Summary
再現性を作成するための新たな手法
Abstract
遺伝子改変マウスの使用は、脊髄損傷（SCI）など、いくつかの神経疾患の根底にある分子機構の理解を向上させます。 SCIの裂傷モデルを生成するために使用されるフリーハンド手動制御は、多くの場合、クラッシュまたは挫傷コンポーネントと、それゆえ、新しい技術が開発されたものに関連付けられている一貫性のない怪我を作成します。我々の子宮頸部裂傷SCIのモデル1を組み込むことにより、フリーハンド方式に固有の困難を解決した）椎骨ファセット固定によって頚椎安定化、2）強化された脊髄露出、と振動ブレードを使用して脊髄の再現可能な裂傷の3）の作成関連する挫傷せず、深さ±0.01ミリメートルの精度。このようなメスやはさみのフリーハンドの使用などのSCI裂傷を作成する標準的な方法に比べて、我々の手法は、一貫した病変を生産している。このメソッドはcorticospの軸索再生の研究に有用ですinal、赤核脊髄、そして背昇順広大。
Introduction
遺伝子改変マウスの可用性は、SCIのメカニズムの役割を果たす特定の遺伝子の影響を識別するための強力なツールです。裂傷SCIこれは損傷8以下の効果的な治療を提供することができる治療薬または分子を調べるために使用される重要なモデルである。マウスで裂傷の傷害の作成 時に棘突起の固定が原因で脊椎固定5,11の維持に関与して薄くて壊れやすい棘突起を把握するのが困難に不正確である。わずか0.2ミリメートル（マウス脊髄の直径の10％）の裂傷の深さのばらつきは、データの解釈を誤解を招く原因となる。脊髄裂傷病変の性質と程度を正確に10を定義する必要があります。この課題に対処するため、我々は、椎安定からなる新規技術を開発し、ルイビル傷害システム装置に接続されている製作のブレードを使用している（LISA）が裂傷SCI 7,14を生成する。この損傷は、裂傷プロセスの間、組織の変形を回避鋭い振動ブレードを使用して作成された。裂傷の深さは、裂傷の深さを制御するマイクロドライバを使用して0.01ミリメートルの精度に精密だった。カッティングブレードは希望裂傷輪郭9を作成するには 、特定の形状や幅に、カスタムメイドされています。我々は、1）頚椎露光、2の方法）両側性ファセット固定装置を用いて椎安定化する技術、及び振動ブレードを用いて子宮頸部裂傷損傷の3）の作成を示す。
Protocol
1。背骨スタビライザーの動物の準備とアプリケーション
マウス頸椎は、側面から見た腹凹である。 C3からT1への棘突起は小さく砕けており、一般的に3,4に記載されているようしたがって、脊椎の安定化には 適していません。私たちは、脊椎安定化横ファセット固定によって実行されることをお勧めします。固定装置は、横方向に各ファセットにクランプマウスと2つの調整ステンレス製のアームを支持するU字状の金属チャンネルから構成される。これは、ターゲットの椎骨の優れた固定化を提供します。脊椎固定した後、脊椎が若干脊髄のより良好な露光を提供するために、頸椎湾曲を平坦化するために上昇する。
- 鉗子、microscissorsの2組、30 G針、縫合糸と針ホルダー、皮膚クリップ、クリップアプリケーターの2-3ペア次手術器具を滅菌する。脊椎安定剤を消毒。 Anesケタミン/キシラジン（100ミリグラム/ 10 mg / kg）を腹腔内のカクテルを使用して、マウスをthetize。マウスの首から毛を剃る。
- ポビドンヨード液を、70％アルコールで皮膚洗浄した後、加熱パッドを温め手術台の上にマウスを移動します。角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏と動物の目をカバーしています。
- 麻酔導入（マウステールピンチに応答しない場合に到達）した後、後頭部から下頚椎の皮下脂肪·パッドに後頸部正中皮膚切開を行います。倍率で、C2で僧帽筋の間に正中切開を行い、頭半棘筋の筋肉を分割。筋肉下の脂肪パッドの識別は正しい層に解剖を容易にします。
- 信頼性のあるランドマークとして機能T2棘突起に尾側正中筋肉解剖を拡張します。 T2の椎骨に付着筋肉をカットし、T2の軟骨部分を除去棘突起。
- マイクロはさみのペアを使用してT2薄層を通してC2から傍脊柱筋群を解剖。筋肉解剖は棘突起に隣接始まり、椎間関節に両側及ぶ。出血を最小限に抑えるために棘突起とラミナ（骨膜層内）に直接隣接する筋肉を分離する。ラテラルファセットが露出された後、LISA段のU字型チャネル上にマウスを置きます。
