腹チック中脳マイクロRNAの発現OVO中

Summary

異所性発現は、脳の発達におけるマイクロRNAの役割を解明する一つの技術である。しかし、OVOエレクトロポレーションに使用して特定の領域を標的とすることは困難である。ここでは、選択的に腹側と背側中脳領域を電気穿孔するための効率的な方法を示しています。

Abstract

非コードRNAは、遺伝子発現を調節する追加のプレーヤーである。特定分野のOVOエレクトロポレーションで対象となるには、異所性マイクロRNA発現の空間的および時間的制御のためのユニークなツールを提供しています。しかし、腹側中脳のような腹脳構造は、任意の操作のために到達することはかなり困難である。ここでは、薄い白金電極を用いて、腹側中脳へのmiRNAを電気穿孔するための効率的な方法を示しています。この方法では、中脳とのin vivo研究のための有用なツールの特定の領域をトランスフェクトするために信頼性の高い方法を提供しています。

Introduction

遺伝子発現のための追加的な選手のような小さな非コードRNAの認識は、ゲノムのプログラミング/遺伝子調節に新しい複雑さを立ち上げました。非コードRNAの異なる種は、小さな非コードRNA ^1-4を含む神経細胞における機能的重要性を有する。例えばマイクロRNA（MIRまたはmiRNA）は、脳^5の開発にはっきりと変化する発現プロファイルを示している。ニワトリ胚のOVOエレクトロポレーションで対象とすることは、開発中の遺伝子発現と抑制の時間的·空間的制御のためのユニークな機会を提供します。

このビデオでは、エレクトロポレーション^6月10日 OVOで使用したニワトリ脳の特定の領域にmiRの異所性発現を実施する様々なステップを示しています。細胞におけるこれらの小さな非コードRNAの長期持続効果を確実にするために、miRのDNA配列は、モノ - 又はバイシストロニックベクターにクローニングした。 OVOエレクトロポレーション中の場合は、のmiRは、Vを含む注入器は、卵の殻に小さな窓を作った後に胚を曝露することにより、中脳、神経管に注入される。中脳の小さなプラス（アノード）とマイナス（カソード）の特定の領域をトランスフェクトするために白金電極は、特定の位置に配置されている。腹側中脳トランスフェクションのために、アノードは、左腹側中脳と電流を適用する前に、中脳の右半分上記カソードの下に配置されている。卵殻の開口部をテープで閉じられ、胚であれば、どのような分析に必要とされるようにインキュベートする。この方法は、もともと村松ら ⁶で説明した特定領域のトランスフェクションのため百瀬ら ⁸向上した。

回路図の概要。

1. 卵内の胚は、目に小さなウィンドウを切断することによって公開されているE卵殻。
2. 溶解したベクター（単数または複数）は、マイクロキャピラリーを用いて中脳に注入される。
3. 2つの電極は - 並列配置された、または胚の下で、上 - パルス電界を発生させる。
4. 電界は、時間的に陽極^11,12に引き付け負に荷電したDNA（またはRNA）による細胞への侵入を促進する細胞膜に孔を作成する。

