Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط ​​الفرخ

doi: 10.3791/50024 Published: September 16, 2013

Summary

التعبير خارج الرحم هو أسلوب واحد لتوضيح دور microRNAs في نمو الدماغ. ومع ذلك، واستهداف مناطق محددة باستخدام التثقيب الكهربائي في البيضة هو التحدي. هنا، وتبين لنا وسيلة فعالة لمناطق الدماغ المتوسط ​​بطني وظهري electroporate انتقائي.

Abstract

الرنا غير الترميز لاعبين إضافية في تنظيم التعبير الجيني. المستهدفة في التثقيب الكهربائي البيضة من المجالات المحددة يوفر أداة فريدة للسيطرة المكاني والزماني للخارج الرحم التعبير الرنا الميكروي. ومع ذلك، وهياكل الدماغ مثل المخ الأوسط بطني بطني هي صعبة نوعا ما للوصول إلى أي تلاعب. هنا، علينا أن نظهر وسيلة فعالة ل electroporate ميرنا في الدماغ المتوسط ​​البطني باستخدام أقطاب البلاتين رقيقة. يقدم هذا الأسلوب وسيلة يمكن الاعتماد عليها لبالنقل مناطق معينة من المخ الأوسط وأداة مفيدة لفي الدراسات المجراة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الاعتراف الرنا صغيرة غير الترميز كلاعبين إضافية للتعبير الجين أطلقت التعقيد جديدة لتنظيم الجيني البرمجة / الجينات. أنواع مختلفة من الرنا غير الترميز لها أهمية وظيفية في الخلايا العصبية، بما في ذلك الصغيرة غير الترميز الرنا 1-4. MicroRNAs (مير أو ميرنا) على سبيل المثال تظهر ملامح التعبير متميزة وتغيير في العقول النامية 5. المستهدفة في التثقيب الكهربائي البيضة من افراخ الدجاج يوفر فرصة فريدة للسيطرة الزمانية والمكانية في التعبير الجيني وإسكات خلال التنمية.

هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة لأداء التعبير خارج الرحم من ميرس في مناطق معينة من الدماغ المتوسط ​​الفرخ في البيضة باستخدام التثقيب الكهربائي 6-10. لضمان وجود تأثير طويل الأمد لهذه الرناوات الصغيرة غير الترميز في الخلايا، تم استنساخ تسلسل الحمض النووي من ميرس في ناقلات أحادية أو ثنائية cistronic. لفي التثقيب الكهربائي البيضة، مير تحتوي على الخامسيتم حقن ector في الأنبوب العصبي الدماغ المتوسط ​​من خلال تعريض الجنين بعد إجراء نافذة صغيرة في قشرة البيضة. لبالنقل مناطق معينة من الدماغ المتوسط ​​بالإضافة صغيرة (الأنود) وناقص (الكاثود) وتوضع أقطاب البلاتين في مواقف معينة. لترنسفكأيشن الدماغ المتوسط ​​البطني، يتم وضع القطب الموجب تحت الدماغ المتوسط ​​بطني اليسار والكاثود فوق النصف الأيمن من الدماغ المتوسط ​​قبل تطبيق الحالي. يتم إغلاق فتحة في قشر البيض مع الشريط ويتم تحضين الأجنة لطالما المطلوبة لأي تحليل. هذا الأسلوب وقد وصفت في الأصل من قبل موراماتسو وآخرون. 6 وتحسينها من خلال Momose وآخرون. 8 لترنسفكأيشن منطقة معينة.


نظرة عامة التخطيطي.

