Summary
उच्च throughput पत्ती माप के लिए महत्वपूर्ण तरीकों का प्रदर्शन. इन विधियों पत्ती phenotyping में तेजी लाने के जब पत्ती phenotype द्वारा कई संयंत्र म्यूटेंट या अन्यथा स्क्रीनिंग पौधों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
उच्च throughput phenotyping (phenomics) अपने कार्य करने के लिए जीन (1 समीक्षा और उदाहरण हाल ही में 2-4 देखें) को जोड़ने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. पत्तियां प्राथमिक संश्लेषक अंग हैं, और उनके आकार और आकार के एक संयंत्र के भीतर developmentally और पर्यावरण की दृष्टि से भिन्नता है. इन कारणों के लिए पत्ती आकारिकी पर अध्ययन कई पत्ते, जो सबसे अच्छा अर्द्ध स्वचालित phenomics 5,6 उपकरण के द्वारा किया जाता है से कई मापदंडों की माप की आवश्यकता होती है. चंदवा छाया एक महत्वपूर्ण पर्यावरणीय संकेत है कि संयंत्र वास्तुकला और जीवन इतिहास को प्रभावित करता है, प्रतिक्रियाओं के सूट सामूहिक रूप से छाया परिहार सिंड्रोम (एसएएस) 7 कहा जाता है. SAS प्रतिक्रियाओं के अलावा, छाया प्रेरित पत्ता डंठल बढ़ाव और ब्लेड क्षेत्र में परिवर्तन 8 इंडेक्स विशेष रूप से उपयोगी हैं. तिथि करने के लिए, पत्ती आकार प्रोग्राम (जैसे 9 आकार, 10 लामिना, LeafAnalyzer 11, 12 LEAFPROCESSOR) पत्ती की रूपरेखा को मापने के लिए और पत्ती आकृतियों श्रेणीबद्ध करना, लेकिन डंठल लंबाई उत्पादन नहीं कर सकते हैं. पत्ती petioles के बड़े पैमाने पर मापन प्रणाली के अभाव SAS अनुसंधान phenomics दृष्टिकोण हिचकते. इस पत्र में, हम एक नव विकसित ImageJ प्लगइन, LeafJ कहा जाता है, जो तेजी से के डंठल और मॉडल thaliana Arabidopsis संयंत्र की लंबाई पत्ता ब्लेड मापदंडों उपाय कर सकते हैं का वर्णन. सामयिक पत्ती कि ब्लेड / डंठल पत्ती सीमा के लिए आवश्यक मैनुअल सुधार हम एक गोली स्पर्श स्क्रीन का इस्तेमाल किया है. इसके अलावा, पत्ती कक्ष आकार और पत्ता सेल नंबर पत्ती 13 आकार की महत्वपूर्ण निर्धारक हैं. LeafJ से अलग हम भी सेल आकार, क्षेत्र, और आकार को मापने के लिए एक गोली स्पर्श स्क्रीन का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हमारे पत्ती विशेषता माप प्रणाली छाया परिहार अनुसंधान करने के लिए सीमित नहीं है और कई पत्ती phenotyping द्वारा म्यूटेंट और स्क्रीनिंग पौधों के पत्ते phenotyping में तेजी लाने जाएगा.
Protocol
1. संयंत्र सामग्री
ध्यान दें कि इस संयंत्र विकास प्रोटोकॉल छाया परिहार प्रतिक्रिया का पता लगाने के उद्देश्य से है. आप अपने पसंदीदा शर्त के तहत पौधों को विकसित कर सकते हैं.
- पानी पर Arabidopsis thaliana बीज 9 सेमी पेट्री डिश और 4 में (विभक्त हो जाना) की दुकान उन्हें डिग्री सेल्सियस में अंधेरे में चार दिनों के लिए फिल्टर पेपर लथपथ छिड़क.
