Summary
ביטוי מחוץ לרחם הוא טכניקה אחת על מנת להבהיר את תפקיד רנ"א בהתפתחות המוח. עם זאת, מיקוד באזורים מסוימים באמצעות ב electroporation אובו הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים דרך יעילה לאזורי המוח התיכון הגחון ועל גב באופן סלקטיבי electroporate.
Abstract
RNAs ללא קידוד הם שחקנים נוספים בויסות ביטוי הגנים. ממוקד ב electroporation אובו של אזורים ספציפיים מספק כלי ייחודי לשליטה במרחב ובזמן של ביטוי microRNA מחוץ לרחם. עם זאת, מבנים מוחיים הגחון כמו המוח התיכון הגחון הם די קשים להגיע לכל מניפולציות. הנה, אנחנו מדגימים דרך יעילה לelectroporate מירנה למוח תיכון הגחון באמצעות אלקטרודות פלטינה דקות. שיטה זו מציעה דרך אמינה transfect אזורים ספציפיים של המוח התיכון וכלי שימושי במחקרי vivo.
Introduction
ההכרה של RNAs ללא קידוד הקטן כמו שחקנים נוספים לביטוי גנים השיקה מורכבות חדשות לרגולציה תכנות / גן הגנומי. יש מינים שונים של RNAs ללא קידוד חשיבות תפקודית בתאים עצביים, כוללים קטן RNAs 1-4 ללא קידוד. מיקרו RNA (miR או מירנה) למשל מראה פרופילי ביטוי שונים ומשתנים במוח המתפתח 5. ממוקדת ב electroporation אובו של עובר חומוס מספקת הזדמנות ייחודית לבקרת זמן ומרחב של ביטוי גנים והשתקה במהלך פיתוח.
סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים של ביצוע ביטוי מחוץ לרחם של מירס באזורים מסוימים של המוח התיכון חומוס שימוש באוב electroporation 6-10. כדי להבטיח השפעה ארוכה טווח של RNAs ללא קידוד אלה הקטנים בתאים, רצף ה-DNA של מירס היו משובט לתוך וקטורים מונו או דו cistronic. לב electroporation אובו, miR מכיל vEctor מוזרק לתוך הצינור עצבי המוח התיכון על ידי חשיפת העובר לאחר ביצוע חלון קטן בקליפת הביצה. כדי transfect אזורים ספציפיים במוח התיכון בתוספת הקטנה (האנודה) ומינוס (קטודה) אלקטרודות פלטינה ממוקמות בעמדות ספציפיות. עבור transfection המוח התיכון הגחון, האנודה ממוקמת מתחת למוח תיכון הגחון השמאל והקתודה מעל המחצית הימנית של המוח התיכון לפני היישום נוכחית. הפתיחה בקליפת הביצה סגורה עם קלטת ועוברים טופחו במשך כל זמן שנדרש לכל ניתוח. שיטה זו תוארה במקור על ידי Muramatsu et al. 6 ומשופרת על ידי Momose et al. 8 עבור transfection הספציפי לאזור.
סקירת סכמטי.
- העובר בביצה חשוף על ידי חיתוך חלון קטן לתוך הדואר קליפת ביצה.
- הווקטור (ים) מומס מוזרק לתוך המוח התיכון באמצעות נימי מיקרו.
- שתי אלקטרודות - המונחות במקביל או מתחת ומעל לעובר - ליצור שדה חשמלי פעם.
- השדה החשמלי temporally יוצר נקבוביות בקרום התא, המאפשר כניסה לתא על ידי-DNA הטעון השלילי (או RNA) נמשך להאנודה 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דרישות באוב Electroporation
- הכנת מבנה הווקטור: פריימרים תחושת miR וantisense תוכננו אחרי ההוראות של Ambion, annealed ואת הגבעול לApaI / EcoRI מתעכל וקטור U6.1 pSilencer. לאחר שינוי מוצלח אחד מהשיבוטים וכתוצאה מכך היה גדל ופלסמיד pSilencer היה מבודד על ידי שיטת תמוגה אלקליין באמצעות ערכת הכנת פוליפוני Quiagen.
