Summary
Dış ifade beyin gelişiminde microRNA rolünü izah etmek için bir tekniktir. Ancak, ovo elektroporasyon kullanarak belirli alanları hedefleyen zordur. Burada, biz verimli bir şekilde seçici electroporate ventral ve dorsal orta beyin bölgeleri göstermek.
Abstract
Kodlayıcı olmayan RNA'lar gen ekspresyonunu düzenleyen ek oyuncular. Belirli alanlarda ovo elektroporasyon Hedefli ektopik mıkroRNA ifade mekansal ve zamansal kontrolü için eşsiz bir araç sağlar. Ancak, ventral orta beyindeki gibi ventral beyin yapıları herhangi manipülasyonlar için ulaşmak oldukça zordur. Burada, biz ince platin elektrotlar kullanılarak ventral orta beyindeki içine miRNA electroporate için etkili bir yol göstermektedir. Bu yöntem, orta beyin ve in vivo çalışmalar için yararlı bir araç içinde belirli alanlarda transfekte etmek için güvenilir bir yol sunar.
Introduction
Gen ifadesi için ek oynatıcılar gibi küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar tanınması genomik programlama / gen düzenlemesi için yeni bir karmaşıklığı başlattı. Kodlayıcı olmayan RNA'lar, küçük farklı türlerin kodlayıcı olmayan RNA'lar 1-4 de dahil olmak üzere sinir hücreleri, fonksiyonel öneme sahiptir. Örneğin MicroRNA (miR veya MiRNA), gelişmekte olan beyin 5 ayrı ve değişen ekspresyon profillerini göstermektedir. Gelişim sırasında gen ifadesinin ve sessizliğini zamansal ve mekansal kontrolü için eşsiz bir fırsat civciv embriyo ovo elektroporasyon sağlar Hedefli.
Bu video elektroporasyon 6-10 ovo kullanarak civciv Ortabeyin belirli alanlarda Mirs ektopik ifadesi yerine farklı adımları gösterir. Hücrelerde bu küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar, uzun süreli bir etki sağlamak için, Mirs DNA dizisidir mono-ya da bi-sistronik vektörlerine klonlanmıştır. Ovo elektroporasyon için, miR v içerenector yumurta kabuğu içinde küçük bir pencere yaptıktan sonra embriyo maruz bırakılması ile orta beyin nöral tüp içine enjekte edilir. Ortabeyin küçük artı (anot) ve eksi (katot) belirli alanlarda transfect platin elektrot belirli pozisyonlarda yerleştirilir. Ventral orta beyin transfeksiyon için, anot sol ventral orta beyinde ve bir akım uygulamadan önce Ortabeyin sağ yarısı üzerinde katot altına yerleştirilir. Kabuğu içindeki açma bandı ile kapatılır ve embriyo sürece herhangi bir analiz için gerekli olan süre ile inkübe edilir. Bu yöntem, ilk Muramatsu, et al. 6 ile tarif edilen ve belirli bir alan transfeksiyonu için Momose et al. 8 ile geliştirilmiştir.
Şematik bir bakış.
- Yumurtanın embriyo th içine küçük bir pencere keserek maruz kalmaktadıre kabuğu.
- Çözünmüş vektör (ler) bir mikro kapiller kullanılarak orta beyin içine enjekte edilir.
- Iki elektrot - paralel veya embriyo altına ve üstüne yerleştirilir - darbeli bir elektrik alanı oluşturur.
- Elektrik alanı geçici olarak anot 11,12 çekiliyor negatif yüklü DNA (veya RNA) ile hücre içine girişini kolaylaştırmak hücre zarında gözenekler oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. In ovo Elektroporasyonla için gereksinimler
- Vektör yapısı hazırlanması: miR sens ve antisens primerleri, Ambion talimatlarından sonra tasarlanmıştır tavlanmış ve Apal ya lige edilmiştir / EcoRI ile sindirilmiş vektör pSilencer U6.1. Başarılı dönüşüm sonra elde edilen klonlardan biri büyütüldü ve plazmid pSilencer bir Quiagen midi hazırlık kiti kullanılarak alkalin lisiz yöntemi ile izole edildi.
