Summary
Demostración de métodos clave para la alta mediciones de rendimiento de hoja. Estos métodos se pueden utilizar para acelerar fenotipificación hoja al estudiar muchos mutantes de plantas o de otra manera las plantas de selección por fenotipo hoja.
Abstract
Fenotipado de alto rendimiento (phenomics) es una herramienta poderosa para la vinculación de genes a sus funciones (véase la revisión 1 y ejemplos recientes 2-4). Las hojas son el órgano fotosintética primaria, y su tamaño y forma pueden variar de desarrollo y el medio ambiente dentro de una planta. Por estas razones, los estudios sobre morfología de las hojas requieren la medición de varios parámetros de numerosas hojas, que no hay nada mejor semi-herramientas automatizadas phenomics 5,6. Sombra Canopy es una señal importante del medio ambiente que afecta a la arquitectura de planta y la historia de vida, el conjunto de las respuestas se conocen colectivamente como el síndrome de evitación sombra (SAS) 7. Entre las respuestas de SAS, sombra hoja inducida alargamiento pecíolo y los cambios en la zona de la cuchilla son particularmente útiles como índices 8. Hasta la fecha, los programas de hoja de forma (por ejemplo, forma 9, lámina 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) se pueden medir los contornos de hojas y categorizar formas de hojas, Pero no puede dar salida a la longitud del pecíolo. La falta de sistemas de medición a gran escala de los pecíolos de las hojas ha inhibido enfoques phenomics a SAS investigación. En este trabajo se describe un nuevo desarrollo de plug-ImageJ, llamado LeafJ, que rápidamente se puede medir la longitud del pecíolo y los parámetros de láminas foliares de la planta modelo Arabidopsis thaliana. Para la hoja ocasional que la corrección manual requerido de la frontera hoja peciolo / hoja se utilizó una tableta de pantalla táctil. Además, la forma de la hoja móvil y el número de hojas móviles son determinantes importantes del tamaño de la hoja 13. A parte de LeafJ también presentamos un protocolo para el uso de una tableta con pantalla táctil para la medición de la forma celular, el área y tamaño. Nuestro rasgo hoja sistema de medición no se limita a la investigación de evitar la sombra y acelerará fenotipificación hoja de muchos mutantes y plantas de detección por fenotipificación hoja.
Protocol
1. Materiales vegetales
Tenga en cuenta que este protocolo tiene como objetivo el crecimiento de plantas para la detección de tono de respuesta de evitación. Usted puede crecer las plantas en su condición de favorito.
- Espolvorear semillas de Arabidopsis thaliana en el agua empapados papeles de filtro en placas de Petri de 9 cm y almacén (estratificar) los a 4 ° C durante cuatro días en la oscuridad.
- Transfiera estas placas de Petri para condiciones de sol simulados: 80-100 μE radiación fotosintéticamente activa (PAR) y suplemento rojo lejano para llevar el R: FR proporción a 1,86. Utilice las condiciones de día largo (16 h de luz / 8 h oscuridad) y temperatura constante de 22 º C. Incubar en este estado durante tres días para permitir que las semillas germinen.
- Traslado de semillas germinadas en el suelo y mantener las plantas en condiciones dom. Para los experimentos a gran escala, se recomienda la preparación de pequeñas etiquetas para etiquetar cada una las plantas mediante el uso de datos Administrador de combinación de Microsoft Word 2004 (o posterior) para la fabricación de etiquetas.
- Once días después de transfer al suelo, mover la mitad de las plantas a condiciones de sombra: lo mismo que sol, pero con suplemento luz roja lejana para que la relación R / FR a 0,52.
- Después de un período adicional de doce días, las plantas están listas para la formación de imágenes hoja. En esta etapa, las hojas más viejas han madurado completamente, mientras que las hojas más jóvenes están todavía en expansión, por lo que permite capturar una instantánea del desarrollo. Es posible que desee elegir un momento diferente de desarrollo en función de sus necesidades.
2. La captura de imágenes disecados Leaf
- Prepare hojas de transparencias marcados con genotipo de la planta y las condiciones de crecimiento con cinco marcos rectangulares. Un cuadro corresponde a las hojas de una planta. Microsoft Excel puede ser utilizado para imprimir una rejilla coherente con las etiquetas.