- אלקטרודות: ניתן לרכוש אלקטרודות או בקלות להיבנות 13. אנו משתמשים באלקטרודות מתוצרת עצמית של חוט פלטינה (Φ = 0.2, 0.25, או 0.5 מ"מ קוטר) או במקרים מסוימים אלקטרודה חוט טונגסטן קטנה עוד יותר (Φ = 0.1 מ"מ) 8 תלוי באיזה אזור אנחנו רוצים electroporate. כדי להימנע מחריכה של רקמה, אנו משתמשים ככלל קרובים יותר לרקמה רזה האלקטרודות. עבור electroporation הרחב של המוח התיכון, אנו משתמשים 0.5 חוטי פלטינה מ"מ מולחמים לצינור נחושת / נירוסטהפיר וקבוע לבעל אלקטרודה עם מרחק של 3-5 מ"מ (איור 1). לelectroporate אזורים מסוימים, אנו משתמשים 0.25 אנודות חוט הפלטינה מ"מ וחוט פלטינה 0.2 מ"מ או טונגסטן מ"מ 0.1 לקתודה עם מרחק משוער של 1 מ"מ או פחות.
- פתרונות: האם את הפתרונות הבאים מוכנים:
- רינגר Autoclaved עוף, pH 7.5 (9.0 גרם NaCl, 0.42 גרם KCl, 0.24 CaCl2 גרם, מתמוסס ב1 ליטר מים מזוקקים).
- PBS (8 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 0.24 גרם KH 2 PO 4, 1.44 גרם Na 2 HPO 4, לפזר בH 2 O מזוקק 1 ליטר).
- גרין מהיר: 10 מ"ג / H 2 פתרון מניות מזוקק מיליליטר O
- דיו איטי ייבוש (פחות לכה ולכן פחות הרעלה לעובר). הערה: מסנן dichroic כחול מחובר למנורת סיבים אופטית כמתואר בקנטו-סולר ו14 אדלר משפר את החדות ויכול לבטל את הצורך להזריק דיו.
איור 1. תרשים סכמטי של אלקטרודות ובעל אלקטרודה. (A, B, C) חוט פלטינה היה מולחם בצד אחד של מוט צינור נירוסטה. חור נקדח לצד של פיר צינורי האחר כך שהתקע יכול להשתלב () האדום וחוטים בצבע כחולים היו מחוברים לתקע. בקצה השני החוט היה מצויד למחברי בננה שעובדים עם שקעי החשמל של electroporator. (A, C) חוט הפלטינה הייתי כפוף במלאך 90 מעלות. שכבה של לכה מסמר בודדה את המוט מעל לעיקול.
2. הכנות ישירות לפני באוב Electroporation
- להכין את החומר הבא:
- לדלל דיו עם רינגר עוף 01:06, להוסיף פתרון אנטיביוטיקת antimycotic (100x מGibco) 1:100.
- הכן פתרון וקטור: 1-2 מיקרוגרם / μl לDNA הספציפי בH 2 O בתוספת גרין המהיר (1:20).
- לעקר מלקחיים, מספריים, מחט טונגסטן ואלקטרודות עם 70% אתנול.
- משוך micropipettes להזרקת חומצת גרעין מנימי זכוכית בורוסיליקט (אורך לקוטר חיצוני: 100 מ"מ x 0.9 מ"מ). אנו משתמשים בחולץ פשוט PUL-1 (WPI, ברלין) עם ההגדרות שמוצגים בטבלה 1.
- הגדר את הפרמטרים של electroporator כפי שמוצג בטבלה 2.
| פרמטרים | ערכים |
| חום | 350 |
| משוך | 100 |
| מהירות 50 | |
| השהיה | 200 |
טבלת 1. הגדרות עבור PUL-1
| פרמטרים | ערכים |
| תדר | 50 הרץ |
| השהיה | 20-50 אלפיות שניים * |
| רוחב | 20 msec |
| מתח | 8-25 * V |
| דופק | 3 - 5 פעמים |
| * בהתאם לקוטר האלקטרודה ומרחק. אנאלקחת את זה בחשבון בעת שינוי אחד מהפרמטרים. | |
טבלה 2. הגדרות עבור ממריץ הדופק
- הכן עובר חומוס לelectroporation:
- דגירה ביצי תרנגולות מופרות על הצד הארוך יותר שלהם על 37 מעלות צלזיוס עם לחות 65% ל39 שעה לרכוש עוברים בין המבורגר והמילטון (HH) מביימת 15 9-11. העובר מתמקם בחלק העליון של הביצה, ולכן אתה צריך לסמן אותו עם קו עיפרון.
