Summary
Demonstration av viktiga metoder för höga mätningar genomströmning blad. Dessa metoder kan användas för att accelerera löv fenotypning när man studerar många växt mutanter eller på annat plantor screening genom blad fenotyp.
Abstract
Hög genomströmning fenotypning (Phenomics) är ett kraftfullt verktyg för att länka gener till sina funktioner (se recension 1 och aktuella exempel 2-4). Bladen är den primära fotosyntes orgel, och deras storlek och form varierar utvecklingsmässigt och miljömässigt inom en anläggning. Av dessa skäl studier på blad morfologi kräver mätning av flera parametrar från många blad, vilket bäst utförs av halvautomatiska Phenomics verktyg 5,6. Canopy skugga är en viktig miljöfråga kö som påverkar växt arkitektur och livshistoria, den svit av svaren kollektivt kallas skuggan undvikande syndrom (SAS) 7. Bland SAS responser, skugga inducerad blad bladskaft töjning och förändringar i bladarea är speciellt användbara som index 8. Hittills kan bladform program (exempelvis formen 9, skivans 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) mäter blad konturer och kategorisera bladformer, Men kan inte mata bladskaft längd. Brist på storskaliga mätsystem Leaf bladskaft har hämmat Phenomics metoder för SAS forskning. I detta dokument beskriver vi en nyutvecklad ImageJ plugin som kallas LeafJ, som snabbt kan mäta bladskaft längd och blad parametrar blad av modellen Arabidopsis thaliana. För tillfällig blad som krävde manuell korrigering av bladskaftets / blad blad gräns använde vi en pekskärm tablett. Vidare, blad cellform och blad cellantal är viktiga faktorer för blad storlek 13. Separat från LeafJ presenterar vi också ett protokoll för att använda en pekskärm tablett för mätcell form, område och storlek. Vår blad drag mätsystem är inte begränsat till skugga undvikande forskning och kommer att påskynda blad fenotypning av många mutanter och växter screening med blad fenotypning.
Protocol
1. Växtmaterial
Observera att detta växters tillväxt protokoll är avsedd för detektering av svar skugga skatteundandragande. Du kan odla växter i din favorit kondition.
- Strö Arabidopsis thaliana frön på vatten indränkt filterpapper i 9 cm petriskålar och lagra (stratifiera) dem vid 4 ° C under fyra dagar i mörker.
- Överföra dessa Petriskålarna till simulerade sön villkor: 80-100 μE fotosyntetiskt aktiv strålning (PAR) och långt rött tillägg för att få R: FR förhållande till 1,86. Använd långa dagens förhållanden (16 timmar ljus / 8 timmar mörker) och konstant temperatur av 22 ° C. Inkubera i detta tillstånd under tre dagar för att tillåta frön att gro.
- Överför grodda frö till jord och hålla växter i stående sol. För storskaliga experiment rekommenderar vi förbereder små taggar för märkning varje växter med hjälp av data Koppla Manager i Microsoft Word 2004 (eller senare) för att göra etiketter.
- Elva dagar efter transfer till jord, flytta hälften av växterna att skugga skick: samma som solen men med extra långt rött ljus för att få R / FR förhållande till 0,52.
- Efter ytterligare tolv dagar, växterna är redo för blad avbildning. I detta skede de äldre bladen har fullt mognat medan yngre blad fortfarande expanderar, så att du kan fånga en ögonblicksbild av utvecklingen. Du kanske vill välja en annan utvecklings tid beroende på dina behov.
2. Fånga Dissekerade Leaf bilder
- Förbered öppenhet ark märkta med växt genotyp och tillväxt tillstånd med fem rektangulära ramar. En ram motsvarar bladen från en växt. Microsoft Excel kan användas för att skriva ut en konsekvent rutnät med etiketter.
- Dissekera blad av 26 dagar gamla växter.