Protocol

1。 でのOVOエレクトロポレーションのための要件

1. ベクター構築の準備：のmiRセンスおよびアンチセンスプライマーは、Ambion社の指示の後に設計をアニールおよびApaI / EcoRIでに連結したのpSilencer U6.1ベクトルを消化。成功した形質転換後、得られたクローンの一つは、成長したとのpSilencerプラスミドをキアゲンミディ調製キットを用いてアルカリ溶解法によって単離した。
2. 電極：電極を購入することができたり、簡単^13を構築すること。我々は電気穿孔したい地域によっては⁸より小さなタングステンワイヤ電極（Φ= 0.1 mm）を自作白金線電極（Φ= 0.2、0.25、または直径0.5mm）を使用するか、またはいくつかのケースでは。組織の灼熱のを回避するために、我々は組織電極シンナーに近いルールとして使用しています。中脳の広範なエレクトロポレーションのために、我々は真鍮/ステンレスチューブ状に半田付け0.5ミリメートルの白金線を使用シャフト、3〜5 mmでの距離（ 図1）と電極ホルダに固定されている。特定の領域をエレクトロポレーションするために、我々は、0.25ミリメートル白金線アノード0.2mmの白金線又は1mm以下のおおよその距離とカソード用の0.1mmのタングステンを使用する。
3. 解決策：次の解決策を用意しておいてください。
   1. オートクレーブしたチキンリンガー、pHは7.5（9.0グラムのNaCl、0.42グラムのKCl、0.24グラムの塩化カルシウムを、1リットルの蒸留水に溶解する）。
   2. PBS（8gのNaCl、0.2gのKCl、0.24グラムのKH ₂ PO4、1.44グラムのNa ₂ HPO _4、1リットルの蒸留H ₂ Oに溶解する）。
   3. ファストグリーン：ストック溶液10 mg / mlの_蒸留水
   4. 遅乾性インク（少ないシェラック、したがって胚にはあまり中毒）。注：カント·ソレルとアドラー¹⁴に記載のように、光ファイバ·ランプに取り付けられた青色ダイクロイックフィルタは、コントラストを高め、インクを注入する必要性をなくすことができる。

図1。電極と電極ホルダーの模式図。 （A、B、C）白金ワイヤはステンレススチール管状シャフトの一側に半田付けした。穴は、このようにそのピンプラグ（A）は赤と青のカラーワイヤがピンプラグに接続されていたインチ合うことができる管状シャフトの反対側に開けた。反対側の端にワイヤがエレクトロの電気ソケットを扱うバナナコネクタに装着した。（A、C）白金線は、90°の天使に折り曲げた。マニキュアの層は曲がり上記シャフトを単離した。

2。直接には、OVOエレクトロポレーション前の準備

1. 次の材料を準備します。
   1. チキンリンガー1時06インクを希釈、Gibcから抗生物質 - 抗真菌溶液（100Xを追加O）1:100。
   2. ファストグリーン（1:20）を補充し、H ₂ O中の特定のDNAあたり1〜2μgの/μL：ベクター溶液を準備します。
   3. 70％エタノールで、鉗子、はさみ、タングステン針と電極を滅菌する。
   4. ホウケイ酸ガラスキャピラリー（100ミリメートル×0.9ミリメートル、外径までの長さ）から核酸注入にマイクロピペットを引き出します。私たちは、 表1に示した設定で簡単なプラーPUL-1（WPI、ベルリン）を使用します。
   5. 表2に示すように、エレクトロのパラメータを設定します。

パラメータ	値
熱	350
引っ張る	100
速度 50
遅延	200

表1。 PUL-1の設定

パラメータ	値
周波数	50 Hzの
遅延	20から50ミリ秒*
幅	20ミリ秒
電圧	8-25のV *
パルス	3から5倍
*電極の直径及び距離に応じ。どうぞいずれかのパラメータを変更する際にそれを考慮。

表2。パルス刺激装置の設定

2. エレクトロポレーションのためのニワトリ胚を準備します。
   1. ハンバーガー＆ハミルトン（HH）の間の胚を取得するために39時間、65％の湿度で37℃で、その長い側のニワトリ受精卵を培養するには^、15 9月11日ステージ。胚は、卵子の最上部に落ち着くで登録して、鉛筆のラインでそれをマークする必要があります。
   2. 70％エタノールで卵を消毒。
   3. エアキャビティがどこにあるべきか、そのより広い側面に卵を貫通。
   4. 卵白1〜2mlのを削除します。これは卵の殻から胚を切り離します。
   5. セロテープ胚に落下シェル破片を避けるために卵殻。鉛筆の線を中心に卵殻に小さなウィンドウをカットするはさみを使用してください。
   6. インクのビットを注入胚を可視化する暗域の下に。
   7. 核酸注入およびエレクトロポレーションのための胚のより良いアクセシビリティを実現するために、鋭利なタングステン針と卵黄膜にカットをする。