  1. يتعرض الجنين في البيضة من خلال خفض نافذة صغيرة في اله قشر البيض.
  2. يتم حقن ناقلات المنحل (ق) في الدماغ المتوسط ​​باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة.
  3. قطبين - وضعت بالتوازي أو تحت وفوق الجنين - توليد حقل كهربائي نابض.
  4. الحقل الكهربائي يخلق زمنيا المسام في غشاء الخلية، والتي تسهل الدخول إلى الخلية بواسطة الحمض النووي المشحونة سلبا (أو RNA) تنجذب إلى القطب الموجب 11،12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. متطلبات والبيضة التثقيب الكهربائي

  1. إعداد بناء ناقلات: وقد صممت مير الشعور والعقاقير الاشعال بعد تعليمات من AMBION، صلب وligated في APAI / EcoRI هضمها pSilencer U6.1 النواقل. بعد التحول الناجح كانت تزرع واحد من الحيوانات المستنسخة الناتجة عنها، وكان معزولا pSilencer البلازميد بواسطة طريقة تحلل القلوية باستخدام Quiagen ميدي إعداد عدة.
  2. الأقطاب الكهربائية: أقطاب يمكن شراؤها بسهولة أو أن يبنى 13. نستخدم أقطاب عصامي من سلك البلاتين (Φ = 0.2، 0.25، أو 0.5 مليمتر في القطر) أو في بعض الحالات وحتى أصغر سلك التنغستن القطب (Φ = 0.1 ملم) 8 اعتمادا على المنطقة التي نريد ل electroporate. لتجنب الحارقة من الأنسجة، ونحن نستخدم كقاعدة وأقرب إلى الأنسجة أرق الأقطاب. ل electroporation واسعة من المخ الأوسط، ونحن نستخدم 0.5 مم أسلاك البلاتين ملحوم إلى أنبوبي النحاس / الفولاذ المقاوم للصدأرمح وثابتة لحامل الكهربائي مع مسافة 3-5 مم (الشكل 1). ل electroporate مجالات محددة، ونحن نستخدم 0.25 ملم الأنودات سلك البلاتين 0.2 ملم وسلك البلاتين أو 0.1 ملم لالتنغستن القطب السالب مع المسافة التقريبية من 1 ملم أو أقل.
  3. حلول: هل الحلول التالية جاهزة:
    1. تعقيمها قارع الأجراس الدجاج، ودرجة الحموضة 7.5 (9.0 غرام كلوريد الصوديوم، 0.42 ز بوكل، 0.24 غرام CaCl2، تذوب في الماء المقطر 1 لتر).
    2. برنامج تلفزيوني (8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 0.24 غ KH 2 PO4، 1.44 ز نا 2 هبو تذوب في 1L المقطر H 2 O).
    3. سريع الأخضر: محلول المخزون 10 ملغ / مل H 2 O المقطر
    4. الحبر تجفيف بطيئة (أقل اللك وبالتالي التسمم أقل للجنين). ملاحظة: مرشح مزدوج اللون الأزرق تعلق على مصباح الألياف البصرية كما هو موضح في كانتو-سولير وأدلر 14 يعزز التباين ويمكن القضاء على الحاجة لحقن الحبر.


الشكل 1. الرسم التخطيطي من الأقطاب الكهربائية وحامل القطب. كان ملحوم (A، B، C) سلك البلاتين إلى جانب واحد من أنبوبي رمح الفولاذ المقاوم للصدأ. تم حفر ثقب في الجانب الآخر من رمح أنبوبي بالتالي أن المقابس دبوس يمكن يلائمه (A) تم ربط الأحمر والأسلاك زرقاء اللون لشمعات دبوس. في الطرف المقابل تم تركيب السلك إلى موصلات الموز التي تعمل مع المقابس الكهربائية من electroporator. (A، C) عازمة سلك البلاتين في ملاكا من 90 درجة. هناك طبقة من طلاء الأظافر عزل رمح فوق منحنى.

