Summary
Demonstratie van de belangrijkste methoden voor hoge doorvoer blad metingen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om blad fenotypering te versnellen bij het bestuderen van veel plant-mutanten of anderszins zeefinstallaties door vleugel fenotype.
Abstract
High throughput fenotypering (phenomics) is een krachtig hulpmiddel voor het koppelen van genen om hun functies (zie overzicht 1 en recente voorbeelden 2-4). Bladeren zijn de primaire fotosynthetische orgaan, en hun grootte en vorm variëren ontwikkelingsgebied en milieuvriendelijke binnen een installatie. Daarom studies on bladmorfologie vereisen meting van meerdere parameters van verschillende bladeren die best wordt gedaan door semi-geautomatiseerde instrumenten phenomics 5,6. Canopy schaduw is een belangrijke milieu-cue die plant architectuur en life history beïnvloedt; de suite van de reacties wordt collectief genaamd de schaduw te vermijden syndroom (SAS) 7. Onder SAS reacties, geïnduceerd schaduw bladsteel rek en veranderingen in bladoppervlak zijn bijzonder nuttig als indices 8. Tot op heden kan bladvorm programma's (bijvoorbeeld SHAPE 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) te meten blad lijnen en categoriseren bladvormen, Maar niet uitvoeren bladsteel lengte. Gebrek aan grootschalige meetsystemen van het blad bladstelen heeft geremd phenomics benaderingen van SAS onderzoek. In dit artikel beschrijven we een nieuw ontwikkelde ImageJ plugin, genaamd LeafJ, die snel kan meten bladsteel lengte en bladschijf parameters van het model Arabidopsis thaliana. Voor af en toe een blad dat vereiste handmatige correctie van de bladsteel / bladschijf grens hebben we een touch-screen tablet gebruikt. Verder blad celvorm en blad celaantallen zijn belangrijke determinanten van bladgrootte 13. Los van LeafJ presenteren we ook een protocol voor het gebruik van een touch-screen tablet voor het meten van celvorm, regio en grootte. Onze blad eigenschap meetsysteem is niet beperkt tot shade-avoidance onderzoek en zal blad fenotypering van de vele mutanten en zeefinstallaties door blad fenotypering versnellen.
Protocol
1. Plant Materialen
Merk op dat dit de groei van planten protocol is bedoeld voor het opsporen van schaduw vermijdingsreactie. Je kunt groeien planten onder uw favoriete conditie.
- Strooi Arabidopsis thaliana zaden op water gedrenkt filtreerpapier in 9 cm petrischaaltjes en op te slaan (stratificeren) hen bij 4 ° C gedurende vier dagen in het donker.
- Breng deze petrischalen op gesimuleerde zon voorwaarden: 80-100 μE fotosynthetisch actieve straling (PAR) en ver-rood aanvulling op de R te brengen: FR verhouding tot 1,86. Gebruik lange overdag (16 uur licht / 8 uur donker) en constante temperatuur van 22 ° C. Incubeer in deze toestand gedurende drie dagen om de zaden te laten ontkiemen.
- Overdracht gekiemd zaad in de bodem en houdt planten onder de zon staat. Voor grootschalige experimenten, raden wij u voorbereiden kleine tags voor etikettering elke planten met behulp van Data Merge Manager in Microsoft Word 2004 (of later) voor het maken van labels.
- Elf dagen na de transfer naar bodem, bewegen de helft van de planten om schaduw staat: hetzelfde als zon, maar met extra ver-rood licht aan de R / FR verhouding te brengen tot 0,52.
- Na nog eens twaalf dagen, de planten zijn klaar voor blad beeldvorming. In dit stadium van de oudere bladeren hebben een volledig gerijpt terwijl jongere bladeren groeien nog steeds, zodat u het veroveren van een momentopname van ontwikkeling. Misschien wilt u een andere ontwikkelingsstoornis tijd, afhankelijk van uw behoeften te kiezen.
2. Het vastleggen van Ontleed Leaf Afbeeldingen
- Bereid transparanten gelabeld met plantaardige genotype en groei staat met vijf rechthoekige frames. Een frame komt overeen met bladeren van een plant. Microsoft Excel kan worden gebruikt om een consistente rooster met etiketten.
- Ontleden bladeren van zesentwintig dagen oude planten.
