Summary
مظاهرة للطرق الرئيسية لارتفاع قياسات أوراق الإنتاجية. ويمكن استخدام هذه الأساليب لتسريع phenotyping أوراق النبات عند دراسة العديد من المسوخ أو النباتات فحص أوراق النمط الظاهري خلاف ذلك.
Abstract
عالية الإنتاجية phenotyping (phenomics) هو أداة قوية لربط الجينات لوظائفها (انظر 1 مشاركة الأمثلة الحديثة و2-4). يترك هي الجهاز الضوئي الأولية، وحجمها وشكلها تختلف تنمويا وبيئيا داخل المصنع. لهذه الأسباب دراسات مورفولوجية على ورقة تتطلب قياس معلمات متعددة من أوراق عديدة، والتي تتم من قبل أفضل شبه الآلي أدوات phenomics 5،6. الظل هو المظلة جديلة البيئية المهمة التي تؤثر على بنية النبات وتاريخ حياة؛ والتي تسمى مجتمعة مجموعة من الردود على تجنب متلازمة الظل (SAS) 7. بين استجابات SAS، الظل الناجمة استطالة سويقات ورقة والتغيرات في المنطقة هي شفرة مفيدة بشكل خاص حيث مؤشرات 8. حتى الآن، يمكن لبرامج الشكل ورقة (مثل SHAPE 9، الصفيحة 10، LeafAnalyzer 11، LEAFPROCESSOR 12) قياس الخطوط العريضة الأوراق وتصنيف الأشكال ورقةولكن لا يمكن إخراج طول سويقات. عدم وجود أنظمة قياس على نطاق واسع من أعناق الأوراق وتحول دون النهج phenomics للبحث SAS. في هذه الورقة، ونحن وصف البرنامج المساعد يماغيج وضعت حديثا، ودعا LeafJ، والتي يمكن قياس طول سويقات بسرعة والمعلمات رقة شفرة للل arabidopsis thaliana نموذج المصنع. لأوراق المطلوبة العرضية التي التصحيح اليدوي للحدود شفرة سويقات / نبات كنا قرص تعمل باللمس. علاوة على ذلك، شكل الخلية ورقة أرقام خلية ورقة من المحددات الهامة لحجم ورقة 13. منفصلة عن LeafJ نقدم أيضا على بروتوكول لاستخدام لوحة تعمل باللمس لقياس شكل الخلية والمساحة والحجم. لا يقتصر لدينا نظام قياس سمة ورقة لتجنب الظل والبحوث من شأنها أن تعجل من المسوخ phenotyping أوراق العديد من النباتات والفحص من قبل phenotyping ورقة.
Protocol
1. مصنع مواد
لاحظ أن هذا البروتوكول يهدف للكشف عن نمو النبات استجابة تجنب الظل. هل يمكن أن تنمو النباتات تحت ظروف المفضلة لديك.
- رش بذور thaliana ل arabidopsis على المياه غارقة أوراق الترشيح في 9 أطباق بتري الطول ومتجر (تطبق) منهم في 4 درجات مئوية لمدة أربعة أيام في الظلام.
- نقل هذه أطباق بتري لظروف محاكاة أحد: 80-100 الإشعاع الضوئي μE بالموقع (PAR) والملحق الحمراء بعيدة لجلب R: FR نسبة إلى 1.86. استخدام الشروط يوم طويل (16 ساعة ضوء / 8 الظلام ساعة) ودرجة حرارة ثابتة من 22 ° C. احتضان في هذه الحالة لمدة ثلاثة أيام للسماح للبذور أن تنبت.
- نقل البذور نبتت في التربة والحفاظ على النباتات تحت ظروف أحد على نطاق واسع التجارب، ونحن نوصي به إعداد صغيرة لوصفها كل النباتات باستخدام دمج البيانات في Microsoft Word مدير 2004 (أو أحدث) لجعل التسميات.
- بعد أحد عشر يوما TRansfer إلى التربة، نقل نصف النباتات لحالة الظل: نفس الشمس ولكن مع الضوء الأحمر بعيدة تكميلية لتحقيق نسبة R / FR الى 0.52.
- بعد اثني عشر يوما إضافية، والنباتات هي على استعداد للتصوير ورقة. في هذه المرحلة قد نضجت تماما وأقدم أوراق في حين يترك الأصغر مازالت تتوسع، بحيث يمكنك التقاط لقطة من التنمية. قد تحتاج إلى اختيار وقت آخر التنموية اعتمادا على احتياجاتك.
2. التقاط الصور ليف مشرح
- إعداد ورقة الشفافية المسمى مع النمط الوراثي النباتي وحالة النمو مع خمسة إطارات مستطيلة. إطار واحد يتوافق مع الأوراق من مصنع واحد. يمكن استخدام Microsoft Excel لطباعة الشبكة بما يتفق مع التسميات.
- تشريح أوراق النباتات القديمة 26 يوم.
- مسح يترك في 600 نقطة في البوصة على الماسح الضوئي سرير مسطح. يجب وضع ملاحظة أن يترك من مصنع واحد عموديا ضمن إطار أسود في شطيرة من أوراق شفافة. تجنب لمس الأوراقإلى إطار نافذة سوداء والأوراق المتداخلة، والتي سوف تعطي أخطاء في الإجراءات التالية.
3. ورقة تحليل الصور بواسطة LeafJ
- تحميل يماغيج سحب الملف إلى مجلد LeafJ.jar الإضافات من يماغيج.
- فتح ملف صورة في 1.45s يماغيج أو 14 في وقت لاحق.
- تقسيم الصورة إلى ثلاث قنوات اللون (الأحمر والأخضر والأزرق) من قبل "صورة> لون القنوات سبليت>" وتطبيق الحد الأدنى للصورة في القناة الزرقاء.
- تحديد كافة الأوراق من مصنع واحد بواسطة أداة المستطيل (الشكل 1A).
- حدد "LeafJ" من القائمة المساعد.
- حدد المعلومات الشرح لهذا النبات من مربع الحوار الذي يظهر. يمكنكتحرير القيم الافتراضية التي تظهر هنا بالنقر على "تحرير هذه الخيارات".
- بعد تشغيل البرنامج المساعد وLeafJ قبل النقر فوق زر "موافق"، وتحرير خطوط تتبع من المنطقة من نافذة مدير مصلحة (ROI) (إذا لزم الأمر؛ 1B الشكل). A اللوحي التي تعمل باللمس (مثل آي باد) هو مفيد لهذا الإجراء. يمكن توصيل لاب توب بكمبيوتر وشاشة خارجية باستخدام البرمجيات الهواء العرض.
- تصدير نتائج القياس والمعلومات المرتبطة بها (أسماء الملفات، والوقت المزهرة، تشريح من قبل، قياس، الخ) إلى Microsoft Excel أو برنامج ما يعادلها.
4. تحليل صورة ورقة خلية في يماغيج
- إصلاح تشريح يترك كما هو موضح في مرجع 15 بعد المسح (الخطوة 2). يمكن أن تظل ثابتة في أوراق FAA C ° 4 ل6 أشهر على الأقل.
- مسح أوراق من خلال تغيير FAA مثبت على حل هيدرات الكلورال ويترك لاحتضان 1 ساعة 2 ~ المراقبة المجهرية قبل 15.
- جبل يترك على ميلcroscope الشرائح مع trichomes مواجهة. باستخدام التكبير 40X على مجمع المجهر طبقة الصورة، ونسيج الورقة المتوسط من وسط كل ورقة على جانبي الوريد الرئيسي، وتجنب الخلايا قرب trichomes أو الأوردة.
- تتبع خلية ورقة تحدد بواسطة أداة يماغيج مدير ROI مع المعونة من قرص تعمل باللمس وقلم (كما هو موضح في الخطوة 3). خلية تحليل الصور يستخدم ميزات المدمج في ليماغيج ولكن لا يتطلب LeafJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. صور ورقة عرض تقديرات سويقات ورقة شفرة الحدود، ونافذة قياسها
واحدة من السمات الأكثر فائدة من الكشف الآلي هو LeafJ من الحدود شفرة / سويقات ورقة (الشكل 1). الخوارزمية LeafJ يعمل على النحو التالي: يتم استخدام المدمج في وظائف ParticleAnalyzer يماغيج لإيجاد وتحديد اتجاه الأوراق داخل اختيار المستخدم. لكل ورقة يتم تحديد عرض ورقة على طول محور ورقة بأكمله. ثم يتم تحديد التغيير في العرض في كل موقف على طول المحور باستخدام إطار تشغيل (يتم طرح عرض متوسط للمناصب 7 الأقرب إلى موقف الاتصال من عرض متوسط للمناصب 7 البعيدة لموقف الوصل). يتم تعريف الحدود سويقات / شفرة والمركز الأول وراء قاعدة ورقة في حال كان التغيير في العرض أكبر من 90٪ من جميع الاختلافات عرض المحسوبة. لا LeafJ عمليات فحص إضافية لزيادة reliability من هذه الدعوة، على وجه التحديد LeafJ يتطلب أيضا أن 1) عرض يتجاوز ال 5٪ أضيق من المناصب في طول (هذا يمنع المكالمات الشاذة في قاعدة سويقات)؛ 2) المنطقة الأقرب إلى موقف الاتصال لايوجد تغيير كبير في العرض، و 3) عرض ورقة ال 20٪ البعيدة لتنسيق الموقف على الأقل 150٪ أكبر من التنسيق في الموقف (صحيح إذا كان الموقف هو تنسيق الحدود لأن 20٪ القريبة من الحدود ينبغي أن تكون شفرة وبالتالي الكثير أوسع).
مرة واحدة وقد حددت LeafJ الحدود سويقات / شفرة، الذي بني في الطبقات يماغيج وتستخدم أساليب لتحديد منطقة شفرة، المحيط، ودائرية. المدمج في وسائل يماغيج وتستخدم أيضا لتناسب قطع ناقص إلى شفرة لحساب ومحاور الرئيسية والثانوية من أن القطع الناقص (تستخدم بعد ذلك نصل طول والعرض). يتم تحديد طول سويقات بواسطة خط يتتبع على طول وسط منطقة سويقات.
2. الكشف عن الظل الناجم عن استطالة سويقات </ P>
أن نتساءل عما إذا كانت القياسات LeafJ مفيدة في تجنب يعاير الظل، استخدمنا نموذج الآثار مختلطة مع العلاج وعدد الاوراق والآثار الثابتة وتكرار كأثر عشوائي. وجدنا أن طول سويقات، منطقة شفرة، شفرة طول، عرض شفرة، ونسبة طول سويقات طول / شفرة وتتأثر كثيرا العلاج الظل، في حين دائرية شفرة شفرة ونسبة الطول العرض / شفرة لم تكن (P <0.05). وأظهرت البيانات المتوفرة لدينا أن LeafJ المساعد مفيد للدراسات على أوراق الإجابات تجنب الظل (الشكل 2).
3. دقة وسرعة المساعد LeafJ
لتحديد أداء البرنامج المساعد LeafJ في جو من مجموعات البيانات قارنا عملية الوقت والدقة والقياسات بين دليل البرنامج المساعد. لقياسات دليل حددنا الحدود سويقات / شفرة والمكان الذي يوجد فيه عرض الورقة على ما يبدو زيادة سريعة. استغرق الأمر باحث من ذوي الخبرة في المتوسط من 1 9 دقيقة 3 ثانية لقياس واحد مع خمسة مصانع الشفافية (حوالي 50 ورقة) عن طريق قياس دليل، بينما مع LeafJ استغرق سوى 3 دقائق و 20 ثانية. بلغ متوسط عبر 5 الشفاف، وقياس مع البرنامج المساعد كان 5.7 مرات أسرع من القياس اليدوي. وقد تم قياس دليل من قبل الباحث من ذوي الخبرة في إجراء القياسات دليل كثيرة، مبتدئا سيكون أبطأ بكثير في القياس اليدوي، مما أدى إلى ميزة أكبر من LeafJ. قمنا بتقييم دقة البيانات من خلال مقارنة بين الطريقتين؛ كانت مرتبطة بشدة البيانات لجميع المعلمات ورقة (الشكل 3). من نقاط البيانات 3532 كان هناك 172 (4.9٪) والتي أظهرت اختلافات قوية بين الأساليب (يتضح من كونها القيم المتطرفة على قطع الارتباط). قمنا بتحليل سبب هذه القيم المتطرفة. من 172 القيم المتطرفة، هي 29 بسبب أخطاء أثناء القياس المساعد LeafJ و 143 كانت بسبب أخطاء في القياس اليدوي. هذا التحليل خطأ كما أظهرت دقة القياس المساعد.
jove_step "4> حجم الخلية. وخلية قياس عددمستقلة عن LeafJ قمنا بتطويرها أيضا تدفق العمل لقياس كفاءة عدد الخلايا وحجمها. نظريا يمكن استخدام عدد الخلايا وحجمها لتصنيف النباتات متحولة إلى تسع فئات بالمقارنة مع نوع البرية؛ (1) حجم أصغر الخلايا مع أعداد الخلايا انخفضت، (2) أصغر الخلايا مع أعداد الخلايا العادية، (3) أصغر الخلايا مع خلية زيادة الأرقام، (4) حجم الخلية خلية طبيعية مع الأرقام انخفضت، (5) حجم الخلية العادية مع أرقام الخلية العادية، (6) حجم الخلية العادية مع تناقص أعداد الخلايا، (7) أكبر حجم الخلية مع خلية انخفضت أعداد، (8) أكبر حجم الخلية مع خلية الأرقام العادية، (9) أكبر حجم الخلية مع زيادة أعداد الخلايا 15،16. قمنا بقياس المعلمات خلية ورقة الأنماط الجينية في 67 من thaliana ل arabidopsis باستخدام قرص حجمنا خلية القاعدة وطريقة قياس عدد الخلايا. قمنا بقياس حجم الخلية من الخلايا 8629 من 877 أوراق من 224 النباتات. ضرب الخلية ب الكثافةذ مساحة الورقة (تقاس LeafJ)، قدرنا إجمالي عدد أوراق البيانات خلية من 438 أوراق من 219 النباتات. وضعت هذه المورثات تحليلنا إلى ست من الفئات التسع الممكنة (F IG 4). كانت أكبر فئة (5): حجم الخلية الطبيعية وعدد؛ كان ثاني أكبر (8): مع حجم أكبر خلية عدد الخلايا العادية. على الرغم من أن هناك حاجة إلى متابعة العمل، وهذا يشير إلى أنه يمكن استخدام قرص لدينا على أساس طريقة لتصنيف المسوخ يعتمد على حجم الخلية وعدد أوراق.
الشكل 1. مثال على سويقات / ورقة شفرة الكشف الحدود واجهة المستخدم. نلاحظ أن LeafJ قادرة على تحديد سويقات / ورقة شفرة تلقائيا الحدود (1B الشكل). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر فيقوإعادة.
الشكل 2. يمكن LeafJ المساعد كشف عن ردود تجنب الظل في ورقة المعلمات المختلفة. تم فحص أوراق نبات 3 إلى 6 من سبع محطات لنوع البرية (ل arabidopsis thaliana كولومبيا نوع إيكولوجي) تحت كل حالة (الشمس والظل). من أعلى اليسار إلى اليمين أسفل، وحدات محور y هي مم، مم، مم، 2 مم، طول سويقات نسبة لطول النصل، ونسبة طول إلى عرض النصل النصل. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. LeafJ البرنامج المساعد هو درجة عالية من الدقة. Correlation البيانات من قياس ودليل قياس LeafJ المساعد من نقاط البيانات 3532. كل نقطة تمثل ورقة واحدة. النقاط الخضراء تشير إلى القيم المتطرفة 170 في هذا الرسم البياني. محاور مساحة الورقة هو مم 2 مم جميع الآخرين هي. الأرقام أمام كل معلمة تمثل موقف رقة (أي "3" هو ورقة ثالثة).
الشكل 4. مؤامرة مبعثر من مساحة الورقة ورقة خلية خلية عدد من الأنماط الجينية بين 67 thaliana ل arabidopsis. كل نقطة تمثل كل الظواهر الوراثي نمت تحت ظروف الظل. تم تصنيف النباتات الى تسع فئات على أساس الاختلاف بين كل من نوع البرية (كول) على النحو الذي يحدده نموذج مختلط الآثار الخطية ومتعددة تصحيح الاختبار ف القيم: الخلية (1) حجم أصغر خلية خلية انخفضت مع الأرقام، (2) أصغر حجم القاعدة معآل عدد الخلايا، (3) أصغر حجم الخلية مع زيادة عدد الخلايا، (4) حجم الخلية طبيعية مع انخفاض عدد الخلايا، (5) حجم الخلية العادية مع عدد الخلايا العادية، (6) حجم الخلية العادية مع تناقص عدد الخلايا، (7 ) أكبر حجم الخلية مع عدد الخلايا انخفضت، (8) أكبر حجم الخلية مع عدد الخلايا العادية، (9) أكبر حجم الخلية مع زيادة عدد الخلايا. "*" يشير إلى النمط الظاهري من نوع البرية (كول).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لدينا "LeafJ" البرنامج المساعد تمكن من قياس طول سويقات شبه تلقائيا، وزيادة الإنتاجية ما يقرب من 6 مرات خلال قياس دليل. طول سويقات هو مؤشر هام من SAS وأيضا معلما من ظواهر أخرى، مثل مقاومة الإغراق والنمو hyponastic 17. ولذلك قد يكون من المفيد هذا البرنامج المساعد لمجموعة واسعة من الباحثين النبات.
ويتم تنفيذ البرنامج المساعد لدينا في برنامج جافا على أساس راسخ مجانا، يماغيج. وهذا يتيح سهولة عبر منصة التثبيت. سهولة تعديل البرنامج أيضا ميزة من البرنامج المساعد لLeafJ يماغيج بالفعل مكتبة كبيرة من الإضافات التي تمت كتابتها من قبل جافا ويماغيج غات الماكرو ( http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php؟id=tutorial : بدء ). حاليا نحن فقط اختبار أوراق arabidopsis، ولكن أنظمتنا من سويقات / ورقة شفرة الكشف الحدود يمكن أن تنطبق رس الفلقتين أخرى يترك بعد بعض التعديل من البرنامج المساعد.
خلال اختبار LeafJ المساعد، وجدنا معظم الأخطاء جاءت من أخطاء 14 الإنسان مثل ضعه في غير موضعه النتائج على نسخ أوراق البيانات و / أو mislabeling الطرز الوراثية النباتية. في حالات نادرة كان يسمى الحدود شفرة سويقات / ورقة بشكل غير صحيح، مما استلزم التصحيح اليدوي وخلق مخاطر إضافية من الأخطاء النسخ واللصق. يمكننا الكشف عن مثل هذه الأخطاء بعد النظر في البيانات (أ) من القيم العتبة (مثل أعناق أطول من طول الورقة) و (ب) من خلال إيجاد حالة تكرار نموذج (على سبيل المثال "الشمس" أو "الظل")، التركيب الوراثي، أو الموقف من الأوراق.
أسلوبنا اللوحي التي تعمل باللمس سهلت دقة وسرعة القياس. الحد من أسلوبنا هو أن الاتصال بين الكمبيوتر اللوحي الرئيسية والشاشات التي تعمل باللمس تعتمد على سرعة الشبكة المحلية اللاسلكية (LAN).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
كتب بواسطة LeafJ JNM بينما كان في اجازة في مختبر الدكتور كاثرين بولارد في المعاهد جلادستون.
وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (عدد المنح IOS-0923752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
- Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
- Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
- Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
- Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570 (2012).
- Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
- Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157 (2012).
- Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
- Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
- Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82 (2008).
- Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
- Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
- Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
- Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
- Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).