2. الاستعدادات قبل مباشرة في البيضة التثقيب الكهربائي

  1. إعداد المواد التالية:
    1. تمييع الحبر مع الدجاج قارع الأجراس 01:06، إضافة محلول مضاد حيوي مضاد فطري (100X من Gibcس) 1:100.
    2. إعداد الحل ناقلات: 1-2 ميكروغرام / ميكرولتر في الحمض النووي محددة في H 2 O تستكمل مع الأخضر سريع (1:20).
    3. تعقيم الملقط، مقص، إبرة التنغستن الأقطاب ومع الايثانول 70٪.
    4. سحب بال micropipettes للحقن الحمض النووي من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات (طول القطر الخارجي لل: 100 مم × 0.9 مم). نستخدم ساحبة بسيطة PUL-1 (WPI، برلين) مع الإعدادات هو مبين في الجدول رقم 1.
    5. تعيين المعلمات من electroporator كما هو مبين في الجدول رقم 2.
المعلمات القيم
حرارة 350
سحب 100
سرعة 50
تأخير 200

الجدول 1. إعدادات لPUL-1

المعلمات القيم
تردد 50 هرتز
تأخير 20 - 50 ميللي ثانية *
عرض 20 ميللي ثانية
الجهد 8-25 V *
نبض 3-5 مرات
* اعتمادا على قطر الكهربائي والمسافة. من فضلكتأخذ ذلك في الاعتبار عند تغيير أحد المعلمات.

الجدول 2. إعدادات لتحفيز نبض

  1. إعداد افراخ الدجاج ل electroporation:
    1. احتضان بيض الدجاج المخصب على الجانب يعد لها عند 37 درجة مئوية مع رطوبة 65٪ لمدة 39 ساعة للحصول على الأجنة بين همبرغر وهاميلتون (سمو) مراحل 15 9-11. يستقر الجنين في أعلى جزء من البيض، لذلك يجب وضع علامة عليه مع خط قلم رصاص.
    2. تطهير البيض مع الايثانول 70٪.
    3. يخترق البويضة في الجانب الأوسع، حيث يجب أن يكون تجويف الهواء.
    4. إزالة 1-2 مل من بياض البيض. وهذا فصل الجنين من قشر البيض.
    5. التشيلو الشريط قشر البيض لتجنب شظايا قذيفة تسقط على الجنين. استخدام زوج من مقص لقطع نافذة صغيرة في قشر البيض حول خط قلم رصاص.
    6. حقن قليلا من الحبرتحت المنطقة المعتمة لتصور الجنين.
    7. اجراء خفض في الغشاء المحي مع إبرة التنغستن شحذ لتحقيق إمكانية الوصول بشكل أفضل من الجنين للحقن الحمض النووي و electroporation.

3. التثقيب الكهربائي والحضانة

  1. إضافة بضع قطرات من محلول دافئ رينغر على الأجنة. وهذا يقلل من الأجنة، ومنع ارتفاع درجة الحرارة، وتمسكه من الأقطاب الكهربائية إلى الأنسجة وتوفير وسيلة للتيار بين القطبين.
  2. حقن محلول ناقلات في تجويف الأنبوب العصبي في الدماغ المتوسط ​​المستوى. إذا كان لديك ناقلات التعبير الحمض النووي لا يحتوي على الجين مراسل (مثل EGFP)، إضافة قليلا أقل تركيزا مراسل ناقلات الجينات (1 ميكروغرام / ميكرولتر مير معربا عن ناقلات إلى 0.9 ميكروغرام / ميكرولتر مراسل ناقلات الجينات) في حل الحمض النووي. وهذا يضمن أن تتعرف على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في وقت لاحق 8. ونحن نستخدم ما يسمى متجه pCAX، هدية عينية جيئة وذهابام C. كرول 13.
  3. لترنسفكأيشن واسعة من الدماغ المتوسط، وضع أقطاب اليسار واليمين من الجنين في ذروة الدماغ المتوسط. يجب أن تكون المسافة بين الأقطاب حوالي 3-5 ملم. الإعدادات الأخرى هي 15V، 20 ميللي ثانية البقول و 50 ميللي ثانية تأخير لسمو 10. تغيير موقف القطبين قليلا على طول (DV) محور ظهراني بطني من الدماغ المتوسط ​​ويؤكد على ترنسفكأيشن واسعة من الخلايا أكثر ترنسفكأيشن محور DV.
  4. لترنسفكأيشن بطني، وإضافة بعض قارع الأجراس لرفع الرأس من غشاء الصفار ووضع الأنود تحت الدماغ المتوسط ​​البطني. إذا لم يرتفع رأسه دفع القطب تحت الغشاء الذي يفصل صفار البيض والجنين لتجنب الحارقة في الأنبوب العصبي. يجب وضع الكاثود فوق الدماغ المتوسط ​​ظهراني أفقيا المعاكس إلى القطب الموجب. لا تلمس الأنبوب العصبي. نحن بالنقل النصف البطني الأيسر من الدماغ المتوسط ​​لتجنب أي صعوبات مع التنمية القلب. المسافة بين الأقطابحوالي 1-0،5 ملم، وبقية الإعدادات يتم 10V، 20 عرض ميللي ثانية و 50 ميللي ثانية تأخير.
  5. تطبيق آخر قطرة من المالحة على رأس الأجنة لتبريده وإزالة فقاعات الهواء.
  6. ختم البيض مع الشريط واحتضان لمدة ساعة على الأقل 4؛ الحد الأدنى من الوقت اللازم لناقلات التعبير.