- לחטא את הביצים עם 70% אתנול.
- לנקב את הביצה בצד הרחב שלה, שבו חלל האוויר צריך להיות.
- הסר 1-2 מיליליטר של חלבון ביצה. זה יהיה לנתק את העובר מקליפת הביצה.
- צ'לו קלטת קליפת הביצה כדי למנוע רסיסי פגז נופלים על העובר. השתמש במספריים כדי לחתוך חלון קטן לתוך קליפת הביצה סביב קו העיפרון.
- להזריק קצת דיומתחת opaca האזור כדי להמחיש את העובר.
- לעשות חתך בקרום vitelline עם מחט טונגסטן חידדה כדי להשיג נגישות טובה יותר של העובר להזרקת חומצות גרעין וelectroporation.
3. Electroporation ודגירה
- הוסף כמה טיפות של תמיסת רינגר החם על העוברים. זה יפחית את העוברים, כדי למנוע התחממות יתר, דבק של האלקטרודות לרקמה ולספק מדיום לנוכחי בין שתי אלקטרודות.
- להזריק את פתרון הווקטור לתוך לומן של הצינור העצבי ברמת המוח התיכון. אם וקטור ביטוי הדנ"א שלכם לא מכיל גן מדווח (למשל EGFP), להוסיף וקטור מעט נמוך יותר מרוכז כתב גן (1 מיקרוגרם / μl miR להביע וקטור ל0.9 מיקרוגרם / וקטור גן כתב μl) לפתרון ה-DNA. זה יבטיח כי אתה מזהה תאים transfected כעבור 8. אנו משתמשים וקטור pCAX מה שנקרא, מתנה מסוג לכאן ולכאןמ 'ג קרול 13.
- עבור transfection רחב של המוח התיכון, הנח את האלקטרודות ימין ועל שמאל של העובר בשיאו של המוח התיכון. המרחק בין האלקטרודות צריך להיות בסביבות 3-5 מ"מ. הגדרות האחרות הן 15V, 20 פולסים אלפיות שניים ועיכוב אלפיות 50 לHH 10. שינוי המיקום של שתי אלקטרודות במקצת לאורך ציר dorso-הגחון (DV) של המוח התיכון מבטיח יותר transfection רחב של תאי transfection ציר DV.
- עבור transfection הגחון, להוסיף קצת Ringer להעלות את הראש מקרום החלמון והנח את האנודה מתחת המוח התיכון הגחון. אם הראש לא עולה לדחוף את האלקטרודה תחת הקרום המפריד בין חלמון ועובר, כדי למנוע חריכה של הצינור העצבי. הקתודה צריכה להיות ממוקמת מעל dorso-רוחבי המוח התיכון הפוך להאנודה. אל תיגע בצינור העצבי. אנו transfect מחצית הגחון השמאלית של המוח התיכון, כדי למנוע כל קשיים בהתפתחות לב. המרחק בין האלקטרודותהוא סביב 1-0.5 מ"מ, שאר ההגדרות 10V, 20 רוחב אלפיות ועיכוב אלפיות 50.
- יחול ירידה נוספת של תמיסת מלח על גבי העוברים כדי לצנן אותה ולהסיר בועות אוויר.
- חותם את הביצים עם הקלטת ודגירה של לפחות 4 שעות; הזמן המינימאלי הנדרש לביטוי וקטור.
4. קיבוע של עוברי עופות
- הסר את העוברים מהביצים שלהם.
- עוברים נקיים מתחת סטראו ולהעריך עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו המידה של transfection.
