Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

В ово выражения микроРНК в Брюшной Chick мозга

doi: 10.3791/50024 Published: September 16, 2013

Summary

Внематочная выражение одна техника для выяснения роли микроРНК в развитии мозга. Тем не менее, ориентированные на конкретные области применения в ово электропорации является сложной задачей. Здесь мы покажем это эффективный способ выборочно электропорации брюшной и спинной среднего мозга регионы.

Abstract

Некодирующих РНК дополнительные игроки в регуляции экспрессии генов. Целевые в ово электропорации конкретных областях предоставляет уникальный инструмент для пространственного и временного контроля эктопической экспрессии микроРНК. Тем не менее, брюшные структуры мозга, как брюшной мозга довольно трудно достичь за любые манипуляции. Здесь мы демонстрируем эффективный способ электропорации микроРНК в брюшной мозга с помощью тонких платиновых электродов. Этот метод предлагает надежный способ трансфекции конкретных областей мозга и полезный инструмент для естественных условиях исследования в.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Признание малых некодирующих РНК в качестве дополнительных игроков для экспрессии генов запустила новый сложность геномной регуляции программирования / генов. Различные виды некодирующих РНК имеют функциональное значение в нервных клетках, в том числе малого некодирующих РНК 1-4. Микро РНК (микроРНК или микроРНК), например отчетливые и меняющиеся профили экспрессии в развивающихся мозгах 5. Целевые в ово электропорации куриных эмбрионов обеспечивает уникальная возможность для временной и пространственной контроля экспрессии генов и молчания во время развития.

Это видео демонстрирует различные этапы выполнения эктопическая экспрессия Мирс в конкретных областях куриного мозга использования в ово электропорации 6-10. Для обеспечения длительный эффект этих маленьких некодирующих РНК в клетках, последовательность ДНК Мирс, были клонированы в моно-или би-cistronic векторов. Ибо в ово электропорации, микроРНК, содержащий VEctor вводят в среднего мозга нервной трубки, подвергая эмбрион после внесения небольшое окно в яичной скорлупы. Для трансфекции конкретных областей среднего мозга небольшом плюсе (анод) и минус (катод) платиновые электроды размещаются на определенных позициях. Для среднего мозга вентральной трансфекции, анод находится под левой вентральной мозга и катодом над правой половине мозга перед нанесением ток. Отверстие в скорлупе закрывают лентой и эмбрионы инкубировали в течение тех пор, пока требуется для любого анализа. Этот метод первоначально был описан Мурамацу соавт. 6 и улучшить Momose соавт. 8 для конкретной области трансфекции.


Принципиальная Обзор.

  1. Эмбрион в яйце подвергается путем разрезания небольшое окно в гоэ яичной скорлупы.
  2. Растворенный вектор (ы) вводят в мозге с помощью микро капилляр.
  3. Два электрода - размещенные параллельно или под и над эмбриона - генерировать импульсного электрического поля.
  4. Электрическое поле временно создает поры в клеточной мембране, которые облегчают вход в клетку отрицательно заряженным ДНК (или РНК) привлек к аноду 11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Требования к In ово электропорации

  1. Подготовка векторную конструкцию: Мир смыслового и антисмыслового праймеров были разработаны после инструкциями Ambion, отжигают и лигируют в ApaI / EcoRI переваривается pSilencer U6.1 вектор. После успешной трансформации одной из полученных клонов выращивают и pSilencer плазмиду выделяли методом щелочного лизиса с использованием миди подготовка комплекта Quiagen.
  2. Электроды: Электроды могут быть куплены или легко быть построены 13. Мы используем самодельные электроды платиновой проволоки (Φ = 0,2, 0,25 или 0,5 мм в диаметре) или в некоторых случаях даже меньше вольфрамовой проволоки электрод (Φ = 0,1 мм) 8 в зависимости от области мы хотим электропорации. Чтобы избежать подгорания ткани мы используем, как правило, ближе к ткани тонкой электроды. Для широкого электропорации мозга мы используем 0,5 мм платиновые провода припаяны к латунь / нержавеющая сталь трубчатыевал и крепится к держателю электрода с расстоянием 3-5 мм (рис. 1). Для электропорации конкретные области, мы используем 0,25 мм платиновой проволоки аноды и 0,2 мм провод платины или 0,1 мм вольфрам для катода с расстоянии около 1 мм или менее.
  3. Решения: имеют следующие решения готовы:
    1. Автоклавного курица Рингер, рН 7,5 (9,0 г NaCl, 0,42 г KCl, 0,24 г CaCl2, растворить в 1 л дистиллированной воды).
    2. PBS (8 г NaCl, 0,2 г KCl, 0,24 г KH 2 PO 4, 1,44 г Na 2 HPO 4, растворяют в 1 л дистиллированной H 2 O).
    3. Быстрый зеленый: решение складе 10 мг / мл дистиллированной H 2 O
    4. Медленный высыхание чернил (менее шеллак и, следовательно, менее отравления для эмбриона). Примечание: синий дихроичный фильтр крепится к волоконно-оптической лампы, как описано в Canto-Солер и Адлера 14 усиливает контраст и может устранить необходимость придать чернил.


