Summary
재현을 만드는 새로운 기술
Abstract
유전자 변형 생쥐의 사용은 척수 손상 (SCI) 등 여러 신경 질환을 기본 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 향상시킵니다. SCI의 열상 모델을 생산하는 데 사용되는 자유형 수동 제어는 종종 호감이나 타박상 구성 요소, 따라서 새로운 기술이 개발과 관련된 일관성 부상을 만듭니다. 자궁 경부 열상 SCI 우리의 모델) 척추면 고정, 2에 의해) 강화 된 척수 노출 자궁 경부 척추 안정화를 1 통합하여 자유 방법으로 고유의 어려움을 해결하고 있으며, 3) 척수의 재생 열상의 생성은 진동 블레이드를 사용하여 관련된 타박상없는 깊이 ± 0.01 mm의 정확도. 이러한 메스 나 가위 손 사용과 같은 SCI 열상을 만드는 표준 방법에 비해, 우리의 방법은 일관된 병변을 생산하고있다. 이 방법은 corticosp의 축삭 재생에 대한 연구에 유용원고 판, rubrospinal, 그리고 지느러미 오름차순 책자.
Introduction
유전자 변형 생쥐의 여부는 SCI의 메커니즘의 역할을 특정 유전자의 영향을 식별 할 수있는 강력한 도구입니다. 열상 SCI이 부상 8 다음과 효과적인 치료를 제공 할 수 있습니다 치료제 또는 분자를 검사하는 데 사용되는 중요한 모델입니다. 생쥐의 열상 부상의 작성 중에 극돌기 프로세스의 정착으로 인해 척추 고정하기 5-11 유지 보수와 관련된 얇고 깨지기 쉬운 가시가 프로세스를 파악에 어려움 부정확 할 수 있습니다. 0.2 mm (마우스 척수의 직경의 10 %)의 열상의 깊이의 변화는 데이터의 잘못된 해석됩니다. 척수 열상 병변의 성격과 범위는 정확하게 10 정의해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 척추 안정화로 구성된 새로운 기술을 개발하고 루이스 상해 시스템 장치에 연결 제조 블레이드를 사용했습니다 (LISA)의 열상 SCI 7,14를 생산. 이 부상은 열상 과정에서 조직의 변형을 피할 날카로운 진동 블레이드를 사용하여 만들어졌습니다. 열상의 깊이는 열상의 깊이를 제어하는 마이크로 드라이버를 사용하여 0.01 mm의 정확도로 정확하게이었다. 절단 블레이드 원하는 열상에게 등고선 9를 만들려면 특정 모양과 폭에 주문품 있습니다. 우리는 1) 경추 노출, 2의 방법) 양측면 고정 장치를 사용하여 척추 안정화 기술, 및 진동 블레이드를 사용하여 자궁 경부 열상 부상 3)의 생성을 보여줍니다.
Protocol
1. 척추 안정제 동물 준비 및 신청
마우스 자궁 경부 척추 ventrally 같은 측면보기에서 볼 오목이다. C3에서 T1의 극돌기 과정은 작고 부서지기 쉬운이며, 일반적으로 3,4 설명 된대로 따라서 척추 안정화에 적합하지 않습니다. 우리는 척추 안정화 측면면 고정을 수행하는 것이 좋습니다. 고정 장치는 측면 각면에 고정 마우스와 두 개의 조정 가능한 스테인리스 스틸 팔을 지원하는 U-모양의 금속 채널로 구성되어 있습니다. 이 대상 척추의 우수한 고정을 제공합니다. 척추 고정 후, 척추가 약간 척수의 더 나은 노출을 제공하기 위해 경추의 곡선을 평평하게 상승합니다.
- 집게, microscissors 2 쌍, 30 G 바늘, 봉합 바늘 홀더, 피부 클립, 그리고 클립 도포 2-3 페어가 다음과 같은 수술 도구를 소독. 척추 고정 장치를 소독. 마취케타민을 / Xylazine (100 ㎎ / 10 ㎎ / ㎏)의 복강 칵테일을 사용하여 마우스를 thetize. 마우스의 목에서 머리를 면도.