- Scan avgår 600 dpi på en flatbäddsskanner. Observera att lämnar från en anläggning skall placeras vertikalt i ett svart fönster i en sandwich av transparenta ark. Undvik att röra lövtill en svart fönsterkarm och överlappande blad, vilket kommer att ge fel i följande procedurer.
3. Blad Bildanalys av LeafJ
- Ladda ner ImageJ Dra LeafJ.jar filen i plugins mappen ImageJ.
- Öppna en bildfil i ImageJ 1.45s eller senare 14.
- Dela upp bilden i tre färger kanaler (röd, grön och blå) med "Bild> Färg> Split Channels" och tillämpa tröskeln till bilden i den blå kanalen.
- Välj alla av bladen från en växt genom en rektangel verktyg (figur 1A).
- Välj "LeafJ" från plugin-menyn.
- Välj anteckning information för denna växt från dialogrutan som visas. Du kanredigera standardvärden som visas här genom att klicka på "redigera dessa alternativ".
- Efter att ha kört LeafJ plugin och innan du klickar på "OK", redigera spåras linjer från regionen av intresse (ROI) Manager (vid behov, Figur 1B). En touch-skärm tablett (såsom en iPad) är användbar för detta förfarande. iPads kan anslutas till en dator som en extern bildskärm med Air Display-programvara.
- Exportera mätresultat och tillhörande information (filnamn, blomningstid och skilj av, mätt, etc) till Microsoft Excel eller motsvarande program.
4. Leaf Cell Bildanalys i ImageJ
- Fix dissekerade lämnar som beskrivs i referens 15 efter skanning (steg 2). FAA fasta blad kan hållas i 4 ° C under minst 6 månader.
- Rensa bladen genom att ändra FAA fixativ till kloralhydratlösning och lämnar inkubera 1 ~ 2 tim innan mikroskopisk observation 15.
- Montera lämnar på mimikroskop glider med trichomes uppåt. Använda 40x förstoring på en förening mikroskop, avbilda mesophyll skiktet av centrum av varje blad på vardera sidan av den huvudsakliga venen, undviker celler nära trichomes eller vener.
- Trace blad cellen beskriver i ImageJ ROI Manager verktyg med hjälp av pekskärm tablett och en penna (som beskrivs i steg 3). Cell bildanalys används de inbyggda funktionerna i ImageJ men kräver inte LeafJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Leaf bilder som visar Uppskattningar av Bladskaft och Leaf Blade Boundary och deras mätfönster
En av de mest användbara funktionerna i LeafJ är automatiserad detektion av blad blad / bladskaft gränsen (Figur 1). Den LeafJ algoritmen fungerar på följande sätt: den inbyggda ImageJ ParticleAnalyzer funktionalitet används för att hitta och bestämma orienteringen av bladen inuti användarens val. För varje blad bredden på bladet bestäms längs bladet hela axel. Då ändringen i bredd vid varje position längs axeln bestäms med användning av en löpande fönster (den genomsnittliga bredden för de sju positioner proximalt fokalpositionen subtraheras från medelvärdet bredden för de sju positioner distalt fokalpositionen). Bladskaft / bladet gräns definieras som den första positionen bortom bladet basen där ändringen i bredd är större än 90% av alla beräknade bredd skillnader. LeafJ gör extra kontroller för att öka pålitlighethet med denna uppmaning, särskilt LeafJ kräver också att 1) bredden överskrider den smalaste 5% av positioner i längd (detta förhindrar avvikande samtal på bladskaft bas), 2) den region proximalt fokalpositionen inte har en stor förändring i bredd, och 3) bredd av blad 20% distalt fokalpositionen är minst 150% större än vid fokalpositionen (sant om fokalpositionen är gränsen eftersom 20% proximalt gränsen bör vara bladet och därför mycket bredare).
När LeafJ har definierat bladskaft / bladet gräns, inbyggd ImageJ klasser och metoder används för att bestämma bladets area, omkrets och cirkularitet. Inbyggd ImageJ metoder används också för att passa en ellips till bladet och för att beräkna de större och mindre axlar som ellips (används sedan som bladlängd och bredd). Bladskaft längd bestäms av en linje som spårar längs mitten av bladskaft området.
2. Detektering av Shade-inducerad Bladskaft Förlängning </ P>
Att fråga om LeafJ mätningar var användbar analys skugga undvikande, använde vi en blandad effekt modell med behandling och löv nummer som fasta effekter och upprepade som en slumpmässig effekt. Vi fann att bladskaft längd, bladarea, bladlängd, Klingbredd och bladskaft längd / bladlängd förhållande påverkades starkt av skugga behandling, medan bladet cirkularitet och bladet längd / blad bredd inte (p <0,05). Våra data visar att LeafJ plugin är användbar för studier på blad svar skugga undvikande (Figur 2).
3. Noggrannhet och hastighet LeafJ Plugin
För att bestämma prestanda LeafJ plugin i större datamängder jämförde vi drifttid och noggrannhet mellan manuell och mätningar plugin. För manuella mätningar vi definierat bladskaft / bladet gräns som den plats där bladet bredd verkade snabbt öka. Det tog en erfaren forskare i genomsnitt 1 9 min 3 sek för att mäta en insyn fem anläggningar (ca 50 blad) genom manuell mätning, medan med LeafJ det tog bara 3 min 20 sek. Genomsnitt över 5 OH, mätning med plugin var 5,7 gånger snabbare än manuell mätning. Den manuella mätningen gjordes av en forskare med erfarenhet av att göra många manuella mätningar, en nybörjare skulle vara betydligt långsammare på manuell mätning, vilket resulterar i en ännu större fördel av LeafJ. Vi bedömde noggrannhet genom att jämföra data från de två metoderna, uppgifterna starkt korrelerade till alla blad parametrar (Figur 3). Av de 3.532 datapunkter fanns 172 (4,9%) som visade stora skillnader mellan metoderna (framgår av att vara avvikande på sambandet tomter). Vi analyserade orsaken till dessa extremvärden. Av 172 extremvärden var 29 på grund av fel vid LeafJ plugin mätning och 143 berodde på fel i manuell mätning. Detta fel analys visade också noggrannhet plugin mätning.
jove_step "> 4. cellstorlek och cellantal MätningOberoende av LeafJ vi också utvecklat ett effektivt arbetsflöde för att mäta antalet celler och storlek. Teoretiskt celler antal och storlek kan användas för att klassificera muterade växter i nio kategorier jämfört med vildtyp, (1) mindre celler storlek med minskade cellantal, (2) mindre celler med normala cellantal, (3) mindre celler med ökad cell tal, (4) normala cellstorlek med minskade cellantalet, (5) normal cellstorlek med normala cellantal, (6) normala cellstorlek med minskade cellantalet, (7) större cellstorlek med minskade cellantalet, (8) större cellstorlek med normala cellantal, (9) större cellstorlek med ökat cellantal 15,16. Vi mätte parametrar blad cell i 67 genotyper av Arabidopsis thaliana med vår tablet-baserade cellstorlek och cellantal mätmetod. Mätte vi cellstorlek 8.629 celler från 877 blad 224 plantor. Multiplicera b celltäthety bladyta (mätt med LeafJ) uppskattade vi totala blad datacell nummer av 438 blad från 219 anläggningar. Vår analys placerade dessa genotyper i sex av de möjliga nio kategorier (F ig. 4). Den största kategorin var (5): normal cellstorlek och antal, näst största var (8): större cellstorlek med normal cellantal. Även uppföljningsarbete behövs, tyder detta på att vår tablett-baserade metoden kan användas för att kategorisera mutanter baserade på blad cellstorlek och antal.
Figur 1. Ett exempel på bladskaftets / blad blad gränsen detektering och användargränssnitt. Observera att LeafJ kan definiera bladskaft / löv blad gränsen automatiskt (Figur 1B). Klicka här för att se större figure.