Рисунок 1. Принципиальная схема электродов и держателя электрода. (A, B, C) ​​Платина провод припаян к одной стороне нержавеющей стали трубчатом валу. Отверстие было просверлено в другой стороне трубчатого вала таким образом, что штырьковые вилки может вместить в (A) Красные и синие цветные провода были соединены с контактными штекерами. На противоположном конце провода был установлен на банановых разъемов, которые работают с электрическими розетками из электропоратора. (А, С) платиновая проволока была согнута в ангела 90 °. Слой лака для ногтей изолировали над изгибом вала.

2. Подготовка Непосредственно до этого в ово электропорации

  1. Подготовьте следующие материалы:
    1. Развести Ink с куриным Ringer 1:06, добавить к антибиотикам противогрибкового раствора (100x от GIBCо) 1:100.
    2. Подготовка вектор решение: 1-2 мкг / мкл на специфической ДНК в H 2 O, дополненной Быстрый зеленый (1:20).
    3. Стерилизовать щипцов, ножницы, вольфрамовой иглы и электродов с 70% этанола.
    4. Потяните микропипетки для инъекций нуклеиновой кислоты из боросиликатного стекла капилляров (длина до наружного диаметра: 100 мм х 0,9 мм). Мы используем простой съемник ПУЛ-1 (WPI, Берлин) с настройками, показанными в таблице 1.
    5. Установка параметров электропоратора, как показано в таблице 2.
Параметры Величины
Тепло 350
Тянуть 100
Скорость 50
Задержка 200

Таблица 1. Настройки для ПУЛ-1

Параметры Величины
Частота 50 Гц
Задержка 20 - 50 мс *
Ширина 20 мс
Напряжение 8-25 V *
Импульс 3 - 5 раз
* В зависимости от диаметра электрода и расстояния. Пожалуйстапринять это во внимание при изменении одного из параметров.

Таблица 2. Установки для Pulse Стимулятор

  1. Подготовка куриного эмбриона для электропорации:
    1. Выдержите оплодотворенные куриные яйца на их длинной стороне при 37 ° С с 65%-ной влажности на 39 часа, чтобы приобрести эмбрионов между Гамбургер & Hamilton (HH) ступеней 15 9-11. Эмбрион оседает в самой верхней части яйца, так что вы должны пометить его с карандашом линии.
    2. Лечить яйца с 70% этанола.
    3. Пирс яйцо на его широкой стороне, где воздушная полость должна быть.
    4. Удалить 1-2 мл яичного белка. Это будет отделить зародыш от скорлупы.
    5. Виолончель-лента яичной скорлупы, чтобы избежать осколков снарядов, падающих на эмбриона. Используйте ножницы, чтобы вырезать небольшое окно в яичной скорлупы вокруг карандашом линию.
    6. Введите немного чернилпод площадью Opaca визуализации эмбриона.
    7. Сделайте надрез в желточной оболочки с заостренным вольфрамовой иглы достижения лучшего доступа к эмбриона для инъекций нуклеиновых кислот и электропорации.