- Elektrotlar: Elektrotlar satın alınabilir ya da kolayca 13 inşa edilecek. Biz platin tel kendine yapılan elektrotlar (Φ = çapı 0.2, 0.25 veya 0.5 mm) kullanmak veya bazı durumlarda da küçük bir tungsten tel elektrot (Φ = 0.1 mm) 8 biz electroporate istediğiniz alana bağlı. Doku yanmazlar için, doku, elektrotların ince için yakın bir kural olarak kullanın. Ortabeyin geniş elektroporasyon için, bir pirinç / paslanmaz çelik boru lehimli 0.5 mm platin telleri kullanmakmili ve 3-5 mm'lik bir mesafe (Şekil 1) ile bir elektrot tutucu sabitlenir. Belirli bölgeleri elektroporasyonu için, 0.25 mm platin tel anot ve 0.2 mm platin teli ya da 1 mm veya daha az yaklaşık bir mesafe ile katot için 0.1 mm tungsten kullanın.
- Çözümler: Aşağıdaki çözümler hazır:
- Otoklavda tavuk Ringer, pH 7.5 (9.0 g NaCl, 0.42 g KCl, 0.24 g CaCl2, 1 L damıtılmış su içinde çözülür.)
- PBS (NaCl 8 g, 0.2 g KCI, 0.24 g KH 2 PO4, 1.44 g 2 Na HPO 4, 1l damıtık H 2 O içinde çözülmüştür.)
- Hızlı Yeşil: stok çözelti 10 mg / ml distile H 2 O
- Yavaş kuruyan mürekkep (az gomalak ve embriyo için böylece daha az zehirlenmesi). Not: Canto-Soler ve Adler 14 anlatıldığı gibi bir fiber optik lamba bağlı bir mavi dikroik filtre kontrastı ve mürekkep enjekte etmek ihtiyacını ortadan kaldırabilir.
Şekil 1. Elektrotlar ve elektrot tutucu şematik. (A, B, C) platin tel, bir paslanmaz çelik boru şekilli milinin bir tarafında lehimlenmiştir edildi. Bir delik böylece bu fişler (A) Kırmızı ve mavi renkli teller pin fişler bağlı idi içeri sığabilecek boru şeklindeki milinin diğer tarafına açılmış. Karşı ucunda tel elektroporatörü elektrik prizleri ile çalışmak muz konnektörleri takıldı. (A, C) platin tel 90 ° lik bir melek olarak bükülmüştür. Tırnak cilasının tabakası büklümünün mili izole edilmiştir.
2. Doğrudan In ovo Elektroporasyonla önce Hazırlıklar
- Aşağıdaki malzemeyi hazırlayın:
- Tavuk Ringer 01:06 ile Ink sulandırmak GIBCO gelen Antibiyotik-Antimikotik solüsyonu (100x eklemek) 1:100 o.
- Vektör çözelti hazırlayın: H 2 O spesifik DNA başına 1-2 mg / ml Fast Green (01:20) ile takviye edilmiştir.
- % 70 etanol ile forseps, makas, iğne ve tungsten elektrotları sterilize edin.
- Borosilikat cam kılcal kısımların (100 mm x 0.9 mm, dış çap uzunluğu) ikinci bir nükleik asit, enjeksiyon için mikropipetler çekin. Biz Tablo 1'de gösterilen ayarları ile basit bir çektirmenin PUL-1 (TEFE, Berlin) kullanın.