Figur 2. LeafJ plugin kan upptäcka svar skugga undvikande i olika blad parametrar. Blad 3 till blad 6 från sju vildtyp växter (Arabidopsis thaliana Columbia ekotyp) under varje tillstånd (sol och skugga) undersöktes. Från uppe till vänster till nederst till höger, y-axeln enheter är mm, mm, mm, mm 2, förhållande bladskaft längd bladlängd, och förhållandet mellan bladets längd Klingbredd. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. LeafJ plugin är mycket exakt. CÄMFÖRELSETABELL av data från manuell mätning och LeafJ plugin mätning från 3532 datapunkter. Varje punkt representerar ett blad. Gröna prickar anger de 170 extremvärden i detta diagram. Axlar bladyta är mm 2 alla andra är mm. Siffror framför varje parameter representerar blad läge (dvs "3" är den tredje bladet).
Figur 4. Scatter plot av löv cellytan och blad mobilnummer bland 67 genotyper av Arabidopsis thaliana. Varje punkt representerar fenotyper av varje genotyp odlats under skugga tillstånd. Växter klassificerades i nio grupper baserat på deras skillnad från vildtyp (Col) såsom bestäms genom en linjär blandad modell effekter och flera tester korrigerad p-värden: (1) mindre cellstorlek med minskade cellantalet, (2) mindre cell storlek med normenal cellantal, (3) mindre cellstorlek med ökat cellantal, (4) normal cellstorlek med minskad cellantal, (5) normal cellstorlek med normala cellantal, (6) normala cellstorlek med minskad cellantal, (7 ) större cellstorlek med minskad cellantal, (8) större cellstorlek med normal cellantal, (9) större cellstorlek med ökad cellantal. "*" Indikerar att fenotypen av vildtyp (Col).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår "LeafJ" plugin möjliggör mätning av bladskaft längd halvautomatiskt, ökad genomströmning nästan 6 gånger manuell mätning. Bladskaft längd är en viktig index SAS och är också en milstolpe av andra fenomen, såsom nedsänkning motstånd och hyponastic tillväxt 17. Därför denna plugin kan vara användbar för ett brett spektrum av växt forskare.
Vår plugin är implementerad i en väletablerad java-baserad fri programvara, ImageJ. Detta gör det enkelt plattformsoberoende installation. Enkel modifiering av programmet är också en fördel med LeafJ plugin eftersom ImageJ redan har ett stort bibliotek av plugins som skrevs av Java och ImageJ makro språk ( http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : start ). Just nu vi testade bara Arabidopsis blad, men vår algoritm för bladskaftets / blad blad gräns upptäckt skulle kunna tillämpas tO Andra tvåhjärtbladiga lämnar efter viss modifiering av plugin.
Vid provning LeafJ plugin, fann vi de flesta av de 14 felen kom från mänskliga misstag som misplacing kopierade resultat på datablad och / eller mislabeling av vegetabiliska genotyper. I sällsynta fall bladskaft / blad blad gränsen kallades felaktigt, vilket kräver manuell korrigering och skapa ytterligare risk för kopiera och klistra in misstag. Vi kunde upptäcka sådana fel efter att ha tittat på data (A) genom tröskling värden (t.ex. bladskaft längre än löv längd) och (b) genom att hitta duplicerade prov tillstånd (t.ex. "sol" eller "skugga"), genotyp eller ställning blad.
Vår pekskärm tablett metod underlättade noggrannhet och hastighet för mätning. Begränsning av vår metod är att kommunikationen mellan huvuddator och pekskärmen tabletten beroende på hastigheten på det trådlösa lokala nätverk (LAN).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
LeafJ skrevs av JNM medan han var på sabbatsår i Dr Katherine Pollard labb på Gladstone Institutes.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Science Foundation (licensnummer IOS-0.923.752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
- Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
- Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
- Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
- Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570 (2012).
- Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
- Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157 (2012).
- Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
- Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
- Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82 (2008).
- Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
- Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
- Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
- Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
- Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).
