Summary
Ectopische expressie is een techniek om de microRNA's rol in de ontwikkeling van de hersenen toe te lichten. Echter, gericht op specifieke gebieden met behulp van in-ovo elektroporatie is een uitdaging. Hier tonen we een efficiënte manier om selectief electroporate ventrale en dorsale middenhersenen regio.
Abstract
Niet-coderende RNA's extra spelers regulatie van genexpressie. Gerichte in ovo elektroporatie van specifieke gebieden biedt een uniek instrument voor ruimtelijke en temporele controle van een buitenbaarmoederlijke microRNA expressie. Echter, ventrale hersenstructuren zoals ventrale middenhersenen zijn nogal moeilijk te bereiken voor eventuele manipulaties. Hier tonen we een efficiënte manier om miRNA electroporate in ventrale middenhersenen met behulp van dunne platina-elektroden. Deze werkwijze biedt een betrouwbare manier om specifieke gebieden van de middenhersenen en een nuttig instrument voor in vivo studies transfecteren.
Introduction
De erkenning van kleine niet-coderende RNA's als extra spelers voor genexpressie gestart met een nieuwe complexiteit om genomische programmering / genregulatie. Verschillende soorten niet-coderende RNA's zijn functioneel belang neurale cellen, waaronder kleine niet-coderende RNA's 1-4. MicroRNAs (miR of miRNA) bijvoorbeeld tonen verschillende en veranderende expressie profielen in ontwikkelende hersenen 5. Gerichte in ovo elektroporatie van kippenembryo's biedt een unieke gelegenheid voor de ruimtelijke en temporele controle van genexpressie en silencing tijdens de ontwikkeling.
Deze video toont de verschillende stappen van het uitvoeren van ectopische expressie van miRs in specifieke gebieden van het kuiken middenhersenen behulp van in-ovo elektroporatie 6-10. Om een langdurig effect van deze kleine niet-coderende RNA in cellen waarborgen, de DNA sequentie van miRs werden gekloneerd in mono-of bi-cistronische vectoren. Voor de in ovo elektroporatie, miR met vector wordt geïnjecteerd in de middenhersenen neurale buis door het blootstellen van het embryo na een kleine venster in de eierschaal. Op specifieke gebieden van de middenhersenen kleine plus (anode) en min (kathode) transfecteren platina-elektroden worden geplaatst op specifieke posities. Voor ventrale middenhersenen transfectie, wordt de anode geplaatst onder de linker ventrale middenhersenen en de kathode boven de rechterhelft van de middenhersenen alvorens een stroom. De opening in de eierschaal is afgesloten met tape en embryo's geïncubeerd zolang als nodig is voor analyse. Deze methode werd oorspronkelijk beschreven door Muramatsu et al.. 6 en verbeterd Momose et al.. 8 specifieke gebied transfectie.
Schematisch overzicht.
- Het embryo in het ei wordt blootgesteld door het snijden van een klein venster in the eierschaal.
- De opgeloste vector (en) wordt geïnjecteerd in de middenhersenen behulp van een micro capillair.
- Twee elektroden - parallel of onder en boven het embryo geplaatst - genereren van een pulserend elektrisch veld.
- Het elektrische veld zorgt tijdelijk poriën in het celmembraan, welke men de cel door het negatief geladen DNA (of RNA) vergemakkelijken aangetrokken door de anode 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Eisen voor In ovo Elektroporatie
- Voorbereiden van de vectorconstruct: miR sense en antisense primers werden ontworpen na de instructies van Ambion, getemperd en geligeerd in Apal / EcoRI verteerd pSilencer U6.1 vector. Na een succesvolle transformatie van de verkregen klonen werd gekweekt en pSilencer plasmide werd geïsoleerd door alkalische lysis methode waarbij een Qiagen midi bereiding kit.
- Elektroden: Elektroden kunnen worden gekocht of gemakkelijk worden gebouwd 13. Wij gebruiken zelfgemaakte elektroden van platina draad (Φ = 0,2, 0,25 of 0,5 mm diameter) of in sommige gevallen een nog kleinere wolfraam draadelektrode (Φ = 0,1 mm) 8 afhankelijk van het gebied dat we willen elektroporatie. Verzengende weefsel te voorkomen, gebruiken we in de regel de dichter bij het weefsel hoe dunner de elektroden. Voor brede elektroporatie van middenhersenen, maken we gebruik van 0,5 mm platina draden gesoldeerd op een messing / roestvast stalen buisas en een elektrodehouder met een afstand van 3-5 mm (figuur 1) vast. Tot specifieke elektroporatie maken we 0,25 mm platinadraad anoden en 0,2 mm platina draad of 0,1 mm wolfraam voor de kathode met een afstand van ongeveer 1 mm of minder.