- Tablo 2'de gösterildiği gibi elektroporatörü parametrelerini ayarlayın.
| Parametreler | Değerler |
| Isı | 350 |
| Çekme | 100 |
| Hız 50 | |
| Gecikme | 200 |
Tablo 1. PUL-1 için Ayarlar
| Parametreler | Değerler |
| Frekans | 50 Hz |
| Gecikme | 20 - 50 msn * |
| Genişlik | 20 milisaniye |
| Gerilim | 8-25 V * |
| Nabız | 3-5 defa |
| * Elektrot çapı ve mesafeye bağlı. Lütfenparametrelerden birini değiştirirken bunu dikkate alır. | |
Tablo 2. Darbe Stimulator için Ayarlar
- Elektroporasyon için civciv embriyo hazırlanması:
- Hamburger ve Hamilton (HH) arasında embriyolar elde etmek için 39 saat boyunca% 65 nem ile 37 ° C 'de, daha uzun tarafında fertilize tavuk yumurtası inkübe 15 9-11 aşamaları. Embriyo yumurtanın üst kısmında yerleşir, böylece bir kalem hattı ile işaretlemeniz gerekir.
- % 70 etanol ile yumurta dezenfekte edin.
- Hava boşluğu olması gereken yerde, daha geniş tarafında yumurta delmek.
- Yumurta beyazı 1-2 ml çıkarın. Bu kabuğu gelen embriyo ayırmak olacaktır.
- Viyolonsel-bant embriyo üzerine düşen kabuk parçalanmak önlemek için yumurta kabuğu. Kalem çizgisi etrafında yumurta kabuğu içine küçük bir pencere kesmek için bir makas kullanın.
- Mürekkep biraz enjekteembriyo görselleştirmek için alan Opaca altında.
- Nükleik asit Enjeksiyon ve elektroporasyon için embriyo daha iyi bir erişim elde etmek için, bir iğne ile keskinleştirilmiş tungsten vitellin membran içine bir kesim yapın.
3. Elektroporasyon ve Kuluçka
- Embriyoları üzerine sıcak Ringer solüsyonu birkaç damla ekleyin. Bu, embriyoların daha düşük aşırı ısınmasını önlemek için, dokuya elektrotların yapışmasını ve iki elektrot arasındaki akımı için bir ortam sağlar.
- Orta beyin düzeyinde nöral tüpün lümenine vektör solüsyonu enjekte edilir. DNA sentezleme vektörü herhangi bir raportör gen (örn. EGFP) varsa, DNA solüsyonuna konsantre bir biraz daha düşük bir raportör geni (1 ug / ul miR 0.9 ug / ul raportör gen vektörü ifade vektörü) ekleyin. Bu transfekte hücreler daha sonra 8 tanımasını sağlayacaktır. Biz sağa sola sözde pCAX vektörü, bir tür hediye kullanınm C. Krull 13.
- Ortabeyin geniş bir transfeksiyon için, orta beyin yükseklikte sol elektrotlar ve embriyo hakkı yerleştirin. Elektrotlar arasındaki mesafe, yaklaşık 3-5 mm olmalıdır. Diğer ayarlar 15V, 20 msn bakliyat ve HH 10 50 msn gecikme vardır. Hafif orta beyin ön-ventral (DV) ekseni boyunca iki elektrot konumunu değiştirme hücre, daha geniş bir transfeksiyon DV eksen transfeksiyon sağlar.
- Ventral Transfeksiyon için, sarısı zarından baş yükseltmek ve ventral orta beyin altında anodu yerleştirmek için bir Zil ekleyin. Kafa nöral tüp yanmazlar sarısı ve embriyo ayıran zarı altında elektrot itmek çıkmıyorsa. Katot orta beyin ön-yanal olarak zıt bir anot, yukarıda yerleştirilmelidir. Nöral tüp dokunmayın. Biz kalp gelişimi ile herhangi bir sorun yaşamamak için orta beynin sol ventral yarısını transfect. Elektrotlar arasındaki mesafeetrafında 1-0,5 mm, ayarları geri kalanı olan 10V, 20 msn genişlik ve 50 msn gecikme olduğunu.
- Soğumasını ve hava kabarcıklarını çıkarmak için embriyoların üstüne Salin başka bir damla uygulayın.
- Bant ile yumurta Seal ve en az 4 saat süreyle inkübe edilir; vektör ifadesi için gerekli olan minimum süre.
4. Tavuk Embriyolar Fixation
- Yumurtalarından embriyolar çıkarın.
- Stereomicroscope altında ve bir floresan stereo mikroskop ile transfeksiyonun ölçüde değerlendirmek temiz embriyolar.
- 4 ° C 'de% 4 PFA içinde gece boyunca embriyolar saptamak Transfekte alanında değişiklikleri analiz etmek için (in situ hibridizasyon, immünohistokimya) kesit ve / veya boyama ile devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MiR ile transfekte orta beyin alanının ölçüde miR ifade vektörü (Şekil 2) ile birlikte enjekte edilen bir raportör vektöründen GFP ekspresyonu görülebilir. 0.5 mm bir çapı olan platin elektrotları kullanarak, orta beyin ve arka beyin ve bazen diensefalon (Şekil 2A ve B de dahil) DV-ve AP-ekseni boyunca geniş bir alanda transfeksiyonu, normal olarak orta beyin potansiyel AP eksenine paralel olarak yerleştirilmiştir. Geniş bir elektrik alanında elektrotlar sonuç büyüklüğü beyin bölgesi ve bu nedenle, geniş bir transfekte edilmiş bölgeye uygulanır.
Bu doğru, örneğin ventral orta beyindeki gibi bir bölgeyi hedef zordur. Daha küçük bir elektrik alanı elde etmek için 0.5 mm elektrotlar arasındaki mesafeyi azaltmak genellikle embriyo için toksik olup eserler yol açar. Biz daha yerel tra sunan küçük çaplı (0.2 mm, 0,25 mm platin veya 0.1 mm bilenmiş tungsten tel) ile elektrotlar kullanılır(Şekil 2C-I) ulaşmak zordur ventral beyin, olduğu gibi nsfection. Küçük elektrot uygulanan elektrik alanını azaltmak ve dokuya çok daha yakın elektrotlar eklemek için olanak sağlar. Şekil 2F, tüm ön orta beyin transfekte edilmiş bir örneğini göstermektedir. Şekiller 2G ve 2H olarak transfekte ventral alanları daha küçük olan, fakat arka beyin (2F) veya diensefalon (2H) bir parçası da transfekte edilir. Şekil 2G, anot ventral alanları hem de transfekte etmek için orta ve arka beyin altına yerleştirildi. Şekil 2H de şaft boyunca tırnak cilası ile izole edilmiş bir anot olmayan bir örneğini göstermektedir. Bu nedenle, MHB etrafında ventral alan sadece miR / GFP ifade değil, aynı zamanda dorsal anterior mes-ve di-encephalon, anodun şaft yerleştirilmiş olduğu yerde. Şekil 2C-I spesifik ventral miR / GFP dağıtım yerel bir sonucudurBu elektrik alanı daha küçük elektrotlar ile uygulanır. Biz ventral orta beyindeki gibi daha kısıtlı alanlarda DNA / RNA ifade edebilir küçük elektrotlar ve elektrik alanları ile birlikte alınmıştır.
Bizim microRNA ekspresyon vektörü herhangi bir raportör genini ihtiva eden bu yana, sırasıyla 0.9 mg / ml, 1 ug / ul 'lik bir oranda eksprese eden bir vektör, GFP karıştırın. Hemen hemen eşit oran mıkroRNA ve GFP transfekte alanı neredeyse tamamen örtüşmesi (Momose ark. 8 ve kendi deneyimlerini bakınız) sağlar. Spesifik hücre türlerini içeren sadece küçük bir alan transfekte veya transfekte edilmiş hücreler, qRT-PCR için kullanıldığında, transfekte alanının ölçüde hakim edebilmek için önemli hale gelir. Bildirici genin bir çok daha az konsantrasyon bulgulama seviyesinin altında GFP ifade eden hücrelere yol açabilir. Her transfekte edilmiş vektörün ifade gücü kullanılan vektörün konsantrasyonu üzerinde değil, aynı zamanda promotör da bağlıdır. Bizim vektörler U6-promotör driv vardıren (miRNA ifade eden) ve beta-aktin promoteri (floresan proteinleri eksprese eden) ve her iki tahrik ubiquitously ve yapısal olarak aktif civciv embriyo bulunmaktadır.