- 포비돈 - 요오드 용액과 70 % 알코올로 피부 클렌징 후, 가열 패드로 따뜻하게 운영 테이블 위에 마우스를 이동합니다. 각막 건조를 방지하기 위해 안과 연고와 동물의 눈을 커버.
- 마취 (마우스 꼬리 핀치에 응답하지 않을 때 도달)을 유도 한 후, 아래 경추의 피하 지방 패드에 후두부에서 경부 정중선의 피부 절개를합니다. 배율에서, C2에서 승모근 근육 사이의 중간 선 절개를 수행하고 semispinalis의 capitis 근육을 분할합니다. submuscular 지방 패드의 신분을 올바른 레이어의 박리를 용이하게합니다.
- 신뢰할 수있는 랜드 마크 역할을하는 T2 극돌기에 꼬리 쪽 정중선 근육 절개를 확장합니다. T2의 척추에 붙어있는 근육을 잘라 T2의 연골 부분을 제거극돌기.
- 마이크로 가위를 사용하여 T2 엽층을 통해 C2에서 paraspinal 근육을 해부하다. 근육의 해부는 가시가 프로세스에 인접한 시작 패싯 관절 양측 확장합니다. 출혈을 최소화하기 위해 가시가 프로세스와 엽층 (골막 층)에서 바로 옆 근육을 분리합니다. 측면 측면이 노출 된 후, LISA 단계의 U 형 채널에 마우스를 놓습니다.
- 양측 노출면 아래의 스테인레스 스틸 팔을 연결합니다. 팔 장소에 일단 척추를 고정화하는 강철 팔 나사를 조입니다. 이 대상 척추의 확고한 고정을 유지하고 우수한 노출을 제공합니다. 팔은 척추의 정확한 수평 방향을 제공하기 위해 조정할 수 있습니다.
- 경질의 기초가 노출 C5와 C6 사이의 인대 flavum을 절개. 층간 공간 사이 microscissors가에 배치되는을 통해 작은 durotomy을 만드는 30 G 바늘을 사용durotomy을 확장합니다. 척수는 이제 통제 열상 병변을받을 준비가되어 있습니다.
2. LISA 장치를 사용하여 자궁 경부 척수 열상
- 자궁 경부 척수 확대의 폭은 서로 다른 수준에서 다릅니다. 2.3 mm 플랫 블레이드를 사용하여 C5-6에서 지느러미 hemisection 병변을 확인하고 척수의 전체 폭을 커버하는 진동의 진폭을 설정합니다. 블레이드 파인 과학 도구 주식 회사 (포스터 시티, CA)에서 얻은 척수 열상 수정됩니다. 낮은 진폭 레벨이 코드 열상의 용이성을 감소하므로, ≥ 0.5 mm의 블레이드 진동의 진폭을 유지합니다.
- LISA 무대에서 척추 안정화와 마우스를 놓습니다. 잎은 운동의 세 가지 범위의 수 마이크로 드라이버에 의해 제어의 위치와 LISA에 부착되어 있습니다. LISA과 기능의 구성 요소는 그림 1에 설명되어 있습니다.
- 전원 블레이드 진동 스위치. magnif 이하노출 된 척수 진동 블레이드 바로 아래에 오도록 가스화, 마우스를 이동합니다.
- 진동 블레이드쪽으로 마우스를 지원하는 단계 상승. 날이 거의 척수의 등쪽 정맥 닿을 때 "0"위치가 기록됩니다. "0"위치를 기준으로 척수 열상의 깊이를 측정합니다.
- 마이크로 드라이버 컨트롤 무대 위치를 상승 : 마이크로 드라이버 손잡이의 360 ° 회전 0.25 mm로 무대에 올린다. 따라서, 0.75 mm 등의 hemisection 병변은 마이크로 드라이버 노브를 3 번을 돌려 만들어집니다. 병변의 정확도는 ± 0.01 mm입니다. 블레이드 척수를 괴롭히다하기 시작, 염분 관개와 수술 부위에 기름칠을. 척수의 절단 깊이는 수직 마이크로 드라이버에 의해 제어하고 시각적 인지도를 독립적입니다.
