Summary
高スループットの葉測定のための主要なメソッドのデモンストレーション。葉の表現型によって多くの植物変異体または他の方法でスクリーニング植物を勉強したときにこれらの方法は、葉表現型解析を加速するために使用することができます。
Abstract
ハイスループット表現型（フェノミクス）は（レビュー1と最近の例2-4を参照）、それらの機能に遺伝子を連結するための強力なツールです。葉は一次光合成器官であり、その大きさや形状は、工場内の発達や環境によって異なります。これらの理由から、葉の形態に関する研究は最高の半自動化ツールフェノミクス5,6によって行われ、多数の葉から、複数のパラメータの測定を必要とする。キャノピーシェードは、植物のアーキテクチャと生活史に影響を与える重要な環境合図です;応答一式を総称して日陰の忌避症候群（SAS）の7と呼ばれています。 SASの応答の中で、誘導された日陰の葉葉柄伸長およびブレード面積の変化は、インデックス8として特に有用である。現在までに、葉の形のプログラム（ 例えば 、SHAPE 9、ラミナ10 LeafAnalyzer 11 LEAFPROCESSOR 12）葉の輪郭を測定し、葉の形を分類することができますしかし、葉柄の長さを出力することはできません。葉の葉柄の大規模な計測システムの欠如は、SAS研究へフェノミクスアプローチを阻害してきた。本稿では、急速にモデル植物シロイヌナズナの葉柄長、葉身のパラメータを測定することができLeafJと呼ばれる新開発のImageJプラグインについて解説する。葉柄/リーフブレード境界の必要な手動補正は、我々はタッチスクリーンのタブレットを使用したことを時折葉のために。さらに、葉の細胞の形状及び葉の細胞数は葉の大きさ13の重要な決定要因である。 LeafJは別に我々はまた、セルの形状、面積、サイズを測定するためのタッチスクリーンのタブレットを使用するためのプロトコルを提示。私たちの葉の形質の測定システムは日陰回避の研究に限定されず、葉表現型解析により多くの変異体およびスクリーニング植物の葉の表現型解析を加速していきます。
Protocol
1。植物材料
この植物の成長プロトコルは日陰回避反応を検出するための目的としていることに注意してください。あなたの好きな条件の下で植物を育てることができます。
- 彼らは暗闇の中で4日間4℃（階層化）9センチメートルペトリ皿とストアに濾紙を浸した水でシロイヌナズナの種子は振りかける。
- シミュレートされた日の状態にこれらのペトリ皿を移す：1.86にFR比：80から100μE光合成有効放射（PAR）と遠赤サプリメントは、Rを持参する。長日条件（16時間明/ 8時間暗）、22℃の一定温度を使用する種子が発芽できるようにするために3日間この条件でインキュベートする。
- 土壌に発芽種子を移し、日条件下で植物を保つ。大規模な実験のために、私たちはラベルを作るためのMicrosoft Word 2004（またはそれ以降）でのデータマージマネージャを使用して各植物を標識するための小さなタグを準備することをお勧めします。
- 11日後のTR土壌へansferは、日陰の条件に対する植物の半分を移動：日としてではなく、0.52にR / FR比をもたらすために補足遠赤色光と同じ。
- 追加の12日後、植物は葉のイメージングのための準備が整いました。あなたは開発のスナップショットをキャプチャされるよう若い葉がまだ拡大しているのに対し、この段階では、古い葉が完全に成熟してきた。あなたのニーズに応じてさまざまな発達の時間を選択することもできます。
2。解剖葉の画像を取り込む
- 5長方形のフレームを持つ植物の遺伝子型と成長条件で標識された透明シートを準備します。一つのフレームは1から植物の葉に対応しています。 Microsoft Excelは、ラベルと一致してグリッドを印刷するために使用することができます。
- 二〇から六日目の植物の葉を解剖。
- スキャンは、フラットベッドスキャナで600dpiで残します。 1工場から出るノートは透明シートのサンドイッチに黒いウィンドウ内に垂直に配置する必要があります。葉に触れないようにしてください以下の手順でエラーを与える黒い窓枠と重複葉、へ。
3。 LeafJによる葉の画像解析
- ImageJのダウンロードImageJのプラグインフォルダにLeafJ.jarファイルをドラッグします。
- ImageJは1.45s以降14で画像ファイルを開きます。
- "イメージ>カラー>スプリットチャネル"による三色チャンネル（赤、緑、青）に画像を分割し、青チャンネルの画像にしきい値を適用します。
- 長方形ツール（ 図1A）で1植物から葉をすべて選択します。
- プラグインメニューから "LeafJ"を選択します。
- 表示されるダイアログボックスから、この植物のアノテーション情報を選択します。あなたができる"これらのオプションを編集"をクリックしてここに表示されるデフォルト値を編集します。
- LeafJプラグインを実行した後、 "OK"ボタンをクリックする前に、関心領域（ROI）のマネージャのウィンドウ（; 図1B必要な場合）の領域からトレース行を編集します。タッチスクリーンのタブレットは（iPadなど）は、この手順のために有用である。 iPadではエアディスプレイ·ソフトウェアを使用して外部モニタとしてコンピュータに接続することができます。
- 測定結果およびMicrosoft Excelまたは同等のソフトウェアに関連する情報（ファイル名、開花時期によって、解剖により測定など）をエクスポートします。
4。 ImageJの中で葉の細胞画像解析
- 切開修正する（ステップ2）スキャンした後にリファレンス15に記載のように残します。 FAA固定葉は少なくとも6ヶ月間、4℃に保つことができる。
- 顕微鏡観察15日までに1〜2時間抱水クロラール水溶液とインキュベート葉にFAAの固定を変更することにより、葉をクリアします。
- マウントはマイルの葉croscopeは毛を上に向けてスライドします。毛や静脈の近くに細胞を避け、主静脈のいずれかの側のそれぞれの葉の中心の肉層画像、複式顕微鏡で40倍の倍率を使用しています。
- タッチスクリーンタブレットとスタイラス（手順3で説明）の助けを借りて、ImageJのROI Managerツールで葉細胞の輪郭をトレースします。細胞画像解析はImageJの組み込み機能を使用しますが、LeafJを必要としません。
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Representative Results
1。葉柄と葉身の境界の推定値を示し、葉画像、およびその計測ウィンドウ
LeafJの最も便利な機能の一つは、葉身/葉柄境界（ 図1）の自動検出である。 LeafJアルゴリズムは次のように動作します。ビルトインImageJのParticleAnalyzer機能は、ユーザーの選択の内側の葉の向きを見つけて、決定するために使用されます。それぞれの葉のために葉の幅は葉の全体の軸に沿って決定されます。その後、軸に沿った各位置での幅の変更は、実行中のウィンドウを（焦点位置に近接した7つの位置の平均幅が焦点位置から遠位の7つの位置の平均幅から差し引かれる）を用いて決定される。葉柄/ブレード境界は幅の変化は、すべて計算された幅の差の90％よりも大きい葉基部を越えた最初の位置として定義されています。 LeafJは追加チェックがreliabiを高めるために行いますこの呼び出しのlity、具体LeafJも1）幅は長さの位置の狭い5％（これは葉柄基部に異常な呼び出しを防ぎます）を超えている必要があり、2）焦点位置に近接した地域は、大きな変化はありません幅で、3）焦点位置から遠位の葉の幅の20％は焦点位置よりも少なくとも150％広くなっている（真の境界に近接した20％が故に刃とでなければならないので、焦点位置が境界である場合はるかに広い）。
一度LeafJはImageJのクラスやメソッドに組み込まれて葉柄/ブレード境界を定義しているブレード面積、周囲長、及び真円度を決定するために使用されます。内蔵ImageJの方法もブレードに楕円をフィットするように、その楕円の長軸と短軸を（してから、ブレードの長さと幅として使用）の計算に使用されます。葉柄の長さは葉柄エリアの中心に沿ってトレースするラインによって決定されます。
2。シェード誘起葉柄伸長の検出</ P>
LeafJ測定は日陰の忌避をアッセイに有用であったかどうかを尋ねるために、我々は固定効果として治療や葉数との混合効果モデルを使用し、ランダム効果としてレプリケートされます。刃の真円とブレード長/刃幅比が有意（p <0.05）はなかったのに対し、我々は、葉柄長、ブレード面積、ブレードの長さ、刃幅、葉柄の長さ/ブレード長さ比大幅シェード治療の影響を受けましたが見つかりました。我々のデータはLeafJプラグインはリーフシェード回避反応（ 図2）の研究に有用であることを示した。
3。 LeafJプラグインの精度とスピード
大きなデータでLeafJプラグインの性能を決定するために、我々はマニュアルとプラグインの測定値の間の動作時間と精度を比較し設定します。手動測定のために私達は葉の幅が急激に増加して登場した場所として、葉柄/ブレード境界を定義しました。それは、経験豊富な研究者の1の平均を取ったそれがわずか3分20秒かかったとしながらLeafJ 9分3秒、手動測定で5工場（約50葉）で1透明度を測定する。 5 OHPフィルムで平均、プラグインを使用して測定することは、手動測定より5.7倍速かった。マニュアル測定は多くの手動測定を行うの経験を持つ研究者によって行われた。初心者はLeafJのさらに大きな利点をもたらして、手動測定でかなり遅くなるでしょう。我々は、2つのメソッドからデータを比較することによって、精度を評価し、データは非常にすべての葉のパラメータ（ 図3）のために相関していた。 3532データ·ポイントの手法（相関プロット上の外れ値であることによって証明される）との間に大きな違いが認められた172（4.9％）あった。我々は、これらの外れ値の原因を分析した。 172外れ値のうち、29はLeafJプラグインの測定時にエラーが原因だったと143はマニュアル測定誤差によるものであった。このエラーは、分析は、プラグインの測定精度を示した。
セルのサイズと細胞数の測定jove_step "> 4。LeafJの独立した我々はまた、細胞の数と大きさを測定するための効率的な作業の流れを開発しました。野生型と比較した場合、理論的には細胞の数と大きさは9種類に変異植物を分類するために使用することができ、減少した細胞数を持つ（1）小さなセルサイズ、（2）正常な細胞数が小さい細胞、（3）増加した細胞と小さな細胞数字、減少した細胞数を持つ（4）通常の細胞の大きさ、（5）通常の細胞数が正常な細胞の大きさ、（6）減少し細胞数が正常な細胞の大きさ、（7）の減少細胞数が大きいセルサイズ、（8）拡大正常な細胞数と細胞の大きさ、（9）の増加、細胞数15,16持つ大きなセルサイズ。私たちは、タブレットベースのセルの大きさと細胞数の測定法を用いて、シロイヌナズナの67遺伝子型で葉セルパラメータを測定した。我々は224の植物の葉から877 8629個の細胞の大きさを測定した。細胞密度bを乗じyの葉面積（LeafJによって測定された）、私たちは219工場から438葉の全葉の細胞数のデータを推定した。我々の分析では、可能な9つのカテゴリ（F IG。4）の6にこれらの遺伝子型を置いた。正常な細胞の大きさと数、最大の第二は、（8）であった：最大のカテゴリーは（5）であった正常な細胞数を持つ大規模セルサイズ。フォローアップの作業が必要であるが、これは私たちのタブレットベースのメソッドは葉細胞の大きさと数に基づいて変異を分類するために使用することができることを示唆している。
図1：葉柄/リーフブレード境界検出とユーザインタフェースの一例。 LeafJます（ 図1B）を自動的にリーフ/葉柄ブレードの境界を定義することができることに注意してください。 大きいふぃぎゅを表示するにはここをクリック再。
図2 LeafJプラグインは様々な葉のパラメータで日陰の忌避反応を検出することができる。各条件（太陽と日陰）下7野生型植物（ シロイヌナズナ生態型コロンビア）から葉6〜3葉を調べた。左上から右下まで、y軸の単位はmm、ミリメートル、ミリメートル、mm 2で 、ブレードの長さ、葉柄の長さの比、ブレード幅に刃の長さの比である。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3 LeafJプラグインは非常に正確である。 C言語3532データポイントからの手動測定とLeafJプラグインの測定からデータのorrelation。各ドットは1葉を表しています。緑色のドットは、このグラフの170の異常値を示しています。葉面積の軸は2、その他はすべてmmですmmです。各パラメータの前の数字は、葉の位置（ すなわち、 "3"は3葉である）を表す。
図4： シロイヌナズナの67遺伝子型間葉細胞面積と葉の細胞数の散布図。各ポイントは日陰条件下で栽培各遺伝子型の表現型を表します。減少した細胞数が（1）小さなセルサイズ、（2）より小さい細胞：植物はp値を補正線形混合効果モデルとマルチテストで判断される野生型（COL）から、その差に基づいて、9つのカテゴリーに分類されたノルムをもつ大きさらの細胞数、（3）増加した細胞の数と小さなセルサイズ、減少した細胞数を持つ（4）通常の細胞の大きさ、（5）通常のセル番号、（6）減少し、細胞数との正常な細胞の大きさ、（7で正常な細胞の大きさ減少した細胞数、（8）通常の細胞数、（9）の増加、細胞数を持つ大きな細胞の大きさを持つ大きなセルサイズ）より大きなセルサイズ。 "*"は、野生型（COL）の表現型を示します。
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Discussion
私たちの "LeafJ"プラグインは手動測定のスループット約6倍に増加し、半自動的に葉柄の長さの測定を可能にします。葉柄の長さは、SASの重要な指標であり、またそのような冠水抵抗とhyponastic成長17のような他の現象のランドマークとなっています。したがって、このプラグインは、植物の研究者の広い範囲に役に立つかもしれません。
我々のプラグインは、十分に確立されたJavaベースのフリーソフトウェアはImageJで実装されています。これは簡単なクロスプラットフォームのインストールを行うことができます。 ImageJはすでにJavaと、ImageJマクロ言語（で書かれたプラグインの大規模なライブラリを持っているので、プログラムの修正のしやすさもLeafJプラグインの利点であるhttp://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial ：開始 ）。現在、我々は、 シロイヌナズナの葉のみをテストしますが、葉柄/リーフブレード境界検出の我々のアルゴリズムは、tを適用することができるプラグインのいくつかの変更が終了した後に他の双子葉植物の葉をO。
LeafJプラグインをテストする間に、我々は14のエラーのほとんどは、データシート、および/または植物の遺伝子型の偽装にコピーされた結果をなくすなどの人為的なミスから来ましたが見つかりました。まれに葉柄/リーフブレード境界は手動補正を必要とし、コピー＆ペーストのミスの追加的なリスクを作成、間違って呼ばれていました。我々は、重複サンプルの条件（ 例えば、 "日"や"日陰"）、遺伝子型、または葉の位置を見つけることによって、しきい値の値によってデータ（）（葉の長さよりも例えば葉柄より長い）を見て、（b）の後にこのようなエラーを検出することができる。
私たちのタッチスクリーンタブレット方法は、測定の精度と速度を容易にした。我々の方法の制限は、メインコンピュータとタッチスクリーンタブレットの間の通信はワイヤレスローカルエリアネットワーク（LAN）の速度に依存しています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
彼はグラッドストーン研究所の博士がキャサリン·ポラードの研究室でサバティカルを入れたままLeafJはJNMによって書かれました。
この作品は、全米科学財団（助成番号のIOS-0923752）からの助成金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
- Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
- Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
- Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
- Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570 (2012).
- Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
- Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157 (2012).
- Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
- Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
- Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82 (2008).
- Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
- Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
- Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
- Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
- Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).