- 両側の面の下にさらさステンレスアームを取り付けます。腕が所定の位置にしたら、背骨を固定する鋼アームのつまみネジを締めます。これは、ターゲットの椎骨をしっかり固定を維持し、優れた露出を提供しています。アームは、脊椎の正確な水平配向を提供するように調整することができる。
- 硬膜の基礎となる公開するC5とC6の間に黄色靱帯を切開。層間空間との間、microscissorsがに配置されるときに通過する小durotomyを作成するために30 G針を使用durotomyを拡張します。脊髄は、現在制御された病変裂傷を受けるように調製される。
2。 LISAデバイスを使用した子宮頸脊髄裂傷
- 頸髄拡大の幅が異なるレベルに変化する。 2.3ミリメートルフラットブレードを使用してC5-6で背片側切断病変を作り、脊髄の幅全体をカバーするために振動の振幅を設定します。ブレードはファイン科学ツール社（フォスターシティ、カリフォルニア州）から入手し、脊髄の裂傷のために変更されています。低い振幅レベルがコード裂傷のしやすさを減少するように、≥0.5ミリメートルでブレード振動の振幅を維持します。
- LISAの舞台で背骨の安定やマウスを置きます。ブレードは運動の3つの範囲が可能なマイクロドライバにより制御される地位にLISAに取り付けられている。 LISAとその機能の構成要素は、 図1に記載されている。
- 電源にあるブレード·振動スイッチを。のmagnif下icationは、露出した脊髄を振動刃の直下に配置されるようにマウスを移動します。
- 振動ブレードに向かってマウスをサポートしている段階に昇格。ブレードはかろうじて脊髄の背静脈に触れたときに "0"の位置が記録される。 "0"の位置に相対的な脊髄裂傷の深さを測定します。
- マイクロドライバ制御によるステージ位置を高める：マイクロドライバーノブの360°ターンは0.25ミリメートルでのステージを高めます。従って、0.75ミリメートル背側片側切断損傷部は、マイクロ·ドライバー·ノブを3回回すことによって作成される。病変の精度は±0.01 mmである。ブレードが脊髄を裂くし始めると、生理食塩水灌漑で手術野に注油してください。脊髄の切り込み深さは、縦マイクロドライバによって制御され、視覚的な指導とは無関係です。
- 所定の深さに達すると、振動スイッチをオフにしてください。理想的には、揺動刃リットルに配置されている組織変形の証拠なしesionギャップ。切刃から段階を下げ、綿綿棒を使用して術野からの血液や生理食塩水を削除します。止血には、<1分で自然に発生します。
- 脊椎スタビライザーからマウスを離します。おおよそ6-0絹縫合糸を使用した傍脊柱筋とステンレスミシェルクリップを使用して皮膚創傷を閉じます。
3。アニマルケア
- 皮下に十分な水分補給を維持し、意識を取り戻しつつ加熱パッドに回復ケージにマウスを置いて1〜2ミリリットルの生理食塩水の合計を注入。
- 水や柔らかい食品アドリブを提供し、術後48時間鎮痛薬を投与する。脊髄の背側片側切断後の膀胱心配する必要はない。
Representative Results
ターゲット椎骨の固定化は、マウス脊髄の正確な病変を生成する際に非常に重要である。我々の脊椎安定化装置は、短い棘突起とマウス頸椎の腹側前弯の解剖学的な問題を克服する。頸椎は、我々頸椎安定します（ 図2）を使用して公開されます。我々のマウスの脊椎安定化装置は、頸髄手順については、背骨を製造するための信頼できる技術である。 LISAを使用して病変の深さは0.01ミリメートル6,13に正確です。正確な裂傷は、病変/組織インターフェース（ 図3）全く挫傷を引き起こしません。背片側切断病変の精度が0.9ミリメートル深い裂傷がちょうど脊髄1の病理セクションによって確認各標本における中央運河を超えて拡張する軸索再生に関する研究にC57BL / 6マウスで実証された。これらの動物のすべての歩行を回復この脊髄裂傷損傷後のED。
図1（A）LISAステージに載置された脊椎安定化剤でマウス。振動ブレードが引き裂かれる脊髄に向けられている。微小駆動制御は、ステージの下に配置され、適切な部位でマウスを位置決めするように設計されている。垂直マイクロドライバが病変の深さを制御し、チルトノブが裂傷の角度を防ぐために脊髄の水平面を制御する。オン·オフスイッチは、振動モータを制御し、別のノブは、その振幅を調整します（B）0.75ミリメートル背片側切断の裂傷病変が完全に層のアーチの下にカット。
図2。 >（A）U字型チャネルと両腕とコネクタで構成され、マウスの脊椎スタビライザー。マウスは子宮頸部SCIに使用Cトラフや胸部SCIのためのTトラフに配置されます（B）頸椎がラテラルファセットの下に腕を置いた後、親指のネジをロックすることによって固定されています。硬膜、骨のいずれかの取り外しなしC5-6のラミナ、C6-7、およびC7-T1の間に露出されています。
図3 0.5の深さ、0.8、1.1、および矢状ビュー（シミクレ紫とエオシン）で観察された1.4ミリメートルで4背側脊髄裂傷は、この手法を用いた高精度を描いた。
Discussion
脊髄への裂傷の傷害の前に椎安定化が棘突起の固定によって得られた。マウスのT1を通してC3から砕けやすい短い頚椎棘突起へのクランプの頸椎前湾カーブと添付ファイルの両方が効果的な脊椎安定化を防ぐ。さらに、手動制御の下で利用カミソリの刃やmicroscissorsの使用は6病変の深さの変動を作成する重要な組織の変形を引き起こす。これは、特定の経路の軸索再生が研究され、特にデータの誤った解釈につながる可能性があります。背側皮質脊髄路が完全lesioning時に離断されていない場合、例えば、免れる背側皮質軸索が再生軸索として誤解されることがあります。これらの課題は、単一レベルおよび脊髄の正確なlesioningにおけるファセットに固定するとともに脊椎安定化装置を使用することによって克服することができる。また、ああを使用IGHの周波数振動ブレードは、隣接脊髄を粉砕またはcontusingなし鋭い裂傷を生成します。この方法は、マウス6の胸部脊髄裂傷を生成するための後続の修正を、ラット9,12,14における脊髄裂傷の傷害を生成するために使用されている。本通信では、マウスにおける信頼性子宮頸部病変裂傷を作成する方法を説明する。
脊髄の前後径は、マウスで<2mmである限り、裂傷病変の正確な深さは信頼性のある実験モデルを作成する上で不可欠です。病変の深さの最小の変動性が大きく軸索再生と同様に、体積や行動の研究を評価する実験の結果を変更します。我々は、切断ブレードの位置を制御する高精度のマイクロドライバを使用したため、この方法を用いて病変部の深さの精度は±0.01 mmである。この方法はで矛盾を減少している裂傷SCIを作成する他のモデルでエラン。この方法は、このような皮質脊髄路、赤核脊髄路、および背側大動脈路として脊髄の背側半分に位置し、長い脊髄経路の軸索再生の研究に特に便利です。この方法では、これらの繊維路が完全かつ確実に切開することができる。この点において、データの解釈の誤差することにより、SCIに関する実験的研究の報告の信頼性を向上させる、最小限に抑えられる。
要約すると、我々は、マウスにおける頸髄裂傷の傷害のin vivoモデルにおいて再現を作成するための新規な技術を記載している。この手法は、振動ブレードを使用して脊髄の子宮頸部の側面と裂傷の固定により、脊椎安定化に基づいています。マウス6の背側胸部脊髄裂傷モデルでは、このメソッドを使用して、我々は裂傷の深さ、組織型との間に緊密な相関関係を示した、と行動回復。そのような技術はまた、いくつかの他の研究室2,12によって信頼性があることが見出されている。
Disclosures
- いくつかの著者は（YPZ、XMX、CBS）ルイビルインパクシステム株式会社の金融関心を持っている
- 著者、李平張、リサBEシールズ、そしてクリストファーB.シールズは、ノートンヘルスケア、ルイビル、ケンタッキー州の従業員です。他の著者は、IN、インディアナ大学、インディアナ州で採用されています。
- 著者は、この記事で利用試薬や楽器を生産する会社からの資金を受け取りませんでした。
Acknowledgments
このデバイスの開発はLISA㈱、ルイビル、ケンタッキー州によってサポートされていました。またXMXにCBS、およびNIH NS050243、NS052290、そしてNS059622に、ノートンのヘルスケアの継続的なサポートを認めるルイビル、ケンタッキー州。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
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| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
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