3. Электропорация и Инкубационный

  1. Добавить несколько капель раствора теплый Рингера на эмбрионах. Это позволит снизить эмбрионов, предотвращения перегрева, торчащие из электродов в ткани и обеспечить среду для тока между двумя электродами.
  2. Введите вектор решение в просвет нервной трубки на уровне среднего мозга. Если ваш вектор экспрессии ДНК не содержит ген-репортер (например EGFP), добавить немного ниже концентрированный гена вектор репортера (1 мкг / мкл микроРНК, выразив вектор до 0,9 мкг / мкл гена вектора репортера) для раствора ДНК. Это будет гарантировать, что вы признаете трансфицированные клетки позже 8. Мы используем так называемый pCAX вектор, доброе подарок сюдам С. Круль 13.
  3. Для широкого трансфекции среднего мозга, поместите электроды слева и справа от эмбриона на высоте среднего мозга. Расстояние между электродами должно быть около 3-5 мм. Остальные настройки 15V, 20 мс импульсы и 50 мс задержка HH 10. Изменение положения двумя электродами немного вдоль спинно-вентральной (DV) оси среднего мозга обеспечивает более широкий трансфекцию клеток ось Д.В. трансфекции.
  4. Для вентральной трансфекции, добавьте немного Ringer поднять голову от желтка мембраны и установить анод под вентральной мозга. Если головка не поднимается нажать электрод под мембраной, которая отделяет желток и эмбрион, чтобы избежать подгорания нервной трубки. Катод должен быть помещен выше среднего мозга спинно-боковом направлении, противоположном анода. Не прикасайтесь к нервной трубки. Мы трансфекции левую вентральной половины мозга, чтобы избежать трудностей с развитием сердца. Расстояние между электродамисоставляет около 1-0,5 мм, остальные настроек 10В, 20 мсек ширина и 50 мс задержки.
  5. Применить еще одну каплю физиологического раствора на вершине эмбрионов, чтобы охладить его и удалить пузырьки воздуха.
  6. Уплотнение яйца с лентой и инкубировать в течение не менее 4 часов; минимальное время, необходимое для вектора экспрессии.

4. Фиксация куриных эмбрионах

  1. Удалить эмбрионов из яиц.
  2. Чистые эмбрионы под стереомикроскопом и оценки степени трансфекции с флуоресцентным стереомикроскопом.
  3. Fix эмбрионов в течение ночи в 4% PFA при 4 ° С. Продолжайте секционирования и / или окрашивание (в гибридизация, иммуногистохимии) для анализа изменений в трансфицированной области.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Степень среднего мозга области трансфицированных микроРНК виден через экспрессии GFP от репортерного вектора вводимого вместе с экспрессирующим вектором Mir (рис. 2). Использование платиновые электроды с диаметром 0,5 мм и расположены параллельно оси AP среднего мозга приводит обычно к трансфекции широкой области вдоль DV-и AP-оси заднего мозга, в том числе, среднего мозга и иногда промежуточного мозга (Фигуры 2А и В). Размер электродов приводит в широком электрическим полем, приложенным к области мозга и, следовательно, широкий трансфицированных области.

Трудно точно прицелиться в области, как, например, брюшной мозга. Уменьшение расстояния между электродами 0,5 мм для достижения меньшее электрическое поле часто токсичны для зародыша и приводит к артефактам. Мы использовали электроды меньшего диаметра (0,2 мм, 0,25 мм платины или 0,1 мм заточены вольфрама провода), которые предлагают более локализованное траnsfection как и брюшной мозг, который трудно достичь (рисунки 2C-I). Меньшие электроды уменьшить электрического поля, приложенного и позволит вставить электроды гораздо ближе к ткани. На рис 2F показан пример, в котором были трансфицированных весь брюшной средний мозг. На рисунках 2G и 2Н трансфектированные брюшной области меньше, но часть заднего мозга (2F) или промежуточного мозга (2H) также трансфецировали. На рисунке 2G, анод был помещен под средне-и заднего мозга для трансфекции как брюшной области. Рисунок 2Н показывает пример анода не очень хорошо изолированы с лаком для ногтей вдоль вала. Таким образом, не только вентральной области вокруг MHB выражает мир / GFP, но и спинной передние MES-и ди-энцефалон, где был помещен вал анода. Удельный вентральной распределение микроРНК / GFP на рисунках 2C-I является результатом от местногоэлектрическое поле мы применяем с меньшими электродов. Взятые вместе, с меньшими электродов и электрических полей, мы можем выразить ДНК / РНК в более ограниченных областях, как брюшной мозга.

Так как наш вектор экспрессии микроРНК не содержит репортерный ген, мы смешать в GFP экспрессирующим вектором в соотношении 1 мкг / мкл в 0,9 мкг / мкл, соответственно. Почти равное соотношение гарантирует, что трансфектированную площадь микроРНК и GFP почти полностью перекрываются (см. Momose др.. 8 и собственный опыт). Для того, чтобы судить о степени трансфицированной области становится важным, когда только небольшая площадь, содержащий конкретные типы клеток трансфицируют или трансфицированные клетки используются для Qrt-PCR. Намного меньше концентрации гена-репортера может привести к клеток, экспрессирующих GFP под уровня обнаружения. Сила выражения какого-либо трансфицированных вектором зависит не только от концентрации используемого вектора, но и от промотора. Наши векторы У6-промоутер факан (выражая микроРНК) и ß-промотор актина приводом (выражая флуоресцентные белки) и оба повсеместно и постоянно активный у эмбрионов кур.