- Scan vertrekt om 600 dpi op een flat-bed scanner. Merk op dat vertrekt van de ene plant moet verticaal worden geplaatst binnen een zwart venster in een sandwich van transparante vellen. Vermijd het aanraken van de bladereneen zwarte raamkozijn en overlappende bladeren, met een fouten in de volgende procedures.
3. Leaf Afbeelding Analyse door LeafJ
- Download ImageJ Sleep het LeafJ.jar bestand in de plugins map van ImageJ.
- Open een afbeeldingsbestand in ImageJ 1.45s of later 14.
- Splits het beeld in drie-kleurkanalen (rood, groen en blauw) door "Beeld> Kleur> Split Channels" en toe te passen drempel om het beeld in het blauwe kanaal.
- Selecteer alle van de bladeren van een plant door een rechthoek gereedschap (Figuur 1A).
- Selecteer "LeafJ" van de plugin-menu.
- Selecteer annotatie informatie voor deze plant in het dialoogvenster dat verschijnt. U kuntbewerkt u de standaardwaarden die hier staan, door te klikken op "bewerken deze opties".
- Na het uitvoeren van LeafJ plugin en voordat u op "OK" knop, bewerken getraceerd lijnen van het gebied van belang (ROI) manager upvenster (indien nodig; Figuur 1B). Een touch-screen tablet (zoals een iPad) is nuttig voor deze procedure. iPads kan worden aangesloten op een computer als een extern beeldscherm met Air Display software.
- Exporteer meetresultaten en bijbehorende informatie (bestandsnamen, bloeitijd, doorsneden door, gemeten aan de hand, enz.) naar Microsoft Excel of een gelijkwaardige software.
4. Blad Cell Beeldanalyse in ImageJ
- Fix ontleed bladeren zoals beschreven in referentie 15 na het scannen (stap 2). FAA vaste bladen kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende ten minste 6 maanden.
- Schakel het bladeren door het veranderen van de FAA fixatief om chloraalhydraatoplossing en incubeer bladeren voor 1 ~ 2 uur vóór de microscopische observatie 15.
- Mount laat op microscope glijdt met trichomen naar boven. Met 40x vergroting op samengestelde microscoop beeld het mesofyl laag van het midden van ieder blad aan beide zijden van de hoofdader, vermijden cellen dichtbij trichomen of strepen.
- Trace blad cel schetst door ImageJ ROI manager tool met behulp van het touch-screen tablet en een stylus (zoals beschreven in stap 3). Cel beeldanalyse maakt gebruik van de ingebouwde functies van ImageJ, maar vereist geen LeafJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Leaf Afbeeldingen tonen Schattingen van de bladsteel en bladschijf Boundary, en hun meetvenster
Een van de meest handige functies van LeafJ is geautomatiseerde detectie van bladschijf / bladsteel grens (figuur 1). De LeafJ algoritme werkt als volgt: de ingebouwde ImageJ ParticleAnalyzer functionaliteit wordt gebruikt te vinden en de oriëntatie van de bladeren bepalen binnenkant van de gebruiker selectie. Voor elk blad de breedte van het blad wordt bepaald langs de hele as van het blad. Dan de verandering in breedte op elke positie langs de as wordt bepaald met een draaiende venster (de gemiddelde breedte van de zeven posities proximaal van de focale positie wordt afgetrokken van de gemiddelde breedte van de zeven posities distaal van de focale positie). De bladsteel / blad grens wordt gedefinieerd als de eerste positie buiten de bladbasis waar de verandering in breedte groter is dan 90% van alle berekende breedte verschillen. LeafJ doet extra controles te verhogen reliabilijkheid van deze oproep; specifiek LeafJ vereist ook dat 1) de breedte van de smalste 5% van posities in de lengte (dit voorkomt afwijkende verzoeken de steel base) overschrijdt, 2) het gebied proximaal aan de focale positie geen grote veranderingen in breedte en 3) de breedte van het blad 20% distaal van de focale positie ten minste 150% groter dan bij de focale positie (true als de focale positie is de grens omdat 20% dichtbij de grens moet blade en dus breder).
Zodra LeafJ heeft gedefinieerd de bladsteel / blad grens, ingebouwde ImageJ klassen en methoden worden gebruikt om blad oppervlakte, omtrek, en circulariteit te bepalen. Ingebouwde ImageJ methoden worden ook gebruikt om een ellips te passen aan het mes en de grote en kleine assen van die ellips (vervolgens als blade lengte en breedte) te berekenen. Bladsteel lengte wordt bepaald door een lijn die sporen in het midden van de bladsteel gebied.
