målrettet in ovo elektroporation af kyllingeembryoer giver en enestående mulighed for tidslige og rumlige kontrol af genekspression og lyddæmpning under udviklingen.
Denne video viser de forskellige trin i at udføre ektopisk udtryk for Mirs i bestemte områder af chick midthjernen hjælp i ovo elektroporation 6-10. For at sikre en langvarig effekt af disse små ikke-kodende RNA i cellerne, blev DNA-sekvensen af Mirs klonet i mono-eller bi-cistroniske vektorer. For i ovo elektroporation, miR indeholdende vektor injiceres i midthjernen neuralrøret ved at udsætte embryo efter at et lille vindue i æggeskallen. Til transfektion af specifikke områder af midthjernen lille plus (anode) og minus (katode) Platin elektroder placeres på bestemte positioner. For ventrale midthjernen transfektion, er anoden placeret under den venstre ventrale midthjernen og katoden over den højre halvdel af midthjernen, før påføring af en strøm. Åbningen i æggeskallen er lukket med tape og embryoner inkuberes i så længe som nødvendigt for enhver analyse. Denne metode blev oprindeligt beskrevet af Muramatsu et al. 6 og forbedret af Momose et al. 8 for specifikt område transfektion.
Skematisk oversigt.
- Embryoet i ægget er eksponeret ved at skære et lille vindue i the æggeskal.
- Det opløste vektor (er) injiceres i midthjernen under anvendelse af en mikrokapillarbøsninger.
- To elektroder - placeret parallelt eller over og under embryo - generere et pulserende elektrisk felt.
- Det elektriske felt tidsmæssigt skaber porer i cellemembranen, der letter indgang i cellen ved den negativt ladede DNA (eller RNA), tiltrækkes til anoden 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Krav til In ovo Elektroporation
- Forberedelse af Vektorkonstruktionen: miR sense-og antisense-primere blev udformet efter instrukser fra Ambion, udglødet og ligeret i Apal / EcoRI fordøjet pSilencer U6.1 vektor. Efter vellykket transformation en af de resulterende kloner blev dyrket og pSilencer plasmid blev isoleret ved basisk lysis metoden i en Quiagen midi forberedelse kit.
- Elektroder: Elektroder kan købes eller nemt blive bygget 13. Vi bruger self-made elektroder af platin wire (Φ = 0,2, 0,25 eller 0,5 mm i diameter) eller i nogle tilfælde en endnu mindre wolfram tråd elektrode (Φ = 0.1 mm) 8 afhængig af hvilket område, vi ønsker at elektroporere. For at undgå svidning af væv, vi bruger som regel tættere på vævet tyndere elektroderne. For bred elektroporation af midthjernen, bruger vi 0,5 mm platin ledninger loddet til en messing / rustfrit stål rørformetaksel og fastgjort til en elektrode holder med en afstand på 3-5 mm (figur 1). At elektroporere specifikke områder, vi bruger 0,25 mm platin trådanoder og 0,2 mm platintråd eller 0,1 mm wolfram for katoden med en omtrentlig afstand af 1 mm eller mindre.
- Løsninger: Har følgende løsninger ved hånden:
- Autoklaveret kylling Ringer, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g KCI, 0,24 g CaCl2, opløses i 1 L destilleret vand).
- PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCI, 0,24 g KH 2 PO4 1,44 g Na 2 HPO 4, opløses i 1 liter destilleret H2O).
- Fast Green: stamopløsning 10 mg / ml destilleret H2O
- Langsom tørring blæk (mindre shellak og dermed mindre forgiftning af fosteret). Bemærk: En blå dikroisk filter fastgjort til et fiberoptisk lampe som beskrevet i Canto-Soler og Adler 14 forbedrer kontrasten og kan eliminere behovet for at injicere blæk.
Figur 1. Skematisk diagram af elektroder og elektrode holder. (A, B, C) platintråd blev loddet til den ene side af en rustfri stål rørformet skaft. Et hul blev boret ind i den anden side af det rørformede aksel således, at bens stik kan passe ind (A) Rød og blå farvede ledninger var forbundet til pin stik. I den modsatte ende af ledningen var monteret på banan stik, der arbejder med de elektriske stikkontakter i elektroporator. (A, C) platintråden blev bøjet i en engel på 90 °. Et lag af neglelak isoleret akslen over bøjningen.
2. Forberedelser Direkte før i ovo Elektroporation
- Forbered følgende materiale:
- Fortynd Ink med kylling Ringer 1:6 tilføje Antibiotika-antimycotisk opløsning (100x fra Gibco) 1:100.
- Vektor løsning Forbered: 1-2 pg / pl pr specifikke DNA i H 2 O suppleret med Fast Green (1:20).
- Sterilisere pincet, saks, wolfram nål og elektroder med 70% ethanol.
- Træk mikropipetter for nukleinsyre injektion fra borsilicatglashulsfærer kapillærer (længde til udvendig diameter: 100 mm x 0,9 mm). Vi anvender en simpel aftrækker PUL-1 (WPI, Berlin) med indstillingerne vist i tabel 1.
- Indstil parametre elektroporator som vist i tabel 2.
| Parametre | Værdier |
| Hede | 350 |
| Træk | 100 |
| Velocity 50 | |
| Delay | 200 |
Tabel 1. Indstillinger for PUL-1
| Parametre | Værdier |
| Frekvens | 50 Hz |
| Delay | 20-50 msek * |
| Bredde | 20 msek |
| Spænding | 8-25 V * |
| Pulse | 3 - 5 gange |
| * Afhængig af elektrode diameter og afstand. Venligsttage hensyn til når ændre en af parametrene. | |
Tabel 2. Indstillinger for Pulse Stimulator
- Forbered chick embryoner til elektroporation:
- Inkuber befrugtede hønseæg på deres lange side ved 37 ° C med 65% fugtighed for 39 timer for at erhverve embryoner mellem Hamburger & Hamilton (HH) iscenesætter 15 9-11. Fosteret afregner på den øverste del af ægget, så du skal markere det med en blyant linje.
- Desinficere æggene med 70% ethanol.
- Gennembore ægget på dets bredere side, hvor luften hulrum skal være.
- Tag 1-2 ml æggehvide. Dette vil frigøre foster fra æggeskallen.
- Cello-tape æggeskallen for at undgå granatsplinter falder ned embryoet. Brug en saks til at klippe et lille vindue i æggeskallen omkring blyant linje.
- Sprøjt lidt blækunder området opaca at visualisere embryoet.
- Lav et snit i vitellinmembranen med en skærpet wolfram nål for at opnå en bedre tilgængelighed af embryonet for nukleinsyre injektion og elektroporation.
3. Elektroporation og inkubation
- Tilføj et par dråber varm Ringers opløsning på embryoner. Dette vil nedsætte embryonet, forhindre overophedning, stikning af elektroderne til vævet og give et medium for den strøm mellem to elektroder.
- Injicer vektor opløsning ind i lumen af neuralrøret på midthjernen plan. Hvis DNA-ekspressionsvektor indeholder reportergen (f.eks EGFP), der tilsættes lidt lavere koncentreret reportergen-vektor (1 pg / pl miR ekspressionsvektor til 0,9 pg / pl reportergen vektor) til DNA-opløsningen. Dette vil sikre, at du genkende transficerede celler senere 8. Vi bruger den såkaldte pCAX vektor, en slags gave from C. Krull 13..
- For en bred transfektion af midthjernen, placeres elektroderne til venstre og højre for embryo på højden af midthjernen. Afstanden mellem elektroderne skal være omkring 3-5 mm. De andre indstillinger er 15V, 20 msek impulser og 50 msek forsinkelse for HH 10.. Ændring af placeringen af de to elektroder lidt langs dorso-ventrale (DV) akse midthjernen sikrer en mere bred transfektion af celler DV akse transfektion.