3。エレクトロポレーションおよびインキュベーション

1. 胚上に暖かいリンゲル液を数滴を追加します。これは、胚を下げる組織への電極の過熱、粘着を防止し、両電極間の電流のための媒体を提供する。
2. 中脳レベルでの神経管の内腔にベクター溶液を注入する。あなたのDNA発現ベクターはなく、レポーター遺伝子（ 例えば、EGFP）が含まれていない場合は、DNA溶液にわずかに低い濃縮レポーター遺伝子ベクター（0.9μgの/μlのレポーター遺伝子ベクターにベクターを発現する1μgの/μlでのmiR）を加える。これは、後で⁸トランスフェクトした細胞を認識することを保証します。我々は、いわゆるpCAXベクトル、あちこちの親切な贈り物を使用するC.クルル¹³メートル。
3. 中脳の広範なトランスフェクションのために、中脳の高さで、胚の左側電極と右側に配置します。電極間の距離は3〜5 mmでなければなりません。他の設定は15V、20ミリ秒パルスとHH 10のため50ミリ秒の遅延である。少し中脳の背腹側（DV）軸に沿って2つの電極の位置を変更しても、細胞のより広範なトランスフェクションのDV軸クションを保証します。
4. 腹側トランスフェクションのために、卵黄膜から頭を上げ、腹側中脳の下にアノードを配置するためにいくつかのリンガーを追加します。頭が上がらない場合は、神経管のような暑さを避けるために、卵黄と胚を分離する膜の下に電極を押してください。陰極は陽極に反対背側方に、中脳の上に配置する必要があります。神経管に触れないでください。我々は、心臓の開発にあらゆる困難を避けるために、中脳の左腹側半分をトランスフェクト。電極間距離周りの1〜0.5ミリメートル、残りの設定された10V、20ミリ幅と50ミリ秒の遅延がある。
5. それを冷却し、気泡を除去するために胚の頂部に生理食塩水の別の降下を適用する。
6. テープで卵を密封し、少なくとも4時間インキュベートする。ベクトル表現のために必要な最小時間。

4。ニワトリ胚の固定

1. その卵から胚を取り出します。
2. 実体顕微鏡下で蛍光実体顕微鏡を用いたトランスフェクションの程度を評価きれいな胚。
3. 4℃で4％PFA中で一晩胚を修正しました。トランスフェクトエリアの変化を分析するために（in situハイブリダイゼーション 、 免疫組織化学）切片および/ ​​または染色を進める。

Representative Results

のmiRをトランスフェクトした脳領域の範囲は、miR発現するベクター（ 図2）と一緒に注入されたレポーターベクターからのGFPの発現を介して見ることができる。直径0.5mmの白金電極を用い、後脳、中脳、間脳、時には（ 図2AおよびB）を含む、DVおよびAP-軸に沿った広い領域のトランスフェクションに通常中脳リードのAP軸に平行に配置された。広い電界における電極結果の大きさは、脳領域と、広いトランスフェクト領域に適用。

正確例えば、腹側中脳のような領域を標的とすることは困難である。小さな電界を達成するために、0.5mmの電極間の距離を低減することは、多くの場合、胚に対して毒性であり、アーティファクトをもたらす。私たちは、より局所的なTRAを提供する小さな直径（0.2ミリメートル、0.25ミリメートルの白金やタングステン線シャープに0.1ミリメートル）で電極を使用（ 図2C-I）に到達することは困難である腹側脳のようなnsfection。小さ ​​な電極は印加される電界を低減し、組織に非常に近い電極を挿入することができます。 図2Fは、腹側中脳全体をトランスフェクトした例を示している。 図2Gおよび2Hにトランスフェクト腹領域が小さくなっているが、後脳（2F）の一部または間脳（2H）もトランスフェクトされる。 図2Gでは、アノードは腹側領域の両方をトランスフェクトするために中·後脳下に置いた。 図2Hはよくシャフトに沿っマニキュアと分離されていない負極の例を示しています。このように、MHBの周りの腹側領域ではないだけは、miR / GFPだけでなく、アノードのシャフトが置かれていた背側前方MESおよびジ脳を、表現しています。 図2C-Iの特定の腹側のmiR / GFPの分布は地元からの結果である電場、我々はより小さな電極を適用します。一緒になって、より小さな電極と電場と我々は腹側中脳のような、より制限された領域内のDNA / RNAを表現することができます。