- नकली रवि शर्तों के इन पेट्री डिश अंतरण: FR अनुपात 1.86: 80-100 μE photosynthetically सक्रिय विकिरण (PAR) और दूर लाल पूरक लाने के लिए आर. लंबा दिन शर्तों (16 घंटा प्रकाश / 8 घंटा अंधेरे) और 22 के लगातार तापमान डिग्री सेल्सियस का प्रयोग करें इस हालत में तीन दिनों के लिए सेते बीज अंकुरित होना करने के लिए अनुमति देते हैं.
- मिट्टी में अंकुरित बीज स्थानांतरण और सूरज की शर्त के तहत पौधों रखो. बड़े पैमाने पर प्रयोग के लिए, हम डेटा का उपयोग करके प्रत्येक पौधों लेबलिंग के लिए छोटे टैग की तैयारी करने की सलाह देते हैं लेबल बनाने के लिए माइक्रोसॉफ्ट वर्ड 2004 (या बाद में) में प्रबंधक मर्ज.
- ग्यारह दिनों के बाद trमिट्टी में ansfer, छाया हालत के लिए पौधों के आधे कदम: सूर्य के रूप में लेकिन पूरक दूर लाल 0.52 आर / FR अनुपात लाने के प्रकाश के साथ एक ही है.
- एक अतिरिक्त बारह दिनों के बाद, पौधों पत्ती की इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं. इस स्तर पर पुरानी पत्तियों को पूरी तरह जबकि छोटे पत्ते अभी भी विस्तार कर रहे हैं, इतना है कि आप विकास के एक स्नैपशॉट पर कब्जा करने के लिए परिपक्व है. आप एक अलग विकास को अपनी आवश्यकताओं के आधार पर समय चुन सकते हैं.
2. Dissected पत्ता छवियाँ कैप्चरिंग
- पारदर्शिता संयंत्र और पाँच आयताकार फ्रेम के साथ विकास हालत जीनोटाइप के साथ लेबल शीट तैयार करें. एक फ्रेम एक संयंत्र से पत्ते से मेल खाती है. Microsoft Excel लेबल के साथ एक सुसंगत ग्रिड मुद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- बीस छह दिन पुराने पौधों की पत्तियों को काटना.
- स्कैन एक बिस्तर फ्लैट स्कैनर पर 600 dpi पर छोड़ देता है. ध्यान दें कि एक संयंत्र से पत्ते एक काले रंग की खिड़की के भीतर खड़ी चाहिए पारदर्शी चादरों की एक सैंडविच में रखा गया है. को छू पत्तियों से बचेंएक काला खिड़की के फ्रेम और अतिव्यापी पत्तियों, जो निम्नलिखित प्रक्रिया में त्रुटियों को दे देंगे.
3. पत्ता LeafJ द्वारा छवि विश्लेषण
- डाउनलोड ImageJ ImageJ plugins फ़ोल्डर में LeafJ.jar फ़ाइल खींचें.
- ImageJ 1.45s या बाद में 14 में एक छवि फ़ाइल खोलें.
- तीन रंग (लाल, हरे और नीले) चैनलों में से छवि "छवि रंग> भाजित चैनल" भाजित और नीले चैनल में छवि को सीमा लागू.
- पत्तियों के एक संयंत्र से एक आयत उपकरण (चित्रा 1 ए) द्वारा सभी का चयन करें.
- प्लगइन मेनू से "LeafJ" का चयन करें.
- प्रकट होने वाले संवाद बॉक्स है कि इस संयंत्र के लिए एनोटेशन जानकारी का चयन करें. आप कर सकते हैंडिफ़ॉल्ट मानों कि क्लिक "इन विकल्पों को संपादित" द्वारा यहाँ दिखाई संपादित करें.
- LeafJ प्लगइन चलने के बाद और "ठीक" बटन पर क्लिक करने से पहले, ब्याज (आरओआई) प्रबंधक विंडो (, चित्रा 1B यदि आवश्यक हो) के क्षेत्र से पता लगाया लाइनों को संपादित करें. एक गोली स्पर्श स्क्रीन (जैसे एक iPad) इस प्रक्रिया के लिए उपयोगी है. iPads एयर डिस्प्ले सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक बाहरी निगरानी के रूप में एक कंप्यूटर से जुड़ा जा सकता है.
- निर्यात माप परिणाम और माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल या समकक्ष सॉफ्टवेयर (फ़ाइल नाम, फूल समय से dissected द्वारा मापा, आदि) के लिए संबंधित जानकारी.
4. ImageJ में पत्ता सेल छवि विश्लेषण
- Dissected फिक्स पत्ते के रूप में स्कैनिंग (2 कदम) के बाद 15 के संदर्भ में वर्णित है. FAA निश्चित पत्तियों को कम से कम 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में रखा जा सकता है.
- क्लोरल हाइड्रेट समाधान और सेते पत्तियां 1 ~ सूक्ष्म अवलोकन 15 से पहले 2 घंटा के लिए FAA लगानेवाला बदलने पत्तियों को साफ़ करें.
- माउंट मील पर पत्तेcroscope ट्राइकोम का सामना करना पड़ के साथ स्लाइड. मुख्य नस के दोनों तरफ एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी, छवि प्रत्येक पत्ते के केंद्र के मेज़ोफिल परत पर 40x बढ़ाई, उपयोग ट्राइकोम या नसों के पास कोशिकाओं से परहेज.
- ट्रेस पत्ता सेल गोली स्पर्श स्क्रीन और एक स्टाइलस (के रूप में चरण 3 में वर्णित) की सहायता के साथ ImageJ आरओआई प्रबंधक उपकरण द्वारा रूपरेखा. सेल छवि विश्लेषण ImageJ के निर्माण में सुविधाओं का उपयोग करता है, लेकिन करता LeafJ की आवश्यकता नहीं है.
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Representative Results
1. पत्ता डंठल और पत्ता ब्लेड सीमा के अनुमान छवियाँ दिखा रहा है, और उनके माप खिड़की
सबसे उपयोगी सुविधाओं की पत्ती सीमा / ब्लेड डंठल (1 चित्रा) की स्वचालित पता लगाने LeafJ की है. LeafJ एल्गोरिथ्म के रूप में इस प्रकार काम करता है: ImageJ ParticleAnalyzer कार्यक्षमता में बनाया खोजने के लिए और उपयोगकर्ता के चयन के अंदर पत्तियों के उन्मुखीकरण का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रत्येक पत्ती के लिए पत्ती की चौड़ाई पत्ता पूरे अक्ष के साथ निर्धारित किया जाता है. तो अक्ष के साथ प्रत्येक स्थिति में चौड़ाई में परिवर्तन एक चल खिड़की (सात फोकल स्थिति के लिए समीपस्थ पदों के लिए मतलब चौड़ाई मतलब चौड़ाई से सात फोकल स्थिति को बाहर के पदों के लिए घटाया जाता है) का उपयोग निर्धारित किया जाता है. सीमा / डंठल ब्लेड पत्ता आधार जहां चौड़ाई में परिवर्तन सभी गणना की चौड़ाई मतभेद के 90% से अधिक है परे पहले की स्थिति के रूप में परिभाषित किया गया है. LeafJ reliabi अतिरिक्त की जाँच बढ़ाने के लिए करता हैइस कॉल के lity, विशेष रूप से LeafJ भी जरूरी है कि एक) चौड़ाई सबसेसंकरेमें लंबाई में पदों के 5% (इस पर्णवृंत आधार पर न्यायपालिका कॉल रोकता है) से अधिक है, 2) फोकल स्थिति के लिए समीपस्थ क्षेत्र में एक बड़ा परिवर्तन नहीं है चौड़ाई में, और) 3 पत्ती 20% की चौड़ाई फोकल स्थिति को बाहर (सच फोकल स्थिति में कम से कम 150% से अधिक व्यापक है अगर फोकल स्थिति सीमा है, क्योंकि 20% सीमा को समीपस्थ ब्लेड होना चाहिए और इसलिए व्यापक ज्यादा).