- Diseccionar hojas de las plantas veintiséis días de edad.
- Scan sale a 600 ppp en un escáner de cama plana. Tenga en cuenta que las hojas de una planta se debe colocar verticalmente dentro de una ventana de color negro en un sándwich de láminas transparentes. Evite tocar las hojasa un marco de ventana de color negro y las hojas se solapan, lo que dará errores en los procedimientos siguientes.
3. Hoja de Análisis de Imágenes por LeafJ
- Descargar ImageJ Arrastre el archivo LeafJ.jar en la carpeta plugins de ImageJ.
- Abra un archivo de imagen en ImageJ 1.45s ó 14 después.
- Dividir la imagen en tres canales de color (rojo, verde, y azul) por "Color>> Canales de split" y aplicar umbral a la imagen en el canal azul.
- Seleccionar todas las hojas de una planta con una herramienta rectángulo (Figura 1A).
- Seleccione "LeafJ" del menú plugin.
- Seleccione información de anotación para esta planta desde el cuadro de diálogo que aparece. Usted puedeeditar los valores predeterminados que aparecen aquí haciendo clic en "editar estas opciones".
- Después de ejecutar plugins LeafJ y antes de hacer clic en "OK", editar líneas trazadas desde la región de la ventana del administrador de interés (ROI) (si es necesario; fig. 1B). Una tableta con pantalla táctil (como el iPad) es útil para este procedimiento. iPads se puede conectar a un ordenador y un monitor externo usando software Air Display.
- Exportación de resultados de las mediciones y la información asociada (nombres de archivo, tiempo de floración, disectadas por, medidos por, etc) para Microsoft Excel o software equivalente.
4. Célula de la hoja de análisis de imágenes ImageJ en
- Fijar diseccionado hojas como se describe en la referencia 15 después de la digitalización (paso 2). FAA hojas fijas se pueden mantener en 4 ° C durante al menos 6 meses.
- Limpiar las hojas cambiando fijador FAA para solución hidrato de cloral y las hojas se incuban durante 1 ~ 2 horas antes de la observación microscópica 15.
- Mount deja en micopio desliza con tricomas hacia arriba. Uso de un aumento de 40x en un microscopio compuesto, la imagen de la capa de mesófilo el centro de cada hoja en cada lado de la vena principal, evitando las células cerca de tricomas o venas.
- Célula de seguimiento hoja describe por la herramienta de ImageJ gerente ROI con la ayuda de la tableta de la pantalla táctil y un lápiz óptico (como se describe en el paso 3). Análisis de imagen celular utiliza las funciones incorporadas de ImageJ, pero no requiere LeafJ.
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Representative Results
1. Imágenes de hoja que muestra estimaciones del pecíolo y lámina de la hoja de Fronteras, y su ventana de medición
Una de las características más útiles de LeafJ es la detección automática de la hoja de cuchilla / pecíolo límite (Figura 1). El algoritmo LeafJ funciona como sigue: la incorporada en el ImageJ funcionalidad ParticleAnalyzer se utiliza para buscar y determinar la orientación de las hojas en el interior de la selección del usuario. Para cada hoja de la anchura de la hoja se determina a lo largo de todo el eje de la hoja. Entonces, el cambio de anchura en cada posición a lo largo del eje se determina mediante una ventana de funcionamiento (la anchura media de las siete posiciones proximales a la posición focal se resta de la anchura media de las siete posiciones distales a la posición focal). El límite pecíolo / cuchilla se define como la primera posición más allá de la base de la hoja, donde el cambio en la anchura es mayor que 90% de todas las diferencias de anchura calculada. LeafJ realiza comprobaciones adicionales para aumentar la fiabilidad de esta llamada; específicamente LeafJ también requiere que 1) la anchura excede el 5% más estrecha de las posiciones en la longitud (esto impide que las llamadas aberrantes en la base del pecíolo), 2) la región proximal a la posición focal no tiene un cambio importante de ancho, y 3) la anchura de la hoja 20% distal a la posición focal es de al menos 150% más ancho que en la posición focal (verdadero si la posición focal es el límite porque el 20% proximal al límite debe ser la cuchilla y por lo tanto mucho más amplia).
Una vez LeafJ ha definido el límite pecíolo / cuchilla, una función de las clases de ImageJ y métodos se utilizan para determinar el área de la hoja, el perímetro y la circularidad. Los métodos incorporados ImageJ se utilizan también para adaptarse a una elipse de la hoja y para calcular los ejes mayor y menor de la elipse (entonces se utiliza como longitud de la hoja y el ancho). Longitud del pecíolo se determina por una línea que traza a lo largo del centro del área de pecíolo.
2. La detección de Shade inducida Alargamiento del pecíolo </ P>
Preguntar si las mediciones LeafJ fueron útiles para ensayar la evitación sombra, se utilizó un modelo de efectos mixtos con el tratamiento y el número de hojas como efectos fijos y repetidas como un efecto aleatorio. Se encontró que la longitud del peciolo, de área de hoja, longitud de hoja, ancho de la hoja, y el pecíolo de longitud / cuchilla relación de longitud se vieron afectados significativamente por el tratamiento sombra, mientras que la circularidad cuchilla y la cuchilla de longitud / anchura cuchilla no (p <0,05). Nuestros datos muestran que LeafJ complemento es útil para los estudios sobre las hojas de sombra respuestas de evitación (Figura 2).
3. La precisión y la velocidad de la API LeafJ
Para determinar el rendimiento del plugin LeafJ en grandes conjuntos de datos se comparó el tiempo de funcionamiento y la precisión entre manual y las medidas de plugin. Para mediciones manuales se definió el límite pecíolo / cuchilla como el lugar donde el ancho de la hoja parece aumentar rápidamente. Tomó un investigador experimentado un promedio de 1 9 min 3 seg para medir una transparencia con cinco plantas (unas 50 hojas) por la medición manual, mientras que con LeafJ tardó sólo 3 min 20 seg. En promedio de 5 transparencias, midiendo con el plugin fue 5,7 veces más rápido que la medición manual. La medición manual ha sido realizado por un investigador con experiencia en la fabricación de muchas mediciones manuales, un principiante sería considerablemente más lento en la medición manual, lo que resulta en una ventaja aún mayor de LeafJ. Se evaluó la precisión mediante la comparación de los datos de los dos métodos, los datos fueron altamente correlacionados para todos los parámetros de hoja (Figura 3). De los 3.532 puntos de datos eran 172 (4,9%) que mostraron fuertes diferencias entre los métodos (evidenciado por ser valores atípicos en los gráficos de correlación). Hemos analizado la causa de estos valores atípicos. De 172 valores atípicos, 29 se debieron a errores en la medición plugin de LeafJ y 143 se debieron a errores en la medición manual. Este análisis también mostraron error de precisión de la medición plugin.
jove_step "4>. Celular tamaño y la medición Número de CelularIndependiente de LeafJ también hemos desarrollado un flujo de trabajo eficiente para medir el número de células y tamaño. Teóricamente el número de células y el tamaño se puede utilizar para clasificar las plantas mutantes en nueve categorías en comparación con el tipo salvaje; (1) menor tamaño de las células con el número de células disminuyó, (2) células más pequeñas con el número de células normales, (3) pequeñas células con células aumentó números, (4) de tamaño normal de las células con el número de células disminuyó, (5) el tamaño normal de las células con el número de células normales, (6) el tamaño normal de las células con el número de células disminuyó, (7) mayor tamaño de la celda con el número de células disminuyó, (8) más grandes tamaño de las celdas con el número de células normales, (9) mayor tamaño de la celda con el número de células aumento de 15,16. Medimos parámetros hoja celulares en 67 genotipos de Arabidopsis thaliana usando nuestra tableta basada en el tamaño celular y el método de medición del número de células. Se midió el tamaño de las células de 8.629 células de 877 224 hojas de las plantas. B multiplicando la densidad de célulasy área foliar (medido por LeafJ), se estimó un total de hoja de datos de números de celulares de 438 hojas de 219 plantas. Nuestro análisis colocado estos genotipos en seis de las nueve categorías posibles (F ig. 4). La categoría más grande era (5): tamaño normal de las células y el número, el más grande era segundo (8): tamaño mayor de células con el número de células normal. Aunque el trabajo de seguimiento que se necesita, esto sugiere que nuestra comprimido basado en el método puede ser utilizado para clasificar los mutantes basados en el tamaño de hoja y el número de células.
Figura 1. Un ejemplo de pecíolo / hoja de detección de límites de la cuchilla y la interfaz de usuario. Tenga en cuenta que LeafJ es capaz de definir pecíolo / hoja frontera hoja automáticamente (fig. 1B). Haga clic aquí para ampliar la figure.
Figura 2. Plugin de LeafJ podría detectar respuestas de evitación de sombra en los parámetros de varias hojas. Hoja 3 a 6 hojas de siete plantas de tipo silvestre (Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia) bajo cada condición (sol y sombra) fueron examinados. Desde la parte superior izquierda a la inferior derecha, las unidades del eje y son mm, mm, mm, 2 mm, relación entre la longitud del pecíolo de longitud de la hoja, y la relación de la longitud de la hoja de ancho de hoja. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. API LeafJ es muy precisa. Correlation de los datos de medición manual y medición LeafJ plug-in de 3.532 puntos de datos. Cada punto representa una hoja. Los puntos verdes indican los 170 valores atípicos en este gráfico. Ejes de área foliar es mm 2 todos los demás son mm. Los números delante de cada parámetro representa la posición de la hoja (es decir, "3" es la tercera hoja).
Figura 4. Diagrama de dispersión de área foliar celda y el número de células de las hojas entre 67 genotipos de Arabidopsis thaliana. Cada punto representa los fenotipos de cada genotipo cultivado bajo condiciones de sombra. Las plantas fueron clasificadas en nueve categorías basadas en su diferencia de tipo silvestre (Col) como se determina por un lineal de efectos mixtos modelo y múltiples pruebas de corrección de los valores de p: célula (1) tamaño más pequeño de células con el número de células disminuyó, (2) más pequeña tamaño con la normaal número de células, (3) un tamaño más pequeño de células con mayor número de células, (4) el tamaño normal de las células con el número de células disminuyó, (5) el tamaño normal de las células con el número normal de las células, (6) el tamaño normal de las células con el número de células disminuyó, (7 ) mayor tamaño de la celda con el número de células disminuyó, (8) mayor tamaño de la celda con el número de células normales, (9) mayor tamaño de la celda con el número de células aumentado. "*" Indica el fenotipo de tipo salvaje (Col).
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Discussion
Nuestro "LeafJ" plugin permite la medición de la longitud del pecíolo semi-automáticamente, aumentando el rendimiento casi 6 veces la medición manual. Longitud del peciolo es un índice importante de SAS y es también un punto de referencia de otros fenómenos, como la resistencia a la inmersión y el crecimiento hyponastic 17. Por lo tanto este plugin puede ser útil para una amplia gama de investigadores de la planta.
Nuestro plugin se ejecuta en un sistema bien establecido de Java basada en software libre, ImageJ. Esto permite una fácil instalación multi-plataforma. Facilidad de modificación del programa es también una ventaja del plugin LeafJ ImageJ porque ya tiene una gran biblioteca de plugins que fueron escritos por Java y lenguajes de macros ImageJ ( http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : start ). Actualmente sólo se comprueba hojas de Arabidopsis, pero nuestro algoritmo de pecíolo / hoja detección límite hoja podría aplicar tdicotiledónea o después de algún otro deja modificación del plugin.
Durante las pruebas plugin de LeafJ, encontramos la mayor parte de los 14 errores provenían de errores humanos, tales como colocar mal los resultados copiados en hojas de datos y / o el etiquetado incorrecto de los genotipos de las plantas. En raras ocasiones la frontera hoja peciolo / hoja se llamó incorrectamente, lo que exige la corrección manual y creando un riesgo adicional de errores de copiar y pegar. Hemos podido detectar este tipo de errores después de mirar los datos (a) por valores umbralización (por ejemplo, pecíolos más largos que la longitud de la hoja) y (b) al encontrar condiciones duplicado de la muestra (por ejemplo, "sol" o "sombra"), el genotipo o la posición de las hojas.
Nuestra pantalla táctil tablet método facilita la precisión y la velocidad de medición. Limitación de nuestro método es que la comunicación entre el ordenador principal y la tableta de la pantalla táctil se basa en la velocidad de la red inalámbrica de área local (LAN).
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
LeafJ fue escrito por JNM mientras estaba en su año sabático en el laboratorio de la Dra. Katherine Pollard en los Institutos Gladstone.
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencia (número de concesión IOS-0923752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
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