Большинство наших эмбрионов электропорации на левой стороне для фиг.2С (зеркально) кроме. Для покадровой экспериментов, электропорации правой стороне эмбриона рекомендуется, так как большинство эмбрионов повернуть голову вправо и лежат на левом боку.


Рисунок 2. Представитель результаты. Эмбрионы были электропорации между HH10 и HH11 и фиксируются на этапах, указанных в изображениях. (AC) показать electroporations спинного мозга, а также (DI) из брюшной мозга. Стрелки на (D, E) указывают вентрально расположенные, GFP-положительных клеток. Для получения дополнительной информации см. текст. Мес- Средний мозг / средний мозг, Di - промежуточный мозг, Тель - конечный мозг, Rhom - ромбовидный мозг / задний мозг.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Это видео демонстрирует эффективный метод для трансфекции плазмиды в нейроэпителиальных клетках конкретных областях куриного мозга. Прямоугольные электрические импульсы низкого напряжения можно ввести ДНК в клетках кур нервной трубки в ово 6,16. Однако точность таргетинга ДНК часто затруднено из-за широкого электрического поля, которая поднимается через относительно больших электродов (Φ = 0,5 мм). Мы пытались решить эту проблему с помощью электродов меньшие в диаметре, следуя рекомендациям Momose др.. 8. Для вентральной среднего мозга трансфекции мы размещаем катод под мембраной области пеллюцида или если возраст эмбриона позволяет его непосредственно под брюшной мозга. Последний сценарий нуждается в небольшом количестве практике, поскольку средний мозг / нервная трубка ткани не должны быть затронуты и повреждены анода. Добавление Ringer часто может помочь поднять голову эмбриона немного от мембраны, охватывающей зону Pellucida.

Хотя рассмотреть концентрации гена в клетке. Различные дозы гена может оказывать различное воздействие на клетки и ткани. Там может быть пороговый эффект участие (см. Agoston соавт. 17, например) или различные, градуированные эффекты. Мы обычно проверить Diff #аренда концентрации микроРНК выражения (0,5-2 мкг / мкл) вектор и анализировать изменения в морфологии или белка / экспрессии генов. Эффекты могут быть проверены в естественных условиях с использованием иммуногистохимии, датчик векторов 18 или РНК в гибридизация.

Эта методика также предлагает, чтобы проверить прочность и местоположение любого активности конкретного микроРНК в естественных условиях с использованием, например двойную флуоресценции вектор репортер / сенсора, как описано в De Pietri Tonelli соавт. 18. Они используют вектор, содержащий GFP-репортер и датчик RFP мир. RFP сопровождается бесплатным последовательности микроРНК. Хотя экспрессия GFP идентифицирует успешно трансфицированных клеток, красной флуоресценции (RFP) указывает на отсутствие исследуемого Мир, и исчезновение красной флуоресценции выдает присутствие мир. Этот метод также может быть использован для тестирования специфичности микроРНК цели в естественных условиях, с помощью 3'UTR последовательности-мишени в нижнем течении ППП.Взятые вместе эта техника очень подходит для исследований развития на экспрессию генов и функции в различных тканях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы признаем, К. Mikic, кто внес вклад в начальной фазе этого фильма и М. Николеску для картины микроРНК. С. Хубер была поддержана общение в IZKF от Universtitätsklinikum Тюбинген, А. Alwin Прем Ананд по программе состоянием на Universtitätsklinikum Тюбингене.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Borosillicate glass capillaries Hartenstein Model: 0.9 mm
Microcapillary puller WPI, Berlin Model: Pul1-E
Electroporator Intracel Model: TSSIC
Stereomicroscope - fluorescence LEICA Model: MZFLIII
Stereomicroscope Zeiss Model: Stemi
Camera and software Zeiss Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
  2. Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
  3. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
  4. Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
  5. Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
  6. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  7. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
  8. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  9. Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
  10. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
  11. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
  12. Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
  13. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
  14. Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. 294-2119 (2006).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
  16. Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
  17. Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
  18. De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
<em>В ово</em> выражения микроРНК в Брюшной Chick мозга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huber, C., Prem Anand, A. A., Mauz, M., Künstle, P., Hupp, W., Hirt, B., Wizenmann, A. In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain. J. Vis. Exp. (79), e50024, doi:10.3791/50024 (2013).More

Huber, C., Prem Anand, A. A., Mauz, M., Künstle, P., Hupp, W., Hirt, B., Wizenmann, A. In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain. J. Vis. Exp. (79), e50024, doi:10.3791/50024 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter