Summary
Dimostrazione di metodi chiave per le misurazioni ad alta foglia di throughput. Questi metodi possono essere utilizzati per accelerare la fenotipizzazione foglia nello studio di molte piante mutanti o comunque impianti di vagliatura da fenotipo foglia.
Abstract
Fenotipizzazione High throughput (phenomics) è un potente strumento per collegare i geni alle loro funzioni (leggi l'articolo 1 e recenti esempi 2-4). Foglie sono l'organo fotosintetica primaria, e la loro dimensione e la forma variano evolutivamente e ambientalmente nell'impianto. Per queste ragioni gli studi sulla morfologia delle foglie richiedono la misurazione di parametri multipli da numerose foglie, che è meglio fare da strumenti phenomics semi-automatici 5,6. Ombra Canopy è un importante spunto ambientale che colpisce l'architettura vegetale e storia di vita, la suite di risposte è la denominazione collettiva di evitare la sindrome di tonalità (SAS) 7. Tra le risposte SAS, ombra indotta allungamento foglia picciolo e le variazioni di area di lama sono particolarmente utili come indici 8. Ad oggi, i programmi a foglia (ad esempio SHAPE 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) in grado di misurare e classificare i contorni foglia forma delle foglie, Ma non può emettere lunghezza picciolo. La mancanza di sistemi su larga scala di misura di piccioli fogliari ha inibito approcci phenomics a SAS di ricerca. In questo articolo, si descrive un plugin di nuova concezione ImageJ, chiamato LeafJ, che possono rapidamente misurare la lunghezza picciolo ei parametri lama foglia della pianta modello Arabidopsis thaliana. Per la foglia occasionale che la correzione manuale richiesta del picciolo / foglie confine lama abbiamo usato un touch-screen tablet. Inoltre, cellule forma di foglia e il numero di cellule foglia sono importanti determinanti della dimensione del foglio 13. Separata da LeafJ si presentano anche un protocollo per l'utilizzo di un touch-screen tablet per misurare la forma delle cellule, l'area e dimensione. Il nostro sistema di foglia tratto di misurazione non si limita alla prevenzione ombra di ricerca e accelererà fenotipizzazione foglia di mutanti e piante di screening di fenotipizzazione foglia.
Protocol
1. Materiali vegetali
Si noti che questo protocollo la crescita delle piante è destinato per rilevare evitare risposta ombra. È possibile coltivare le piante sotto la condizione preferita.
- Cospargere semi di Arabidopsis thaliana in materia di acqua filtri di carta imbevuti di 9 centimetri piastre di Petri e conservare (stratificare) li a 4 ° C per quattro giorni al buio.
- Trasferire queste piastre di Petri per condizioni di sole simulato: 80-100 μE radiazione fotosinteticamente attiva (PAR) e molto rosso supplemento di portare la R: rapporto FR a 1,86. Condizioni di utilizzo giorno lungo (16 ore di luce / 8 ore buio) e la temperatura costante di 22 ° C. Incubare in questa condizione per tre giorni per permettere ai semi di germinare.
- Trasferimento seme germogliato nel terreno e mantenere le piante in condizioni di Dom Per esperimenti su larga scala, si consiglia di preparare i tag piccoli per l'etichettatura di ogni impianti utilizzando dati Gestore stampa unione in Microsoft Word 2004 (o successivo) per la produzione di etichette.
- Undici giorni dopo il transfer al suolo, spostare la metà degli impianti a condizione tonalità: come sole, ma con supplemento di far-luce rossa per portare la R / FR rapporto a 0,52.
- Dopo altre dodici giorni, le piante sono pronte per l'imaging foglia. In questa fase le foglie più vecchie ancora del tutto sviluppato, mentre giovani foglie sono in fase di espansione, in modo da catturare un'istantanea di sviluppo. Si consiglia di scegliere un orario diverso di sviluppo a seconda delle esigenze.
2. Catturare le immagini Leaf sezionato
- Preparare lucidi etichettati con genotipo vegetale e condizioni di crescita con cinque cornici rettangolari. Un frame corrisponde alle foglie di una pianta. Microsoft Excel può essere utilizzato per stampare una griglia coerente con etichette.
- Staccare le foglie di 26 giorni vecchi impianti.
- Scansione lascia a 600 dpi su un scanner piano. Notare che parte da un impianto deve essere posizionato verticalmente all'interno di una finestra nera in un sandwich di fogli trasparenti. Evitare di toccare le foglieal telaio di una finestra nera e foglie sovrapposte, che darà errori nelle procedure seguenti.
3. Foglia Image Analysis per LeafJ
- Scarica ImageJ Trascinare il file LeafJ.jar nella cartella plugins di ImageJ.
- Aprire un file di immagine in ImageJ 1.45s o versioni successive 14.
- Dividere l'immagine in tre canali di colore (rosso, verde e blu) da "Immagine a colori> Canali> Split" e applicare la soglia per l'immagine nel canale blu.
- Selezionare tutte le foglie da una pianta con uno strumento rettangolo (Figura 1A).
- Selezionare "LeafJ" dal menu plugin.
- Selezionare informazioni di annotazione per questa pianta dalla finestra di dialogo che appare. È possibilemodificare i valori di default che appaiono qui cliccando su "modificare queste opzioni".
- Dopo l'esecuzione di plug LeafJ e prima di fare clic su "OK", modificare le linee tracciate dalla regione di interesse (ROI) window manager (se necessario Figura 1B). Un touch-screen tablet (come un iPad) è utile per questa procedura. iPads può essere collegato ad un computer come un monitor esterno utilizzando il software di visualizzazione Air.
- Esportare i risultati di misura e le informazioni associate (i nomi dei file, tempo di fioritura, che si disgregano per, misurati dai, ecc) per Microsoft Excel o software equivalente.
4. Foglia Image Analysis cella in ImageJ
- Fissare sezionato lascia come descritto nel riferimento 15 dopo la scansione (fase 2). Foglie FAA fissi possono essere conservati a 4 ° C per almeno 6 mesi.
- Eliminare le foglie modificando fissativo FAA per cloralio idrato soluzione e foglie incubare per 1 ~ 2 ore prima osservazione al microscopio 15.
- Monte foglie mimicroscopio scorre con tricomi rivolto verso l'alto. Utilizzando ingrandimento 40x su un microscopio composto, strato mesofillo immagine del del centro di ogni foglia su entrambi i lati della vena principale, evitando cellule vicine tricomi o venature.
- Cella foglia Trace delinea da strumento di ImageJ gestore ROI con l'aiuto del touch-screen tablet e uno stilo (come descritto al punto 3). Analisi delle immagini cellulare utilizza le funzioni integrate di ImageJ, ma non richiede LeafJ.
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Representative Results
1. Immagini Leaf Mostra stime del picciolo e Blade Boundary foglia, e la loro finestra di misura
Una delle caratteristiche più utili di LeafJ è il rilevamento automatico della foglia lama / picciolo confine (Figura 1). L'algoritmo LeafJ funziona come segue: la funzionalità incorporata ImageJ ParticleAnalyzer viene utilizzata per individuare e determinare l'orientamento delle foglie all'interno della selezione dell'utente. Per ciascuna anta la larghezza della foglia è determinato lungo intero asse della foglia. Allora la variazione di larghezza in ciascuna posizione lungo l'asse viene determinato utilizzando una finestra di esecuzione (la larghezza media per le sette posizioni prossimali alla posizione focale viene sottratta dalla larghezza media per le sette posizioni distali alla posizione focale). Il picciolo / lama limite è definito come la prima posizione oltre la base foglia in cui la variazione di larghezza è maggiore del 90% di tutte le differenze calcolate larghezza. LeafJ fa controlli supplementari per aumentare reliabibilità di questa chiamata; specificamente LeafJ richiede anche che 1) la larghezza supera il 5% più stretto delle posizioni in lunghezza (questo impedisce chiamate aberranti alla base picciolo), 2) la regione prossimale alla posizione focale non ha un grande cambiamento in larghezza, e 3) la larghezza del foglio 20% distale alla posizione focale è almeno 150% più largo nella posizione focale (vero se la posizione focale è il confine perché 20% prossimale al limite possa essere lama e quindi molto più ampio).
Una volta LeafJ ha definito il picciolo / lama confine, built-in classi di ImageJ e metodi vengono utilizzati per determinare la zona della pala, il perimetro e circolarità. Metodi incorporati ImageJ sono utilizzati anche per adattarsi un'ellisse alla lama e calcolare gli assi maggiore e minore dell'ellisse che (quindi utilizzato come lama lunghezza e larghezza). Lunghezza picciolo è determinato da una linea che traccia lungo il centro dell'area picciolo.
2. Rilevamento di Shade-indotta allungamento Picciolo </ P>
Per chiedere se le misure LeafJ sono stati utili per evitare dosaggio ombra, abbiamo utilizzato un modello misto effetti con il trattamento e numero di foglie come effetti fissi e replicare come un effetto casuale. Abbiamo trovato che la lunghezza picciolo, zona lama, lunghezza della lama, larghezza della lama, e il picciolo lunghezza / lama rapporto di lunghezza sono stati significativamente influenzati dal trattamento ombra, mentre circolarità lama e la lunghezza / larghezza lama rapporto lama non erano (p <0,05). I nostri dati hanno mostrato che il plugin LeafJ è utile per gli studi sulle risposte foglia evitare ombra (Figura 2).
3. Precisione e velocità del Plugin LeafJ
Per determinare le prestazioni del plugin LeafJ in grandi serie di dati abbiamo confrontato tempo di funzionamento e la precisione tra il manuale e le misurazioni plugin. Per le misurazioni manuali abbiamo definito il picciolo / lama di confine come il luogo dove la larghezza della foglia sembra aumentare rapidamente. Ci sono voluti un ricercatore esperto una media di 1 9 min 3 sec per misurare un lucido con cinque stabilimenti (circa 50 foglie) di misurazione manuale, mentre con LeafJ ci sono voluti solo 3 min 20 sec. Media nei 5 lucidi, misurando con il plugin è di 5,7 volte più veloce di misurazione manuale. La misurazione manuale è stato fatto da un ricercatore con esperienza nella produzione di misurazioni manuali molti, un principiante potrebbe essere notevolmente più lento di misurazione manuale, con un conseguente vantaggio ancora maggiore di LeafJ. Abbiamo valutato l'accuratezza confrontando i dati dai due metodi, i dati sono stati altamente correlati per tutti i parametri foglia (Figura 3). Dei 3532 punti di dati ci sono stati 172 (4,9%), che ha mostrato forti differenze tra i metodi (rappresentati per essere valori anomali sui grafici di correlazione). Abbiamo analizzato la causa di questi valori anomali. Valori anomali di 172, 29 sono stati a causa di errori durante la misurazione plug LeafJ e 143 sono dovuti a errori di misura manuale. Questa analisi ha anche mostrato errore precisione della misurazione plugin.
jove_step "> 4. Dimensione cella di misura e numero di cellulareIndipendentemente LeafJ abbiamo anche sviluppato un flusso di lavoro efficiente per misurare il numero di cellulare e la dimensione. Numero di cellule teoricamente e dimensioni possono essere utilizzati per classificare piante mutanti in nove categorie rispetto al tipo selvatico; (1) con dimensioni più piccole cellule numero di cellule è diminuita, (2) piccole celle con numeri cellulari normali, (3) piccole cellule con cellulare aumentata numeri, (4) la dimensione delle cellule normali con il numero di cellule è diminuita, (5) formato delle cellule normali con numero di cellule normali, (6) la dimensione della cella normale con il numero di cellule è diminuita, (7) formato cella più grande con il numero di cellule è diminuita, (8) più grandi dimensione delle celle con numeri cellulari normali, (9) formato cella più grande numero di cellule con aumento 15,16. Abbiamo misurato i parametri di cella foglia in 67 genotipi di Arabidopsis thaliana utilizzando il nostro tablet basato su dimensione della cella e il numero di metodo delle celle di misura. Abbiamo misurato dimensione della cella di 8.629 celle da 877 foglie di piante 224. Moltiplicando densità a cellule By superficie fogliare (misurata con LeafJ), abbiamo stimato totale foglio dati della cella numero di 438 foglie di 219 piante. La nostra analisi messo questi genotipi in sei delle nove categorie possibili (F ig. 4). Il più grande categoria è stato (5): dimensioni delle cellule normali e il numero, in secondo luogo più grande è stato (8): la dimensione della cella più grande, con il numero delle cellule normali. Sebbene follow-up lavoro è necessario, questo suggerisce che la nostra tavoletta basata metodo può essere utilizzato per classificare mutanti basato su foglia dimensioni della cella e numero.
Figura 1. Un esempio di picciolo / foglia rilevamento lama confine e interfaccia utente. Si noti che LeafJ è in grado di definire picciolo / foglia confine lama automaticamente (Figura 1B). Clicca qui per ingrandire figurativori.
Figura 2. Plug LeafJ in grado di rilevare le risposte evitare ombra nei parametri foglia vari. Foglia 3 a foglia 6 da sette piante di tipo selvatico (Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia) in ogni condizione (sole e ombra) sono stati esaminati. Da sinistra in alto a destra in basso, l'asse y unità sono mm, mm, mm, mm 2, rapporto di lunghezza picciolo di lunghezza della lama, e il rapporto tra la lunghezza e la larghezza della lama della lama. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Plug LeafJ è estremamente preciso. Correlation dei dati derivanti dalla misurazione manuale e misurazione plug LeafJ da 3532 punti dati. Ogni punto rappresenta una foglia. Punti verdi indicano le 170 outlier in questo grafico. Assi di superficie fogliare è mm 2 tutti gli altri sono mm. Numeri di fronte a ciascun parametro rappresentano la posizione foglia (cioè "3" è la terza foglia).
Figura 4. Diagramma di dispersione di superficie fogliare cellula e cellula numero di foglie tra i 67 genotipi di Arabidopsis thaliana. Ogni punto rappresenta i fenotipi di ciascun genotipo coltivate in condizioni di ombra. Le piante sono state classificate in nove categorie in base alla loro differenza da wild type (Col) determinato da un lineare misto modello di effetti e molteplici test corretti valori di p: cell (1) dimensione della cella più piccola, con il numero di cellule è diminuito, (2) minore dimensioni con normaal numero di cellulare, (3) la dimensione della cella più piccola, con un aumento del numero di cellule, (4) la dimensione della cella normale con numero di cellulare è diminuito, (5) dimensioni delle cellule normali con il numero di cellule normali, (6) la dimensione della cella normale con numero di cellulare è diminuito, (7 ) Dimensione cella più grande con diminuzione del numero di cellule, (8) formato cella più grande con numero di cellule normali, (9) formato cella più grande numero di cellule con aumentata. "*" Indica il fenotipo di tipo selvatico (Col).
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Discussion
Il nostro plugin "LeafJ" consente la misurazione della lunghezza picciolo semi-automaticamente, aumentando il throughput quasi 6 volte misurazione manuale. Lunghezza Picciolo è un indice importante della SAS ed è anche un punto di riferimento di altri fenomeni, come la resistenza sommersione e la crescita hyponastic 17. Pertanto questo plugin può essere utile per una vasta gamma di ricercatori vegetali.
Il nostro plugin è implementato in una ben consolidata java basato su software libero, ImageJ. Ciò consente un facile cross-piattaforma di installazione. Facilità di modifica del programma è anche un vantaggio del plugin LeafJ ImageJ perché ha già una vasta libreria di plugin che sono stati scritti da Java e ImageJ linguaggi macro ( http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : avviare ). Al momento abbiamo solo provato foglie di Arabidopsis, ma il nostro algoritmo di picciolo / foglie di rilevamento lama confine potrebbero applicare tdicotiledoni o altro lascia dopo qualche modifica del plugin.
Durante i test plug LeafJ, abbiamo trovato la maggior parte dei 14 errori provenienti da errori umani, come misplacing risultati copiati su schede tecniche e / o errore di etichettatura dei genotipi vegetali. In rari casi il picciolo / foglia confine lama è stato chiamato in modo non corretto, che richiede la correzione manuale e la creazione di ulteriori rischi di errori di copia e incolla. Siamo in grado di rilevare tali errori dopo aver guardato i dati (a) in base ai valori thresholding piccioli (ad esempio più di lunghezza anta) e (b), trovando condizioni del campione duplicato (ad esempio, "sole" o "ombra"), genotipo, o la posizione di foglie.
Nostro metodo touch-screen tablet facilitato accuratezza e velocità di misurazione. Limitazione del nostro metodo è che la comunicazione tra il computer principale e la tavoletta touch screen si basa sulla velocità della rete locale senza fili (LAN).
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
LeafJ è stato scritto da JNM mentre era in anno sabbatico nel laboratorio del Dr. Katherine Pollard presso gli Istituti Gladstone.
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation (numero di licenza IOS-0923752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
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