- For ventrale transfektion, tilføje nogle Ringer til at hæve hovedet fra blommen membranen og placere anode under ventrale midthjernen. Hvis hovedet ikke stiger skubbe elektroden under membranen, der adskiller æggeblomme og embryo at undgå svidning af neuralrøret. Katoden skal placeres over midthjernen dorso-lateralt modsat anoden. Rør ikke neuralrøret. Vi transfektion venstre ventrale halvdel af midthjernen for at undgå eventuelle problemer med hjerte udvikling. Afstanden mellem elektroderneer omkring 1-0,5 mm, resten af indstillingerne 10V, 20 ms bredde og 50 msek forsinkelse.
- Påfør en anden dråbe Saline oven af embryonerne at køle det ned og fjerne luftbobler.
- Forsegl æggene med tape og inkuberes i mindst 4 timer, den mindste tid, der kræves til vektor udtryk.
4.. Fiksering af kyllingeembryoner
- Fjern embryoner fra deres æg.
- Rene embryoner under et stereomikroskop og vurdere omfanget af transfektion med en fluorescerende stereomikroskop.
- Fastgør embryoner over nat i 4% PFA ved 4 ° C. Fortsæt med skæring og / eller farvning (in situ hybridisering, immunhistokemi) at analysere ændringer i den transficerede område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Omfanget af midthjernen område transficeret med miR er synlig gennem ekspressionen af GFP fra en reportervektor injiceres sammen med miR udtrykker vektoren (figur 2). Brug af platinelektroder med en diameter på 0,5 mm, og placeres parallelt med AP akse midthjernen fører normalt til transfektion af et bredt område langs DV-og AP-aksen, herunder baghjerne, midthjernen og undertiden diencephalon (figur 2A og B). Størrelsen af elektroderne resultater i en lang elektrisk felt anvendes til hjernen regionen og dermed en bred transficeret område.
Det er vanskeligt præcist at målrette et område som for eksempel den ventrale midthjernen. Reduktion af afstanden mellem 0,5 mm elektroder for at opnå en mindre elektrisk felt ofte er giftigt for embryo og fører til artefakter. Vi brugte elektroder med mindre diametre (0,2 mm, 0,25 mm platin eller 0,1 mm skærpet wolfram wire), som tilbyder mere lokalt transfection som af den ventrale hjernen, som er vanskeligt at nå (figur 2C-I). Mindre elektroder reducere det elektriske felt anvendes, og gør det muligt at indsætte elektroderne meget tættere på vævet. Figur 2F viser et eksempel, hvor hele ventrale midthjernen var blevet transficeret. I figur 2G og 2H de transfekterede ventrale områder er mindre, men en del af baghjerne (2F) eller Mellemhjerne (2H) er også transficeret. I figur 2G, er anoden placeret under midten og baghjerne at transficere begge ventrale områder. Figur 2H viser et eksempel på en anode ikke godt isoleret med neglelak langs akslen. Det er således ikke kun den ventrale området omkring MHB udtrykker miR / GFP, men også den dorsale forreste MES-og di-hjerne, hvor akslen af anoden var blevet anbragt. Den specifikke ventrale miR / GFP fordeling i figur 2C-I er et resultat fra det lokaleelektrisk felt vi anvender med de mindre elektroder. Tilsammen med mindre elektroder og elektriske felter, vi kan udtrykke DNA / RNA i mere begrænsede områder som ventrale midthjernen.
Da vores microRNA ekspressionsvektor indeholder reportergenet, vi blander i en GFP ekspressionsvektor i et forhold på 1 pg / pi til 0,9 pg / pl, hhv. Den næsten lige forhold sikrer, at microRNA og GFP transficeret område næsten helt overlapning (se Momose et al. 8 og egne erfaringer). At være i stand til at vurdere omfanget af det transficerede område bliver vigtig, når kun et lille område, der indeholder specifikke celletyper transficeres eller transficerede celler anvendes til QRT-PCR. En meget mindre koncentration af reportergenet kan føre til celler, der udtrykker GFP under detektionsgrænsen. Styrken af ekspression af enhver transficeret vektor ikke kun afhænger af koncentrationen af den anvendte vektor, men også på promotoren. Vores vektorer er U6-promoter driven (udtrykker miRNA) og SS-actinpromotor drevet (udtrykker fluorescerende proteiner), og er både allestedsnærværende og konstitutivt aktive i chick embryo.