- תקן את העוברים במשך לילה PFA 4% ב 4 ° C. להמשיך עם חתך ו / או הכתמה (הכלאה באתרו, אימונוהיסטוכימיה) כדי לנתח את השינויים באזור transfected.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באזור המוח התיכון transfected עם miR המידה גלויה דרך הביטוי של ה-GFP מוקטור כתב הזריק יחד עם הווקטור להביע miR (איור 2). באמצעות אלקטרודות פלטינה עם קוטר של 0.5 מ"מ והניח במקביל לציר AP של מוביל המוח התיכון בדרך כלל לtransfection של שטח נרחב לאורך DV-AP והציר, ובכלל זה למוח האחורי, המוח התיכון ולפעמים diencephalon (2A דמויות ו-B). הגודל של תוצאות אלקטרודות בשדה חשמלי רחב שהוחל על האזור במוח ובכך אזור transfected רחב.
קשה למקד את אזור כמו למשל המוח התיכון הגחון בצורה מדויקת. צמצום המרחק בין האלקטרודות 0.5 מ"מ כדי להשיג שדה חשמלי קטן הוא לעתים קרובות רעיל לעובר וגורם לחפצים. אנחנו השתמשנו אלקטרודות עם קטרים קטנים יותר (0.2 מ"מ, פלטינה 0.25 מ"מ או 0.1 מ"מ תיל טונגסטן חידד), אשר מציעים טרה מקומית יותרnsfection כמו זה של מוח הגחון, וזה קשה להגיע (איורים 2C-I). אלקטרודות קטנות יותר להפחית את השדה החשמלי מיושם ולאפשר להכניס את האלקטרודות קרובה הרבה יותר לרקמות. איור 2F מראה דוגמא, שבו המוח התיכון הגחון כולו היה transfected. איורים 2G ו 2H אזורי הגחון transfected הם קטנים יותר, אבל חלק מהמוח האחורי (2F) או diencephalon (2H) גם הם transfected. באיור 2G, האנודה הושמה במוח האחורי באמצע וכדי transfect שני אזורי הגחון. איור 2H מראה דוגמא של האנודה אינה מבודדת היטב עם מסמר לכה לאורך הפיר. לפיכך, לא רק הגחון סביב MHB האזור מבטא miR / GFP אלא גם mes-והגבה קדמי di-גזע המוח, שבו הפיר של האנודה הונח. הפצת miR / GFP הגחון הספציפי בדמויות 2C-I היא תוצאה מהמקומיתשדה חשמלי אנחנו מיישמים עם אלקטרודות הקטנות יותר. יחדיו, עם אלקטרודות קטנות ושדות חשמליים שאנחנו יכולים לבטא את ה-DNA / RNA באזורים מוגבלים יותר כמו המוח התיכון הגחון.
מאז וקטור ביטוי microRNA שלנו לא מכיל גן כתב, אנחנו מערבבים בGFP להביע וקטור על יחס של 1 מיקרוגרם / μl ל0.9 מיקרוגרם / μl, בהתאמה. היחס כמעט שווה מבטיח שאזור microRNA וGFP transfected כמעט לחלוטין חפיפה (ראה Momose et al. 8 וניסיון שלו). כדי להיות מסוגל לשפוט את המידה של אזור transfected הופך להיות חשוב כאשר רק שטח קטן המכיל סוגי תאים מסוימים הוא transfected או תאי transfected משמשים לqRT-PCR. ריכוז הרבה פחות של גן הכתב עלול להוביל לתאים להביע GFP מתחת לרמת הגילוי. עוצמתו של הביטוי של כל וקטור transfected תלוי לא רק בריכוז של הווקטור בשימוש, אלא גם על האמרגן. הווקטורים שלנו הם driv U6-האמרגןen (להביע מירנה) והאמרגן SS-אקטין מונעים (המבטאים חלבוני ניאון) ונמצאים בכל מקום ובהן פעיל constitutively בעובר האפרוח.
רוב העוברים שלנו electroporated בצד השמאל, פרט לאיור 2C (תמונת ראי). עבור ניסויי זמן לשגות, electroporation של הצד הימני של העובר מומלץ שכן רוב העוברים לסובב את ראשם לכיוון הימין ולשכב על צד השמאל שלהם.