Bizim embriyoların çoğu Şekil 2C (ayna görüntüsü) dışında sol tarafta elektropore edilir. En embriyolar sol tarafına doğru ve yalan doğru başını çevirmek beri time-lapse deneyler için embriyo sağ tarafında elektroporasyon tavsiye edilir.
Şekil 2. Örnek sonuçlanır. Embriyolar HH10 ve HH11 arasındaki Electroporated ve resimlerde belirtilen aşamalarında tespit edildi. Ventral orta beyin (AC) show dorsal orta beyin electroporations ve (DI). (D, E) 'de oklar ventral bulunan, GFP pozitif hücreler göstermektedir. Daha fazla ayrıntı için metne bakınız. Mes- Mesencephalon / orta beyin, Di - diencephalon, Tel - telencephalon, Rhom - rhombencephalon / Beyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video civciv Ortabeyin belirli alanların nöroepitel hücrelere plazmid transfect için etkili bir yöntemi gösterir. Düşük voltaj dikdörtgen elektrik darbeleri 6,16 ovo civciv nöral tüpün hücrelerine DNA 'nın neden olabilir. Bununla birlikte, DNA hedefleme doğruluğu genellikle nispeten büyük elektrotlar (Φ = 0.5 mm) üzerinden yükselir geniş elektrik alanı tarafından engellenmektedir. Biz Momose vd. 8 yönergeleri izleyerek küçük çaplı elektrotlar kullanarak bu sorunu çözmek için çalıştı. Embriyonun yaş doğrudan ventral orta beyin altına olması durumunda, ön orta beyin Transfeksiyon için, alan pellucida veya membran altında katot yerleştirin. Nöral / orta beyin tüp doku anot tarafından dokundu ve hasar olmamalıdır beri son senaryo uygulama biraz ihtiyacı var. Zil ekleme genellikle biraz alanını pellucidanm kaplayan zarın kapalı embriyonun başını kaldırmaya yardımcı olabilir.
Hücrede, gen konsantrasyonları dikkate rağmen. Farklı gen dozlarda hücre ve doku üzerinde farklı etkileri olabilir. Orada (örneğin, Agoston ve ark. 17 e bakınız) dahil, bir eşik etkisi olarak ya da farklı, dereceli etkileri olabilir. Biz normalde yönün sınamakmiR kira konsantrasyonları (0.5-2 mg / ml) vektörü ifade ve morfolojisi veya protein / gen ekspresyon değişiklikleri analiz eder. Effects immünohistokimya kullanılarak in vivo olarak test edilebilir, sensör 18, in situ melezleme ya da RNA vektörleri.
Bu teknik aynı zamanda De Pietri Tonelli ve ark. 18 de tarif edildiği gibi, örneğin bir çift flüoresan raportör / sensor vektörü kullanılarak, in vivo olarak belirli bir miR herhangi bir aktivite gücü ve konumu test sunar. Onlar bir GFP-muhabiri ve bir RFP miR sensör içeren bir vektör kullanın. TTT ücretsiz miR sırası tarafından takip edilmektedir. GFP başarıyla transfekte hücrelerini tespit ederken, kırmızı floresan (TTT) araştırılmıştır miR yokluğunu gösterir ve kırmızı floresan kaybolması miR varlığını ihanet. Bu teknik aynı zamanda RFP alt hedef sekansın 3'UTR kullanılarak, in vivo miR hedefin spesifisitesini test etmek için kullanılabilir.Bu teknik bir arada ele alındığında, farklı dokularda gen ifadesi ve fonksiyonu ile ilgili gelişim çalışmaları için son derece uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz mıR resim için bu film ve M. Nicolescu başlangıç aşamasında katkıda K. Mikic, kabul. C. Huber Universtitätsklinikum Tübingen Fortune program tarafından Universtitätsklinikum Tübingen IZKF, A. Alwin Prem Anand bir burs ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope - fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
- Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
- Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
- Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
- Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
- Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
- De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