De fleste af vores embryoer elektroporeret i venstre side med undtagelse af figur 2C (spejlbillede). Til tidsforskudte eksperimenter, anbefales elektroporation af den højre side af embryonet, da de fleste fostre vende hovedet mod højre og ligge på deres venstre side.
Figur 2. Repræsentative resultater. Embryoer blev elektroporeret mellem HH10 og HH11 og fastsættes på de stadier, der er angivet i billederne. (AC) viser elektroporeringer af dorsale midthjernen og (DI) af ventrale midthjernen. Pilene i (D, E) angiver ventralt placeret, GFP-positive celler. For flere detaljer se tekst. Mes- Mesencephalon / midthjernen, Di - Mellemhjerne, Tel - telencephalon, Rhom - rhombencephalon / baghjerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne video viser en effektiv metode til at transficere plasmid ind i de neuroepitelceller for specifikke områder af chick midthjernen. Rektangulære elektriske impulser med lav spænding kan indføre DNA i celler af chick neuralrøret in ovo 6,16. Imidlertid er nøjagtigheden af DNA målretning ofte hindret af den brede elektriske felt, som stiger op gennem de relativt store elektroder (Φ = 0,5 mm). Vi forsøgte at løse dette problem ved hjælp af elektroder mindre i diameter følge retningslinjerne i Momose et al. 8.. For ventrale midthjernen transfektion, vi placere katode under membranen af området pellucida eller hvis en alder af fosteret gør det direkte under den ventrale midthjernen. Det sidste scenarie kræver en smule øvelse, da midterhjerne / neuralrøret væv ikke må blive rørt og beskadiget af anoden. Tilføjelse Ringer kan ofte hjælpe til at løfte hovedet af foster lidt væk fra membran, der dækker området pellucida.
Skønt at overveje, er gen-koncentrationer i cellen. Andet gen doser kan have forskellige virkninger på celler og væv. Der kan være en tærskel involveret effekt (se Agoston et al. 17., for eksempel) eller forskellige, sorterede effekter. Vi normalt tester forskelleje koncentrationer af miR udtrykker (0,5-2 ug / ul) vektor og analysere ændringer i morfologi eller protein / gen-ekspression. Virkninger kan testes in vivo under anvendelse af immunhistokemi sensor vektorer 18 eller RNA in situ hybridisering.
Denne teknik giver også for at teste styrke og placering af enhver aktivitet af en specifik miR in vivo ved hjælp af for eksempel en dobbelt fluorescens reporter / sensor vektor som beskrevet i De Pietri Tonelli et al. 18.. De bruger en vektor, der indeholder et GFP-reporter og en RFP miR sensor. RFP efterfølges af en gratis miR sekvens. Mens GFP udtryk identificerer held transficerede celler, rød fluorescens (RFP) angiver fraværet af den undersøgte miR, og forsvinden af rød fluorescens røber tilstedeværelsen af miR. Denne teknik kan også anvendes til at teste specificiteten af miR målet in vivo ved hjælp af 3'UTR af målsekvensen nedstrøms for RFP.Tilsammen denne teknik er meget passende for udviklingsmæssige undersøgelser af genekspression og funktion i forskellige væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender K. Mikic, der har bidraget til den indledende fase af denne film og M. Nicolescu for miR billedet. C. Huber blev støttet af et fællesskab af IZKF af Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand af Fortune program Universtitätsklinikum Tübingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope - fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
- Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
- Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
- Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
- Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
- Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
- De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