- Oplossingen: Zijn de volgende oplossingen klaar:
- Geautoclaveerd kip Ringer, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g KCl, 0,24 g CaCl2, oplossen in 1 liter gedestilleerd water).
- PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,24 g KH 2 PO 4, 1,44 g Na 2 HPO 4, oplossen in 1L gedestilleerd H 2 O).
- Snel groen: voorraad-oplossing 10 mg / ml gedestilleerd H 2 O
- Langzaam drogende inkt (minder schellak en dus minder vergiftiging voor het embryo). Opmerking: Een blauwe dichroïsche filter bevestigd aan een vezeloptische lamp zoals beschreven in Canto-Soler en Adler 14 verbetert het contrast en kan de noodzaak om inkt te injecteren elimineren.
Figuur 1. Schematische weergave van de elektroden en de elektrode houder. (A, B, C) platina draad werd gesoldeerd aan een zijde van een roestvrij stalen buisvormige schacht. Een gat was geboord in de andere kant van de buisvormige schacht dus die stekkers kunnen passen inch (A) Rood en blauw gekleurde draden waren verbonden met de pennen. Aan de andere kant werd de draad gemonteerd banaan connectoren die werken met de elektrische aansluitingen van de electroporator. (A, C) De platina draad werd gebogen in een engel van 90 °. Een laagje nagellak geïsoleerd de as boven de bocht.
2. Voorbereidingen Direct Voordat In ovo Elektroporatie
- Bereid het volgende materiaal:
- Verdunnen Ink met kip Ringer 01:06, voeg Antibiotica-Anti-schimmel oplossing (100x van Gibco) 1:100.
- Bereid vector oplossing: 1-2 ug / ul per specifieke DNA in H2O aangevuld met Fast Green (01:20).
- Steriliseren forceps, scharen, wolfraam naald en elektroden met 70% ethanol.
- Trek micropipetten voor nucleïnezuur injectie van borosilicaatglas capillairen (lengte buitendiameter: 100 mm x 0.9 mm). We gebruiken een eenvoudige trekker PUL-1 (WPI, Berlijn) met de in tabel 1 instellingen.
- Stel de parameters van de elektroporator zoals getoond in Tabel 2.
| Parameters | Waarden |
| Warmte | 350 |
| Trek | 100 |
| Snelheid 50 | |
| Vertraging | 200 |
Tabel 1. Instellingen voor PUL-1
| Parameters | Waarden |
| Frequentie | 50 Hz |
| Vertraging | 20-50 msec * |
| Breedte | 20 msec |
| Spanning | 8-25 V * |
| Pols | 3-5 keer |
| * Afhankelijk van de elektrode diameter en afstand. Alstublieftrekening mee houden bij het veranderen van een van de parameters. | |
Tabel 2. Instellingen voor de Pulse Stimulator
- Bereid kippenembryo's voor elektroporatie:
- Incubeer bevruchte kippeneieren op hun lange zijde bij 37 ° C met 65% luchtvochtigheid voor 39 uur tot embryo's tussen Hamburger & Hamilton (HH) verwerven stadia 15 9-11. Het embryo vestigt op het bovenste gedeelte van het ei, dus moet je markeren met een potlood lijn.
- Ontsmet de eieren met 70% ethanol.
- Doorboren van het ei op zijn bredere kant, waar de luchtspouw moet zijn.
- Verwijder 1-2 ml eiwit. Dit zal het embryo los van de eierschaal.
- Cello-tape de eierschaal om granaatscherven vallen op het embryo te vermijden. Gebruik een schaar om een klein venster in de eierschaal rond het potlood lijn snijden.
- Injecteer een beetje inktonder het gebied opaca het embryo zichtbaar.
- Maak een snee in de vitelline membraan met een geslepen wolfraam naald tot een betere toegankelijkheid van het embryo voor nucleïnezuur injectie en elektroporatie bereiken.
3. Elektroporatie en incubatie
- Voeg een paar druppels warm Ringer-oplossing op de embryo's. Dit verlaagt de embryo, oververhitting, plakken van de elektroden aan het weefsel en een medium voor de stroom tussen de twee elektroden.