एक बार LeafJ सीमा / डंठल ब्लेड परिभाषित किया गया है ImageJ वर्गों में बनाया गया है, और तरीकों को ब्लेड क्षेत्र, परिधि, घेरा और निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है. अन्तर्निर्मित ImageJ तरीकों में भी ब्लेड के लिए एक दीर्घवृत्त फिट और कि दीर्घवृत्त (तो ब्लेड लंबाई और चौड़ाई के रूप में प्रयोग किया जाता है) की बड़ी और छोटी अक्ष की गणना करने के लिए किया जाता है. डंठल लंबाई एक पंक्ति है कि डंठल क्षेत्र के केंद्र के साथ निशान द्वारा निर्धारित किया जाता है.
2. शेड प्रेरित डंठल बढ़ाव की जांच </ P>
पूछना है कि क्या LeafJ माप छाया परिहार परख करने में उपयोगी थे, हम एक यादृच्छिक प्रभाव के रूप में तय की और प्रभाव को दोहराने के रूप में उपचार और पत्ती संख्या के साथ एक मिश्रित प्रभाव मॉडल का इस्तेमाल किया. हम कि डंठल लंबाई, ब्लेड क्षेत्र, ब्लेड लंबाई, ब्लेड चौड़ाई और डंठल लंबाई / लंबाई ब्लेड अनुपात काफी छाया उपचार से प्रभावित पाया गया है, जबकि ब्लेड घेरा और ब्लेड चौड़ाई / लंबाई ब्लेड अनुपात (<0.05 पी) नहीं थे. हमारे आंकड़ों से पता चला है कि LeafJ प्लगइन पत्ता छाया परिहार प्रतिक्रियाओं (2 चित्रा) पर अध्ययन के लिए उपयोगी है.
3. शुद्धता और LeafJ प्लगइन की गति
करने के लिए बड़े डेटा में LeafJ प्लगइन के प्रदर्शन को निर्धारित करने के लिए सेट हम आपरेशन समय और मैनुअल और प्लगइन मापन के बीच सटीकता की तुलना में. मैनुअल माप के लिए हम जगह है जहाँ पत्ती चौड़ाई तेजी से वृद्धि दिखाई सीमा / डंठल ब्लेड के रूप में परिभाषित किया. यह एक अनुभवी शोधकर्ता 1 के एक औसत लिया 9 मिनट 3 सेकंड मैनुअल माप द्वारा पांच पौधों (के बारे में 50 पत्ते) के साथ एक पारदर्शिता को मापने के लिए, LeafJ के साथ, जबकि यह केवल 3 मिनट 20 सेकंड लिया. 5 transparencies भर में औसत, मापने के साथ प्लगइन 5.7 बार मैनुअल माप की तुलना में तेजी से गया था. मैनुअल माप के अनुभव के साथ एक शोधकर्ता द्वारा कई मैनुअल माप बनाने में किया गया था, एक शुरुआत मैनुअल माप में काफी धीमी हो, LeafJ की एक भी अधिक से अधिक लाभ में जिसके परिणामस्वरूप. हम दो तरीकों से डेटा की तुलना द्वारा सटीकता का आकलन, डेटा सभी पत्ती मापदंडों के लिए अत्यधिक सहसंबद्ध थे (3 चित्रा). +३,५३२ डेटा बिंदुओं की 172 (4.9%), है कि तरीकों (सहसंबंध भूखंडों पर outliers होने के द्वारा evidenced) के बीच मजबूत अंतर दिखाया थे. हम इन outliers के कारण का विश्लेषण किया. Outliers की 172, 29 LeafJ प्लगइन माप के दौरान त्रुटियों के कारण थे और 143 मैनुअल माप में त्रुटियों के कारण थे. इस त्रुटि विश्लेषण भी प्लगइन माप की सटीकता दिखाया.
jove_step "> 4 सेल आकार और सेल नंबर मापनLeafJ की स्वतंत्र हम भी सेल संख्या और आकार को मापने के लिए एक कुशल काम प्रवाह विकसित. सैद्धांतिक रूप से सेल नंबर और आकार को नौ श्रेणियों में उत्परिवर्ती पौधों वर्गीकृत जब जंगली प्रकार के साथ तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, (1) छोटे सेल संख्या में कमी के साथ कोशिकाओं के आकार, (2) सामान्य सेल नंबर के साथ छोटे कोशिकाओं, (3) बढ़ कोशिका के साथ छोटी कोशिकाओं नंबर, सेल संख्या में कमी के साथ (4) सामान्य कोशिका आकार, (5) सामान्य सेल नंबर के साथ सामान्य कोशिका का आकार, (6) सेल संख्या में कमी के साथ सामान्य कोशिका आकार, (7) सेल नंबर में कमी के साथ बड़ा सेल आकार (8) बड़ा सामान्य सेल नंबर के साथ सेल आकार (9) वृद्धि की सेल संख्या 15,16 के साथ बड़ा सेल आकार. हम Arabidopsis thaliana के 67 जीनोटाइप अपने सेल गोली आधारित आकार और सेल नंबर माप पद्धति का उपयोग में पत्ता सेल मानकों को मापा. हम 224 पौधों की 877 पत्तों से 8629 कोशिकाओं की कोशिका के आकार को मापा. सेल घनत्व ख गुणाy पत्ती क्षेत्र (द्वारा मापा LeafJ), हम कुल 219 पौधों से 438 पत्तियों का पत्ता सेल नंबर डेटा का अनुमान है. हमारे विश्लेषण छह संभव नौ श्रेणियों (एफ ig 4.) के रूप में इन जीनोटाइप रखा. सामान्य कोशिका के आकार और संख्या, दूसरा सबसे बड़ा (8): सबसे बड़ा वर्ग (5) सामान्य सेल नंबर के साथ बड़ा सेल आकार था. हालांकि अनुवर्ती काम की जरूरत है, यह पता चलता है कि हमारी विधि गोली आधारित पत्ता सेल आकार और संख्या के आधार पर म्यूटेंट को वर्गीकृत किया जा सकता है.
चित्रा 1 / डंठल पत्ती ब्लेड सीमा का पता लगाने और उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस का एक उदाहरण है. नोट कि LeafJ डंठल / पत्ता ब्लेड सीमा स्वतः परिभाषित (चित्रा 1B) करने में सक्षम है. बड़ा figu देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंफिर से.
चित्रा 2. LeafJ प्लगइन विभिन्न पत्ता मानकों में छाया परिहार प्रतिक्रियाओं का पता लगा सकता है. 6 पत्ती प्रत्येक हालत (सूर्य और छाया) के तहत सात जंगली प्रकार के पौधे (Arabidopsis thaliana कोलंबिया ecotype) से 3 पत्ता जांच की गई. ऊपर से नीचे सही करने के लिए छोड़ दिया, y-अक्ष इकाइयों मिमी, मिमी, 2 मिमी, ब्लेड लंबाई डंठल लंबाई के अनुपात, और ब्लेड लंबाई के ब्लेड चौड़ाई अनुपात बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. LeafJ प्लगइन बेहद सटीक है. सीपुस्तिका और ३,५३२ डेटा बिंदुओं से LeafJ प्लगइन माप से डेटा की orrelation. प्रत्येक डॉट एक पत्ती का प्रतिनिधित्व करता है. ग्रीन डॉट्स इस ग्राफ में 170 outliers संकेत मिलता है. पत्ती क्षेत्र के अक्ष मिमी 2 सभी दूसरों मिमी. प्रत्येक पैरामीटर के सामने नंबर पत्ता (यानी "3" 3 पत्ता है) की स्थिति का प्रतिनिधित्व करते हैं.
चित्रा 4 पत्ता सेल और Arabidopsis thaliana के 67 जीनोटाइप के बीच पत्ता सेल नंबर क्षेत्र के तितर बितर साजिश. प्रत्येक बिंदु प्रत्येक छाया हालत के तहत हो जीनोटाइप के phenotypes का प्रतिनिधित्व करता है. (1) सेल नंबर में कमी के साथ छोटे सेल आकार, (2) छोटे सेल: पौधे नौ जंगली प्रकार (कर्नल) से अपने अंतर के रूप में एक रेखीय मॉडल मिश्रित प्रभाव और कई परीक्षण पी मूल्यों सही द्वारा निर्धारित के आधार पर श्रेणियों में वर्गीकृत किया गया आदर्श के साथ आकारअल सेल नंबर (3) छोटे सेल आकार बढ़ा सेल नंबर के साथ, (4) कम सेल नंबर के साथ सामान्य कोशिका का आकार, (5) सामान्य सेल नंबर के साथ सामान्य कोशिका आकार, (6) सामान्य कोशिका का आकार कम सेल नंबर के साथ (7 कम सेल नंबर, (8) सामान्य सेल नंबर के साथ बड़ा सेल आकार, (9) बढ़ सेल नंबर के साथ बड़ा सेल आकार के साथ बड़ा सेल आकार). जंगली प्रकार (कर्नल) के phenotype "*" इंगित करता है.
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Discussion
हमारी 'LeafJ "प्लगइन डंठल लंबाई की माप अर्द्ध स्वचालित रूप से सक्षम बनाता है, throughput मैनुअल माप पर लगभग 6 गुना बढ़. डंठल लंबाई SAS के एक महत्वपूर्ण सूचकांक है और भी डूब के प्रतिरोध और hyponastic 17 विकास के रूप में अन्य घटनाएं, एक मील का पत्थर है. इसलिए इस प्लगइन संयंत्र शोधकर्ताओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी हो सकता है.
हमारी प्लगइन एक सुस्थापित जावा आधारित मुफ्त सॉफ्टवेयर, ImageJ में कार्यान्वित किया जाता है. यह आसान स्थापना पार मंच सक्षम बनाता है. कार्यक्रम के संशोधन की आसानी भी LeafJ प्लगइन का एक फायदा है क्योंकि ImageJ plugins के पहले से ही एक बड़ा पुस्तकालय है कि जावा और ImageJ मैक्रो भाषा (द्वारा लिखा गया है http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : शुरू ). वर्तमान में हम केवल Arabidopsis पत्तियों परीक्षण किया है, लेकिन हमारे एल्गोरिथ्म / डंठल पत्ती ब्लेड सीमा का पता लगाने के लागू हो सकते हैंओ अन्य द्विबीजपत्री प्लगइन के कुछ संशोधन के बाद छोड़ देता है.
LeafJ प्लगइन का परीक्षण करने के दौरान हमने पाया कि 14 त्रुटियों की सबसे datasheets और / या संयंत्र जीनोटाइप की mislabeling पर नकल परिणाम misplacing के रूप में मानव की गलतियों से आया. दुर्लभ मामलों में ब्लेड / डंठल पत्ती सीमा को गलत तरीके से बुलाया गया था, मैनुअल सुधार की जरूरत महसूस और कॉपी और पेस्ट की गलतियों के अतिरिक्त जोखिम पैदा कर. हम thresholding मूल्यों द्वारा (एक) डेटा (उदाहरण के लिए पत्ती की लंबाई की तुलना में अब petioles) पर देख रहे हैं और इस तरह के त्रुटियों का पता लगा सकता है (ख) दोहराया नमूना हालत (उदाहरण के लिए "सूरज" या "छाया"), जीनोटाइप, या पत्तियों की स्थिति को खोजने के द्वारा.
हमारी गोली स्पर्श स्क्रीन विधि और माप की सटीकता की गति में मदद की. हमारे विधि की सीमा है कि मुख्य कंप्यूटर और टच स्क्रीन गोली के बीच संचार वायरलेस लोकल एरिया नेटवर्क (लैन) की गति पर निर्भर करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
LeafJ JNM द्वारा लिखा गया था जब वह ग्लैडस्टोन संस्थानों में डॉ. कैथरीन पोलार्ड प्रयोगशाला में विश्राम पर था.
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या IOS-0,923,752) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
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