4. التثبيت من الأجنة الدجاج

  1. إزالة الأجنة من بيضها.
  2. الأجنة نظيفة تحت stereomicroscope وتقييم مدى ترنسفكأيشن مع المجهر ستيريو الفلورسنت.
  3. إصلاح الأجنة أكثر من ليلة في PFA 4٪ في 4 درجات مئوية. المضي قدما باجتزاء و / أو تلطيخ (الموقع التهجين، المناعية في) لتحليل التغييرات في المنطقة transfected.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مدى منطقة الدماغ المتوسط ​​transfected مع مير مرئيا من خلال التعبير عن GFP من ناقلات مراسل حقن جنبا إلى جنب مع مير معربا عن ناقلات (الشكل 2). باستخدام أقطاب البلاتين التي يبلغ قطرها 0.5 ملم وضعت موازية لمحور AP من الخيوط الدماغ المتوسط ​​عادة إلى ترنسفكأيشن من منطقة واسعة على طول وDV-AP-المحور، بما في ذلك الدماغ المؤخر، الدماغ المتوسط، وأحيانا الدماغ البيني (أرقام 2A وباء). حجم النتائج الأقطاب في الحقل الكهربائي واسعة تطبق على منطقة الدماغ، وبالتالي مساحة واسعة transfected.

فمن الصعب أن تستهدف بدقة منطقة مثل على سبيل المثال الدماغ المتوسط ​​البطني. تقليل المسافة بين الأقطاب 0.5 ملم إلى تحقيق حقل كهربائي أصغر غالبا ما تكون سامة للجنين ويؤدي إلى القطع الأثرية. كنا أقطاب بأقطار أصغر (0.2 مم، 0.25 مم أو البلاتين 0.1 ملم سلك التنغستن شحذ)، والتي تقدم الهيئة أكثر محليةnsfection مثلها في ذلك مثل الدماغ البطني، وهو أمر صعب للوصول إلى (أرقام 2C-I). أقطاب أصغر لحد من الحقل الكهربائي تطبيقها وتمكن من إدراج الأقطاب أقرب بكثير إلى الأنسجة. ويبين الشكل 2F كمثال على ذلك، حيث تم transfected الدماغ المتوسط ​​بطني بأكمله. في أرقام 2G و 2H المناطق بطني transfected هي أصغر، ولكن و transfected جزء من الدماغ المؤخر (2F) أو الدماغ البيني (2H) أيضا. في الشكل 2G، وضعت الأنود تحت منتصف والدماغ المؤخر ل transfect كل من المناطق بطني. ويبين الشكل 2H مثالا على الأنود يست معزولة جيدا مع طلاء الأظافر على طول رمح. وبالتالي، ليس فقط في المنطقة البطنية حول MHB عن مير / GFP ولكن أيضا حيث كانت قد وضعت رمح من الأنود الظهري الأمامي زارة التربية والعلم ودى مخ. بطني توزيع محددة مير / GFP في أرقام 2C-I هو نتيجة لمن المستوى المحليالحقل الكهربائي نطبق مع أقطاب أصغر. أخذت معا، مع أقطاب أصغر والمجالات الكهربائية يمكننا التعبير عن DNA / RNA في مناطق أكثر تقييدا ​​مثل الدماغ المتوسط ​​البطني.