- 소정의 깊이에 도달하면 진동 스위치를 끄십시오. 이상적으로, 진동 블레이드 L에 위치조직 변형의 증거가없는 esion 격차. 절단 날의 무대를 낮추고면 Q - 팁을 사용하여 수술 부위의 혈액과 염분을 제거합니다. 지혈은 <1 분에서 자발적으로 발생합니다.
- 척추 고정 장치에서 마우스를 놓습니다. 6-0 실크 봉합사 및 피부를 닫를 사용하여 paraspinal 근육 대략적인 스테인리스 미셸 클립을 사용하여 상처.
3. 동물 관리
- 피하 의식을 회복하면서 적절한 수분을 유지하고 가열 패드에 복구 케이지에 마우스를 배치 식염수 1-2 ML의 총을 주입.
- 물과 부드러운 음식 애드립을 제공하는 48 시간 후 수술을 위해 진통제를 관리 할 수 있습니다. 척수의 등쪽 hemisection 다음 방광 치료에 대한 필요가 없습니다.
Representative Results
대상 척추의 고정은 마우스 척수의 정확한 병변을 생성하는 매우 중요합니다. 우리의 척추 안정화 장치는 짧은 가시가 프로세스와 마우스의 자궁 경부 척추의 복부 전만의 해부학 적 문제를 극복한다. 경추 잘 우리의 경추 안정제 (그림 2)를 사용하여 노출됩니다. 장치를 안정화 우리의 마우스 척추 경추 척수 절차 척추를 준비하는 신뢰할 수있는 기술입니다. LISA를 사용하여 병변의 깊이는 0.01 mm 6,13에 정확합니다. 정확한 열상은 병변 / 조직 인터페이스 (그림 3) 전혀 타박상가 발생하지 않습니다. 지느러미 hemisection 병변의 정밀도는 0.9 mm 깊은 열상 그냥 척수 1의 병적 인 부분에 의해 확인 각 시편의 중앙 운하를 넘어 확장되는 축삭 재생에 대한 연구에서 C57BL / 6 생쥐에서 증명되었다. 이 동물의 모든 운동은 회복이 척수 열상 부상을 다음과 에드.
그림 1. (A) LISA 스테이지에 배치 척추 안정에 마우스. 진동 잎은 찢어진되는 척수쪽으로 이동합니다. 마이크로 드라이버 컨트롤은 무대 아래에 위치하며 적절한 위치에 마우스를 위치하도록 설계되어 있습니다. 수직 마이크로 드라이버는 병변의 깊이를 제어하고 틸팅 노브는 열상의 만곡을 방지하기 위해 척수의 수평면을 제어합니다. 온 - 오프 스위치는 진동 모터를 제어하고, 다른 노브는 진폭을 조정합니다. (B) 0.75 mm 등의 hemisection 열상 병변은 그대로 층 아치 아래에 잘라.
그림 2. (A) U 형 채널과 두 개의 팔과 커넥터로 구성된 마우스 척추 안정. 마우스는 자궁 SCI에 사용되는 C 여물통과 흉부 SCI에 대한 T 저점에 배치됩니다. (B) 자궁 경부 척추는 측면 측면에서 팔을 배치 한 후 나사를 잠금으로써 집착합니다. 두라는 뼈의 제거없이 C5-6의 엽층, C6-7 및 C7-T1 사이 노출됩니다.
그림 3. 0.5의 깊이, 0.8, 1.1 및 시상 뷰 (얼룩 크레 실 바이올렛과 에오신)에서 관찰 1.4 mm 네 개의 지느러미 척수 열상이 기술을 사용하여 정밀도 높은 수준을 묘사.