2. Detectie van Shade-geïnduceerde verlenging van de bladstengel </ P>
Om te vragen of LeafJ metingen waren nuttig in het bepalen van schaduw te vermijden, hebben we gebruik gemaakt van een mixed effects model met behandeling en blad nummer als vaste effecten en repliceren als een willekeurig effect. Wij vonden dat bladsteel lengte, bladoppervlak, bladlengte, bladbreedte, en de bladsteel lengte / lemmet lengte verhouding werden sterk beïnvloed door schaduw behandeling, terwijl blad circulariteit en het mes lengte / breedte-verhouding blad niet (p <0,05). Onze data tonen dat LeafJ plugin is nuttig voor studies op blad schaduwvermijdingreactie reacties (Figuur 2).
3. Nauwkeurigheid en snelheid van de LeafJ Plugin
Om vast te stellen de prestaties van de LeafJ plugin in grotere datasets vergeleken we bedrijfstijd en nauwkeurigheid tussen handmatige en plugin metingen. Voor handmatige metingen hebben we de bladsteel / blad grens als de plaats waar de vleugelbreedte bleek snel toenemen. Het duurde een ervaren onderzoeker een gemiddelde van 1 9 min 3 sec om een transparantie te meten met vijf planten (ongeveer 50 bladeren) door handmatige meting, terwijl met LeafJ het duurde slechts 3 min. 20 sec. Gemiddeld over 5 transparanten, meten met de plugin bedroeg 5,7 keer sneller dan handmatige meting. De handmatige meting werd gedaan door een onderzoeker met ervaring in het maken van veel handmatige metingen; een beginner zou zijn aanzienlijk trager op handmatige meting, wat resulteert in een nog grotere voordeel van LeafJ. Wij hebben nauwkeurigheid door gegevens van de twee methoden: de gegevens waren sterk gecorreleerd voor installatie parameters (figuur 3). Van de 3532 datapunten waren 172 (4,9%) die sterke verschillen tussen de methoden (al doordat uitschieters op correlatiekrommen) toonde. We analyseerden de oorzaak van deze uitschieters. Van 172 uitschieters, 29 zijn door fouten in LeafJ plugin meting en 143 zijn door fouten in handmeting. Deze fout analyse toonde ook de nauwkeurigheid van de meting plugin.
jove_step "> 4. Celgrootte en aantal cellen metenOnafhankelijk van LeafJ ontwikkelden we ook een efficiënte workflow voor het meten van het aantal cellen en de grootte. Theoretisch aantal cellen en grootte kunnen worden gebruikt om mutanten te delen in negen categorieën in vergelijking met wild type; (1) kleinere cellen formaat met verminderde celaantallen, (2) kleinere cellen met normale aantallen cellen, (3) kleinere cellen met verhoogde cell getallen (4) normaal celgrootte met verminderde celaantallen, (5) normale celgrootte met normale aantallen cellen, (6) normale celgrootte met verminderde celaantallen, (7) groter celgrootte met verminderde celaantallen, (8) groter celgrootte met normale aantallen cellen, (9) groter celgrootte met verhoogde celaantallen 15,16. We blad cel parameters gemeten in 67 genotypes van Arabidopsis thaliana gebruik van onze tablet-based celgrootte en het aantal cellen meetmethode. We meten celgrootte van 8.629 cellen van 877 bladeren van 224 planten. Vermenigvuldigen celdichtheid by bladoppervlakte (gemeten door LeafJ), schatten we het totaal blad celaantal gegevens van 438 bladeren van 219 planten. Onze analyse van deze genotypes geplaatst in zes van de mogelijke negen categorieën (F ig. 4). De grootste groep was (5): normale cellen en aantal, na grootste was (8): groter celgrootte met normale aantal cellen. Hoewel follow-up nodig, suggereert dit dat onze tablet gebaseerde methode kan worden gebruikt om mutanten gebaseerd op blad celgrootte en aantal categoriseren.
Figuur 1. Een voorbeeld van bladsteel / bladschijf grens detectie en user interface. Merk op dat LeafJ in staat is om bladsteel / bladschijf grens automatisch te bepalen (Figuur 1B). Klik hier om een grotere FIGU bekijkenopnieuw.