منذ لدينا ناقلات التعبير microRNA لا يحتوي على الجين المراسل، ونحن مزيج في التعبير عن GFP ناقلات في نسبة 1 ميكروغرام / ميكرولتر إلى 0.9 ميكروغرام / ميكرولتر، على التوالي. نسبة متساوية تقريبا يضمن أن منطقة transfected الرنا الميكروي وGFP تماما تقريبا التداخل (انظر Momose وآخرون. 8 والخبرات الخاصة). لتكون قادرة على الحكم على مدى منطقة transfected يصبح من المهم عندما يتم transfected سوى مساحة صغيرة تحتوي على أنواع معينة من الخلايا أو تستخدم الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل لQRT-PCR. وهناك تركيز أقل بكثير من الجين المراسل قد يؤدي إلى الخلايا معربا عن GFP تحت مستوى الكشف. قوة التعبير عن أي ناقلات transfected لا يتوقف فقط على تركيز النواقل المستخدمة ولكن أيضا على المروج. ناقلات لدينا هي U6-المروج سياقهEN (التعبير عن ميرنا) وß أكتين المروج مدفوعة (التعبير عن البروتينات الفلورية) وكلاهما بتواجد مطلق ونشطة جوهري في الجنين الفرخ.

وelectroporated معظم الأجنة لدينا في الجانب الأيسر باستثناء الشكل 2C (صورة طبق الأصل). للتجارب مرور الزمن، فمن المستحسن التثقيب الكهربائي من الجانب الأيمن من الجنين لأن معظم الأجنة تتحول رؤوسهم نحو اليمين والكذب على جانبها الأيسر.


الشكل 2. نتائج ممثل. و electroporated الأجنة بين HH10 وHH11 والثابتة في المراحل المشار إليها في الصور. (AC) عرض electroporations من الدماغ المتوسط ​​الظهرية، و(DI) من الدماغ المتوسط ​​البطني. الأسهم في (D، E) تشير تقع البطني، وخلايا GFP إيجابية. لمزيد من التفاصيل انظر النص. مس- الدماغ المتوسط ​​/ الدماغ المتوسط، دي - الدماغ البيني، أبيب - الدماغ الانتهائي، Rhom - الدماغ المؤخر / الدماغ المؤخر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يوضح هذا الفيديو وسيلة فعالة لبالنقل البلازميد إلى خلايا عصبية ظهارية من مناطق معينة من الدماغ المتوسط ​​الفرخ. يمكن النبضات الكهربائية ذات الجهد المنخفض مستطيلة إدخال الحمض النووي في خلايا الأنبوب العصبي الفرخ في البيضة 6،16. ومع ذلك، غالبا ما يتم عرقلة دقة استهداف الحمض النووي للمجال الكهربائي واسعة، والتي ترتفع من خلال أقطاب كهربائية كبيرة نسبيا (Φ = 0.5 ملم). حاولنا معالجة هذه المشكلة عن طريق استخدام الأقطاب الكهربائية الصغيرة في قطر في أعقاب المبادئ التوجيهية للMomose وآخرون. 8. لترنسفكأيشن الدماغ المتوسط ​​بطني، ونحن نضع الكاثود تحت الغشاء من المنطقة الشفافة أو إذا كان عمر الجنين يسمح لها مباشرة تحت الدماغ المتوسط ​​البطني. السيناريو الأخير يحتاج قليلا من الممارسة لأنه لا ينبغي أن يكون لمست الدماغ المتوسط ​​/ الأنسجة العصبية أنبوب والتي تضررت من القطب الموجب. يمكن إضافة قارع الأجراس في كثير من الأحيان تساعد على رفع رأس الجنين قليلا من الغشاء الذي يغطي المنطقة الشفافة.