- Injecteer de vector vloeistof in het lumen van de neurale buis middenhersenen niveau. Als de DNA-expressievector bevat geen reportergen (bijv. EGFP), voeg een iets lagere concentratie reportergen vector (1 ug / ul miR expressie vector tot 0,9 ug / ul reportergen vector) aan de DNA-oplossing. Dit zal ervoor zorgen dat je herkent getransfecteerde cellen later 8. We maken gebruik van de zogenaamde pCAX vector, een soort cadeautje weerm C. Krull 13.
- Voor een brede transfectie van de middenhersenen, plaats de elektroden links en rechts van het embryo ter hoogte van de middenhersenen. De afstand tussen de elektroden moet ongeveer 3-5 mm. De andere instellingen zijn 15V, 20 msec peulvruchten en 50 msec vertraging voor HH 10. De positie van de twee elektroden enigszins langs de dorso-ventrale (DV) as van de middenhersenen verzekert een brede transfectie van cellen de DV as transfectie.
- Voor ventrale transfectie, voeg wat van de Bel aan het hoofd van de dooier membraan verhogen en plaats de anode onder ventrale middenhersenen. Als de kop niet stijgt duwt de elektrode het membraan dat dooier en embryo scheidt schroeien van de neurale buis voorkomen. De kathode moet boven de middenhersenen dorso-lateraal tegenover de anode geplaatst. Heeft de neurale buis niet aan. We transfecteren de linker ventrale helft van de middenhersenen om moeilijkheden met ontwikkeling van het hart te voorkomen. De afstand tussen de elektrodesis ongeveer 1-0,5 mm, de rest van de instellingen zijn 10V, 20 msec breedte en 50 msec vertraging.
- Brengt u nog een druppel Saline op de top van de embryo's om het afkoelen en verwijder de luchtbellen.
- Sluit de eieren met de band en incubeer gedurende ten minste 4 uur, de minimale tijd die vereist expressie vector.
4. Fixatie van kippenembryo's
- Verwijder de embryo's uit hun eieren.
- Schoon embryo's onder een stereomicroscoop en de omvang van transfectie met een fluorescerende stereo microscoop.
- Bevestig de embryo overnacht in 4% PFA bij 4 ° C. Ga verder met het snijden en / of vlekken (in situ hybridisatie, immunohistochemie) veranderingen in de getransfecteerde gebied geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De omvang van de middenhersenen gebied getransfecteerd met miR zichtbaar is door de expressie van GFP van een reporter vector geïnjecteerd samen met de miR expressie vector (Figuur 2). Gebruik platina elektroden met een diameter van 0,5 mm en geplaatst parallel aan de as van AP middenhersenen leidt normaliter de transfectie van een groot gebied langs de DV-en AP-as, zoals achterhersenen, middenhersenen en soms diencephalon (fig. 2A en B). De grootte van de elektroden leidt tot een grote elektrisch veld in de hersenen regio en dus een groot gebied getransfecteerd.
Het is moeilijk om nauwkeurig richten een gebied als bijvoorbeeld de ventrale middenhersenen. Door de afstand tussen de elektroden 0,5 mm een kleinere elektrisch veld te bereiken is vaak toxisch voor het embryo en leidt tot artefacten. We gebruikten elektroden met een kleinere diameter (0,2 mm, 0,25 mm platina of 0,1 mm geslepen wolfraam draad), die meer lokale tra biedennsfection als dat van de ventrale hersenen, hetgeen moeilijk (Figuren 2C-I) te bereiken. Kleinere elektroden verminderen elektrisch veld toegepast en staat de elektroden dichter het weefsel plaatst. Figuur 2F toont een voorbeeld, waarbij de gehele ventrale middenhersenen was getransfecteerd. In de figuren 2G en 2H de getransfecteerde ventrale gebieden kleiner, maar een deel van de achterhersenen (2F) of diencephalon (2H) zijn ook getransfecteerd. In figuur 2G is de anode onder de midden-en achterhersenen positie om ventrale gebieden transfecteren. Figuur 2H toont een voorbeeld van een anode niet goed geïsoleerd met nagellak langs de schacht. Dus niet alleen het ventrale gebied rond de MHB uitdrukking miR / GFP maar ook de dorsale anterieure MES-en di-hersenen, waarbij de as van de anode was geplaatst. De specifieke ventrale miR / GFP distributie in de figuren 2C-I is een gevolg van de lokaleelektrisch veld passen we met de kleinere elektroden. Tezamen met kleinere elektroden en elektrische velden kunnen we DNA / RNA expressie in gebieden beperkter als ventrale middenhersenen.