当社のマイクロRNA発現ベクターはなく、レポーター遺伝子を含んでいないので、我々はそれぞれ0.9μgの/μL、1μgの/μLの割合でベクターを発現GFPで混ぜる。ほぼ同等の比率は、マイクロRNAおよびGFPトランスフェクトエリアはほぼ完全にオーバーラップ（百瀬ら ⁸と自らの経験を参照）ことが保証されます。特定の細胞型を含む小さな領域のみがトランスフェクトされるか、またはトランスフェクトされた細胞を、定量RT-PCRのために使用されるときにトランスフェクトされた領域の程度を判断することができるようにすることが重要となる。レポーター遺伝子のはるかに少ない濃度は検出レベルの下でGFPを発現する細胞につながる可能性がある。任意のトランスフェクトベクターの発現の強さは、使用するベクターの濃度にだけでなく、プロモーターにも依存。当社のベクトルは、U6プロモーターDRIVですEN（miRNAをを発現する）およびβ-アクチンプロモーターが駆動（蛍光タンパク質を発現する）との両方ニワトリ胚での偏在的かつ恒常的に活性である。

私たちの胚のほとんどは、 図2C（鏡像）を除いて左側にエレクトロポレーションされています。ほとんどの胚は、その左側に、右と嘘に向けて頭を回してからの時間経過の実験では、胚の右側のエレクトロポレーションをお勧めします。

図2。代表的な結果。胚はHH10とHH11の間でエレクトロポレーションや写真で示した段階で固定した 。 （AC）は腹側中脳の背側中脳のエレクトロポレーションを示し、（DI）。 （D、E）の矢印は腹側に位置して、GFP陽性細胞を示す。詳細は本文を参照。 MES- 中脳/中脳、ディ - 間脳、電話番号 - 終脳、ローム - 菱脳/後脳。

Discussion

このビデオでは、ニワトリ脳の特定の領域の神経上皮細胞にプラスミドをトランスフェクトする効果的な方法を示しています。低電圧の長方形の電気パルスは、OVO ^6,16 内のひよこ神経管の細胞にDNAを導入することができます。しかし、DNAのターゲティングの精度は、多くの場合、比較的大きな電極（Φ= 0.5mm）を通って上昇幅の電界によって妨げられる。私たちは、百瀬らのガイドラインに従って直径が小さい電極を使用して、その問題に取り組むことを試みた^。8。腹側中脳トランスフェクションのために、私たちは地域帯の膜の下や胚の年齢が直接腹側中脳の下で許可されていれば、カソードを配置します。神経/脳管組織は、陽極で触れると破損することはありませんので、最後のシナリオは少し練習が必要です。リンガーを追加すると、多くの場合、少し面積透明帯をカバーする膜から胚の頭を持ち上げるのを助けることができる。

細胞内にある遺伝子の濃度を考慮することはない。異なる遺伝子の投与量は、細胞や組織に対して異なる効果があるかもしれません。そこ（例えば、アゴストら ^17を参照）に関与閾値効果であるか又は異なって、段階的な効果ができる。私たちは通常、diffeテストのmiRの家賃濃度（0.5〜2μgの/μL）ベクターを発現し、形態やタンパク質/遺伝子発現の変化を分析する。効果は免疫組織化学を用いてインビボで試験することができる、センサはin situハイブリダイゼーション¹⁸またはRNAベクトル。

この技術はまた、デトネリPietri氏ら ¹⁸に記載されるように、例えば二重蛍光レポーター/センサベクターを用いてインビボで特定のmiRの任意の活性の強さおよび位置をテストするために提供する。これらは、GFP-レポーターおよびRFPのmiRセンサーを含むベクターを使用しています。 RFPには無料のmiRシーケンスが続いている。 GFP発現は正常にトランスフェクトされた細胞を識別しながら、赤色蛍光（RFP）を調査したmiRが存在しないことを示し、赤色蛍光の消失は、miRの存在を裏​​切る。この技術は、RFPの下流の標的配列の3'UTRを用いて、 インビボでのmiR標的の特異性を試験するために使用することができる。一緒になって、この技術は、異なる組織における遺伝子発現と機能に関する発達研究のために非常に適しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope - fluorescence	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscope	Zeiss		Model: Stemi
Camera and software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8