Figuur 2. LeafJ plugin kan detecteren schaduw vermijden reacties in diverse blad parameters. Leaf 3 tot en met blad 6 van zeven wild-type planten (Arabidopsis thaliana Columbia ecotype) onder elke voorwaarde (zon en schaduw) werden onderzocht. Van linksboven naar rechtsonder, de y-as units zijn mm, mm, mm, mm 2, verhouding van bladsteel lengte lemmet lengte, en de verhouding van lengte van het lemmet naar bladbreedte. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. LeafJ plugin is zeer nauwkeurig. CONCORDANTIETABEL van gegevens van handmatige meting en LeafJ plugin meting van 3532 datapunten. Elke stip vertegenwoordigt een blad. Groene punten geven de 170 uitschieters in deze grafiek. Assen van de bladoppervlakte is mm 2 alle anderen mm zijn. Getallen in de voorkant van elke parameter vertegenwoordigt blad positie (dwz "3" is het derde blad).
Figuur 4. Spreidingsdiagram van blad celgebied en blad van het aantal cellen tussen 67 genotypen van Arabidopsis thaliana. Elk punt vertegenwoordigt de fenotypen van elk genotype gekweekt onder voorwaarde schaduw. Planten werden ingedeeld in negen categorieën op basis van hun verschil wild type (Col) zoals bepaald door een lineair gemengd model effecten en meerdere tests gecorrigeerde p-waarden: (1) kleinere celgrootte met verminderde celaantallen, (2) kleinere cel grootte met normal aantal cellen, (3) kleinere celgrootte met verhoogde aantal cellen (4) normaal celgrootte met verminderde aantal cellen (5) normale celgrootte met normale aantal cellen (6) normale celgrootte met verminderde aantal cellen, (7 ) groter celgrootte met verminderde aantal cellen (8) groter celgrootte met normale aantal cellen (9) groter celgrootte met verhoogde aantal cellen. "*" Geeft het fenotype van wildtype (Col).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze "LeafJ" plugin maakt het meten van bladsteel lengte semi-automatisch, het verhogen van doorvoer bijna 6 keer over handmatige meting. Bladsteel lengte is een belangrijke index van SAS en is ook een mijlpaal van andere verschijnselen, zoals overstroming weerstand en hyponastic groei 17. Daarom is deze plugin kan nuttig zijn om een breed scala van planten onderzoekers.
Onze plugin is geïmplementeerd in een gevestigde java-gebaseerde vrije software, ImageJ. Dit maakt een eenvoudige cross-platform installatie. Gemak van wijziging van het programma is ook een voordeel van de LeafJ plugin omdat ImageJ al een grote bibliotheek van plugins die werden geschreven door Java en ImageJ macro talen ( http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : start ). Momenteel hebben we alleen getest Arabidopsis bladeren, maar ons algoritme van bladsteel / bladschijf grens detectie van toepassing kunnen zijn to andere tweezaadlobbige laat na enige modificatie van de plugin.
Tijdens het testen van LeafJ plugin, vonden we het grootste deel van de 14 fouten kwam van menselijke fouten, zoals misplaatsen gekopieerd resultaten op datasheets en / of verkeerde etikettering van plantaardige genotypen. In zeldzame gevallen kan de bladsteel / bladschijf grens werd verkeerd geroepen, noodzakelijk handmatige correctie en het creëren van extra risico van kopiëren en plakken fouten. We konden opsporen van dergelijke fouten na het bekijken van gegevens (a) door drempelen waarden (bijv. bladstelen langer dan lengte van de vleugel) en (b) door het vinden van gedupliceerde sample aandoening (bijvoorbeeld "zon" of "schaduw"), genotype, of de positie van de bladeren.
Onze touch-screen tablet methode vergemakkelijkt de nauwkeurigheid en snelheid van de meting. Beperking van onze methode is dat de communicatie tussen hoofdcomputer en het touch screen tablet is afhankelijk van de snelheid van de draadloze local area network (LAN).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
LeafJ is geschreven door JNM terwijl hij op sabbatical in het laboratorium van Dr Katherine Pollard's bij de Gladstone Institutes.
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation (licentienummer IOS-0923752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
- Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
- Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
- Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
- Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570 (2012).
- Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
- Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157 (2012).
- Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
- Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
- Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82 (2008).
- Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
- Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
- Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
- Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
- Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).