Sinds onze microRNA expressievector bevat geen reportergen we mengen in een GFP expressie vector in een verhouding van 1 ug / ul 0,9 ug / ul, respectievelijk. De bijna gelijk verhouding zorgt ervoor dat de microRNA en GFP getransfecteerde gebied bijna volledig overlappen (zie Momose et al.. 8 en eigen ervaring). Om de omvang van de getransfecteerde gebied oordelen wordt belangrijk wanneer slechts een klein gebied met specifieke celtypen is getransfecteerd of getransfecteerde cellen worden gebruikt voor qRT-PCR. Een minder concentratie van het reportergen kan leiden tot cellen die GFP onder het detectieniveau. De sterkte van expressie van elke getransfecteerde vector hangt niet alleen van de concentratie van de gebruikte vector, maar ook van de promotor. Onze vectoren zijn U6-promotor het rijdennl (uiten miRNA) en ß-actine promoter gedreven (het uiten van fluorescerende eiwitten) en zijn zowel alomtegenwoordig en constitutief actief in het kippenembryo.
De meeste van onze embryo's geëlektroporeerd aan de linkerkant behalve (spiegelbeeld) Figuur 2C. Voor time-lapse experimenten wordt elektroporatie van de rechterkant van het embryo aanbevolen aangezien de meeste embryo draaien hun hoofd naar rechts en liggen op de linkerzijde.
Figuur 2. Representatieve resultaten. Embryo's werden tussen HH10 en HH11 geëlektroporeerd en op de in de foto's stadia vast. (AC) tonen electroporations van dorsale middenhersenen, en (DI) van ventrale middenhersenen. De pijlen in (D, E) geven ventraal gelegen, GFP-positieve cellen. Voor meer details zie tekst. Mes- Mesencephalon / middenhersenen, Di - diencephalon, Tel - telencephalon, Rhom - rhombencephalon / achterhersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze video toont een effectieve methode om plasmide transfecteren in de neuro-epitheliale cellen van specifieke gebieden van het kuiken middenhersenen. Rechthoekige elektrische pulsen van een laag voltage kan DNA in cellen van het kuiken neurale buis te introduceren in ovo 6,16. Echter, de nauwkeurigheid van DNA targeting vaak bemoeilijkt door grote elektrische veld, die stijgt door de relatief grote elektroden (Φ = 0,5 mm). We hebben geprobeerd om dat probleem aan te pakken met behulp van elektroden kleiner in diameter volgens de richtlijnen van Momose et al.. 8. Voor ventrale middenhersenen transfectie plaatsen we de kathode onder het membraan van het gebied pellucida of de leeftijd van het embryo kan rechtstreeks onder de ventrale middenhersenen. Het laatste scenario heeft een beetje praktijk sinds middenhersenen / neurale buis weefsel niet mogen worden aangeraakt en beschadigd door de anode. Het toevoegen van Ringer kan vaak helpen om het hoofd van het embryo til iets van de membraan die het gebied pellucida.
Hoewel naar Are gen concentraties overwegen in de cel. Verschillende gendoseringen kunnen verschillende effecten op cellen en weefsel. Er zou een drempel effect betrokken zijn (zie Agoston et al.. 17, bijvoorbeeld) of verschillend, gesorteerd effecten. We testen normaal verschilhuur concentraties van de miR uiten (0,5-2 ug / ul) vector en veranderingen in morfologie of eiwit / gen-expressie te analyseren. Effecten kunnen worden getest in vivo gebruik van immunohistochemie, sensor vectoren 18 of RNA in situ hybridisatie.
Deze techniek biedt kracht en locatie van een activiteit van een specifieke miR in vivo in bijvoorbeeld een dual fluorescentie reporter / sensor vector zoals beschreven in De Pietri Tonelli et al.. 18 testen. Zij maken gebruik van een vector die een GFP-reporter en een RFP miR sensor bevat. De RFP wordt gevolgd door een gratis miR volgorde. Terwijl GFP expressie identificeert het succes getransfecteerde cellen, rode fluorescentie (RFP) geeft de afwezigheid van de onderzochte miR en verdwijnen van rode fluorescentie verraadt de aanwezigheid van miR. Deze techniek kan ook worden gebruikt om de specificiteit van miR doel te testen in vivo, met behulp van 3'UTR van de doelsequentie in het stroomafwaarts van RFP.Bij elkaar genomen is deze techniek zeer geschikt voor ontwikkelingsstudies op gen-expressie en functie in verschillende weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen K. Mikic, die naar de eerste fase van deze film en M. Nicolescu voor de miR beeld bijgedragen. C. Huber werd ondersteund door een beurs van de IZKF van de Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand door de Fortune programma van de Universtitätsklinikum Tübingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope - fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
- Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
- Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
- Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
- Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
- Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
- De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