איור 2. נציג תוצאות. עוברי electroporated בין HH10 וHH11 וקבועים בשלבים מצויינים בתמונות. (AC) electroporations מופע של המוח התיכון הגבי, ו( DI) של המוח התיכון הגחון. החיצים ב( D, E) עולה, תאי GFP חיוביים ממוקמים ventrally. לפרטים נוספים ראה טקסט. Mes- Mesencephalon / המוח התיכון, די - diencephalon, תל - telencephalon, Rhom - rhombencephalon / המוח האחורי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
וידאו זה מדגים שיטה יעילה לtransfect פלסמיד לתוך תאי neuroepithelial של אזורים הספציפיים של המוח התיכון החומוס. פולסים חשמליים מלבניים של מתח נמוך יכולים להציג את ה-DNA לתוך תאים של הצינור העצבי החומוס באוב 6,16. עם זאת, הדיוק של מיקוד DNA מתעכבת לעתים קרובות על ידי השדה החשמלי הרחב, שעולה דרך אלקטרודות גדולות יחסית (Φ = 0.5 מ"מ). ניסינו להתמודד עם בעיה על ידי שימוש באלקטרודות קטנות יותר בקוטר פועל בהתאם להנחיות של Momose et al. 8. עבור transfection המוח התיכון הגחון, אנחנו מקום הקתודה תחת הקרום של האזור pellucida או אם גיל העובר מאפשר לה ישירות מתחת למוח תיכון הגחון. התרחיש האחרון צריך קצת תרגול מאז רקמת צינור המוח התיכון / עצבית לא צריכה לגעת בו ונפגעה על ידי האנודה. הוספת רינגר יכול לעתים לעזור להרים את ראשו של העובר מעט מעל הקרום המכסה את האזור pellucida.
class = "jove_content"> אנחנו מחזיקים שני אלקטרודות בידיים שלנו. עם זאת, הדורש ידיים רגועות ויציבה וקצת תרגול. מאז את עמדתו של הקתודה היא מעל לעובר, אלקטרודה זו יכולה להיות קבועה לmicromanipulator. זה משאיר רק אחד אלקטרודה להיות הכניסה לתוך מיקום באופן ידני. אלקטרודות קרובים מדי לצינור העובר / עצבי, פשוטו כמשמעו, תצרובנה את העובר ולגרום למום אנטומי לא רצוי. לפיכך, עוצמת המתח צריכה להיות מותאמת בקפידה לכל סדרה יש לנקוט ניסויים וטיפול בעת ביצוע את האלקטרודות. אמצעי זהירות אלה ימנע כל מום מורפולוגיים, סלולארי או מולקולרי הנגרם על ידי ההליך עצמו.
למרות לשקול ריכוזי גן נמצא בתא. אולי יש מינוני גנים שונים השפעה שונה על תאים ורקמות. יכולה להיות שיש השפעת סף מעורבת (ראה Agoston et al. 17, למשל) או אפקטים שונים, מדורגים. בדרך כלל אנחנו לבדוק diffeריכוזי השכרה של miR להביע וקטור (0.5-2 מיקרוגרם / μl) ולנתח את השינויים במורפולוגיה או חלבון / ביטוי גנים. ניתן לבדוק השפעות in vivo באמצעות אימונוהיסטוכימיה, חיישן וקטורי 18 או RNA הכלאה באתרו.
טכניקה זו מציעה גם לבדוק את כוח ואת מיקום של כל פעילות של miR ספציפי in vivo באמצעות למשל וקטור כתב / חיישן הקרינה כפול כפי שמתואר בDe Pietri Tonelli et al. 18. הם משתמשים בוקטור המכיל GFP-כתב וחיישן RFP miR. RFP ואחריו רצף miR חינם. בעוד הביטוי של GFP מזהה את תאי transfected בהצלחה, הקרינה אדומה (RFP) מציינת את היעדרם של miR נחקר, והיעלמותה של הקרינה אדומה מסגירה את נוכחותו של מיר. גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבדוק את הספציפיות של יעד miR in vivo, באמצעות 3'UTR של רצף המטרה במורד הזרם של RFP.יחדיו בטכניקה זו היא מתאים ביותר עבור מחקרים התפתחותיים על ביטוי גנים ותפקוד ברקמות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו מכירים ק Mikic, שתרם לשלב הראשוני של הסרט הזה ומ Nicolescu לתמונת miR. ג הובר נתמכה על ידי מענק של IZKF של טובינגן Universtitätsklinikum, א 'אלווין הפר אנאנד על ידי תכנית ההון של טובינגן Universtitätsklinikum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope - fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
- Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
- Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
- Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
- Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
- Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
- De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