Discussion
척수 열상 부상 이전에 척추 안정화 극돌기 프로세스의 고정에 의해 획득되었다. 마우스 T1을 통해 C3에서 부서지기 쉬운 짧은 자궁 경부 추간판 프로세스 클램프의 경추 전만 곡선과 첨부 파일 모두 효과적인 척추 안정화를 방지합니다. 또한, 수동 제어 병변 6의 깊이에 변화를 만드는 중요한 조직의 변형을 일으키는 원인에 따라 활용 면도날이나 microscissors의 사용. 이 특정 경로의 축삭 재생을 연구, 특히 데이터의 오해로 이어질 수 있습니다. 지느러미 피질 기관이 완전히 lesioning시 그었되지 않은 경우 예를 들어, 절약 등의 피질 축삭이 재생 축삭으로 해석 될 수있다. 이러한 문제는 단일 레벨과 척수의 정확한 lesioning의 측면에 고정으로 척추 안정화 장치를 사용하여 극복 할 수 있습니다. 또한, 아를 사용하여고등학교의 주파수 진동 블레이드 인접한 척수를 분쇄하거나 contusing없이 선명한 열상을 생산하고 있습니다. 이 방법은 마우스 6 흉부 척수 열상을 생산 이후의 변경으로, 쥐 9,12,14에서 척수 열상 부상을 생산하는 데 사용되었습니다. 현재의 통신에서, 우리는 마우스 신뢰할 수있는 자궁 경부 열상 병변을 만드는 방법을 설명합니다.
척수의 전후 직경이 마우스 <2mm입니다 경우에 한해, 열상 병변의 정확한 깊이는 신뢰할 수있는 실험 모델을 만드는 데 중요합니다. 병변의 깊이 최소한의 변화가 크게 축삭의 재생뿐만 아니라 부피 및 행동 연구를 평가하는 실험의 결과를 변경합니다. 우리는 절단 날의 위치를 제어하는 높은 정밀도 마이크로 드라이버를 사용하기 때문에이 방법을 사용하여 병변 깊이의 정확도는 ± 0.01 mm입니다. 이 방법의 불일치를 감소시켰다열상 SCI를 만드는 다른 모델 herent. 이 방법은 피질 기관, rubrospinal 기관, 그리고 지느러미 오름차순 기관으로 척수의 등쪽 반에있는 긴 척수 경로의 축삭 재생을 공부에 특히 유용합니다. 이 방법으로,이 섬유 책자 완전히이고 안정적으로 그었 수 있습니다. 이러한 관점에서, 데이터 해석의 오류가함으로써 SCI에 대한 실험 연구의보고의 신뢰성을 향상 최소화됩니다.
요약하면, 우리는 마우스 자궁 경부 척수 열상 손상의 생체 모델의 재현을 만드는 새로운 기술을 설명했습니다. 이 기술은 진동 블레이드를 사용하여 척수의 경부 측면과 열상의 고정으로 척추 안정화를 기반으로합니다. 마우스 6 등의 흉부 척수 열상 모델에서이 방법을 사용하여, 우리는 열상 깊이, 조직학 및 간 긴밀한 상관 관계를 보여행동 복구 할 수 있습니다. 이러한 기술은 다른 여러 실험실 2,12으로 신뢰할 수 발견되었습니다.
Disclosures
- 여러 저자 (YPZ, XMX, CBS) 루이스 빌 임팩터 시스템, 주식 회사에 재무 적 이해 관계를 가질
- 저자 이순신 핑 장, 리사 방패, 크리스토퍼 B. 방패, 노턴 의료, 루이스 빌, 켄터키의 직원입니다. 다른 저자는 인디애나 대학, 인디애나 폴리스, 인디애나에 의해 고용됩니다.
- 저자는이 문서에서 활용 시약 또는기구를 생산하는 회사로부터 자금 지원을받지 못했다.
Acknowledgments
이 장치의 개발은 LISA (주), 루이스 빌, 켄터키에 의해 지원되었다. 우리는 또한 노턴 의료, 루이스 빌, CBS에 KY, 그리고 NIH NS050243, NS052290 및 XMX에 NS059622의 지속적인 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
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| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
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