الطبقة = "jove_content"> ونحن نحمل كل من الأقطاب الكهربائية مع أيدينا. ومع ذلك، وهذا يتطلب أيدي هادئة وثابتة وقليلا من الممارسة. منذ موقف الكاثود فوق الجنين، وهذا القطب يمكن ان تكون ثابتة إلى مياداة مجهرية. أن يترك واحد فقط الكهربائي إلى وضعه في موقف يدويا. سوف أقطاب قريبة جدا من أنبوب الجنين / العصبية شيط حرفيا الجنين ويؤدي إلى تشوهات التشريحية غير مرحب به. وبالتالي، ينبغي تعديل قوة الجهد بعناية إلى كل سلسلة من التجارب التي ينبغي اتخاذها والحذر عند وضع الأقطاب. وهذه الاحتياطات منع أي تشوهات شكلية، أو الخلوية الجزيئية الناجمة عن الإجراء في حد ذاته.

على الرغم من أن تنظر تركيزات الجينات في الخلية. جرعات مختلفة الجينات قد يكون لها تأثيرات مختلفة على الخلايا والأنسجة. يمكن أن يكون هناك تأثير عتبة المعنية (انظر Agoston وآخرون 17، على سبيل المثال) أو مختلفة، والآثار متدرج. نحن اختبار عادة diffeتركيزات استئجار مير معربا عن (0.5-2 ميكروغرام / ميكرولتر) النواقل وتحليل التغييرات في مورفولوجية أو البروتين / الجينات التعبير. يمكن اختبار آثار في الجسم الحي باستخدام المناعية، وأجهزة الاستشعار نواقل 18 أو الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين.

هذا الأسلوب يوفر أيضا لاختبار قوة وموقع أي نشاط من مير محددة في الجسم الحي باستخدام على سبيل المثال مضان المزدوج مراسل / استشعار ناقلات كما هو موضح في دي بيتري تونيلي آخرون 18. أنها تستخدم ناقلات التي تحتوي على GFP-مراسل وجهاز استشعار RFP مير. ويتبع طلب تقديم العروض من قبل تسلسل مير مجانية. في حين يحدد GFP التعبير في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل بنجاح، مضان أحمر (RFP) يشير إلى غياب مير التحقيق، واختفاء مضان أحمر ينم عن وجود مير. ويمكن أيضا أن هذه التقنية يمكن استخدامها لاختبار خصوصية الهدف مير في الجسم الحي، وذلك باستخدام 3'UTR من تسلسل الهدف في المصب من طلب تقديم العروض.معا هذا الأسلوب هو مناسبة للغاية للدراسات التنموية على التعبير الجيني وظيفة في الأنسجة المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

نحن نعترف K. Mikic، الذين ساهموا في المرحلة الأولى من هذا الفيلم وM. نيكولسكو للصورة مير. وأيد جيم هوبر من قبل الزمالة من IZKF من Universtitätsklinikum توبنغن، A. ألوين بريم اناند من قبل البرنامج ثروة من Universtitätsklinikum توبنغن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Borosillicate glass capillaries Hartenstein Model: 0.9 mm
Microcapillary puller WPI, Berlin Model: Pul1-E
Electroporator Intracel Model: TSSIC
Stereomicroscope - fluorescence LEICA Model: MZFLIII
Stereomicroscope Zeiss Model: Stemi
Camera and software Zeiss Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
  2. Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
  3. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
  4. Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
  5. Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
  6. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  7. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
  8. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  9. Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
  10. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
  11. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
  12. Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
  13. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
  14. Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. 294-2119 (2006).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
  16. Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
  17. Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
  18. De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
<em>في</em> التعبير <em>البيضة</em> من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط ​​الفرخ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huber, C., Prem Anand, A. A., Mauz, M., Künstle, P., Hupp, W., Hirt, B., Wizenmann, A. In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain. J. Vis. Exp. (79), e50024, doi:10.3791/50024 (2013).More

Huber, C., Prem Anand, A. A., Mauz, M., Künstle, P., Hupp, W., Hirt, B., Wizenmann, A. In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain. J. Vis. Exp. (79), e50024, doi:10.3791/50024 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter