Summary
Una nueva técnica para crear un reproducibles
Abstract
El uso de ratones modificados genéticamente mejora nuestra comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a varios trastornos neurológicos tales como una lesión de la médula espinal (SCI). Control manual Freehand utilizado para producir un modelo de laceración del SCI crea lesiones incompatibles con frecuencia asociados con un flechazo o contusión de los componentes y, por lo tanto, se ha desarrollado una nueva técnica. Nuestro modelo de cuello uterino laceración SCI ha resuelto las dificultades inherentes con el método de pulso mediante la incorporación de 1) la estabilización vertebral cervical faceta por la fijación vertebral, 2) una mayor exposición a la médula espinal, y 3) la creación de una laceración reproducible de la médula espinal usando una cuchilla oscilante con una precisión de ± 0,01 mm de profundidad sin contusión asociada. En comparación con los métodos estándar de la creación de una laceración SCI tales como el uso a mano alzada de un bisturí o unas tijeras, nuestro método ha producido una lesión consistente. Este método es útil para estudios sobre la regeneración axonal de corticospinal, rubrospinal y tractos ascendentes dorsales.
Introduction
La disponibilidad de ratones modificados genéticamente es una poderosa herramienta para identificar los efectos de los genes específicos que juegan un papel en los mecanismos de SCI. Laceración SCI es un modelo importante para examinar agentes terapéuticos o moléculas que pueden proporcionar un tratamiento eficaz después de esta lesión 8. Fijación de las apófisis espinosas durante la creación de la lesión laceración en ratones es impreciso debido a la dificultad para comprender las apófisis espinosas delgadas y frágiles implicados con el mantenimiento de fijación espinal 5,11. La variabilidad en la profundidad de la laceración de sólo 0,2 mm (10% del diámetro de la médula espinal de ratón) hace que la interpretación errónea de los datos. La naturaleza y extensión de la lesión de la médula espinal laceración deben definirse con precisión 10. Para hacer frente a este desafío, hemos desarrollado una nueva técnica que consiste en la estabilización vertebral y se utiliza cuchillas fijadas al Lesiones Aparato Sistema de Louisville (LISA) para producir una laceración SCI 7,14. Esta lesión se creó utilizando una cuchilla oscilante fuerte que evita la deformación del tejido durante el proceso de laceración. La profundidad de la laceración era precisa con una exactitud de 0,01 mm mediante el uso de micro-controladores que controlan la profundidad de laceración. Cuchillas de corte están hechos a medida de las formas y anchos específicos para crear la laceración deseado contorno 9. Demostramos 1) el método de exposición columna cervical, 2) la técnica de estabilización vertebral utilizando un dispositivo de fijación bilateral de faceta, y 3) la creación de una lesión en la laceración cervical utilizando una cuchilla vibrante.
Protocol
1. Preparación de los animales y la aplicación del estabilizador de la columna vertebral
El ratón de la columna cervical es cóncava ventralmente como se ve desde la vista lateral. Las apófisis espinosas de C3 a T1 son pequeñas y friable y, por lo tanto, no son adecuados para la estabilización vertebral comúnmente descrito como 3,4. Recomendamos estabilización de la columna se realizó mediante fijación faceta lateral. El dispositivo de fijación consiste en un canal de metal en forma de U para soportar el ratón y dos brazos ajustables de acero inoxidable que la abrazadera a cada faceta lateralmente. Esto proporciona una excelente inmovilización de la vértebra de destino. Después de la fijación espinal, la columna vertebral está ligeramente elevado para aplanar la curvatura de la columna cervical para proporcionar una mejor exposición de la médula espinal.
- Esterilizar los siguientes instrumentos quirúrgicos: 2-3 pares de pinzas, 2 pares de micro tijeras, un soporte 30 G aguja, sutura y agujas, clips de la piel y del aplicador del clip. Desinfectar el estabilizador de la columna vertebral. Anesthetize el ratón usando un cóctel intraperitoneal de ketamina / xilazina (100 mg / 10 mg / kg). Afeitar el pelo del cuello del ratón.
- Después de limpiar la piel con una solución de povidona yodada y alcohol al 70%, mueva el ratón sobre la mesa de operaciones calentado con una almohadilla térmica. Cubra los ojos del animal con pomada oftálmica para prevenir la sequedad de la córnea.
- Después de la inducción de la anestesia (alcanzado cuando el ratón no responde a una pizca de cola), haga una línea media incisión cervical posterior del occipucio a la grasa subcutánea-pad de la columna cervical inferior. En ampliación, realice una incisión entre los músculos trapecio en C2 y dividir los músculos semiespinoso de la cabeza. Identificación de la almohadilla de grasa submuscular facilita la disección en la capa correcta.
- Extender la disección muscular línea media caudalmente a la apófisis espinosa T2, el cual sirve como un punto de referencia fiable. Cortar los músculos vinculados a la vértebra T2 y quitar la parte cartilaginosa de la T2apófisis espinosa.
- Diseccionar los músculos paraespinales de la C2 a través de las láminas T2 utilizando un par de micro-tijeras. La disección del músculo comienza adyacente a las apófisis espinosas y se extiende bilateralmente a las articulaciones facetarias. Separar los músculos inmediatamente adyacentes a las apófisis espinosas y las láminas (en la capa perióstica) para minimizar el sangrado. Después de las facetas laterales están expuestos, coloque el puntero del ratón sobre el canal en forma de U de la etapa de LISA.
- Coloque los brazos de acero inoxidable debajo de las caras expuestas bilateralmente. Una vez que los brazos están en su lugar, apriete los tornillos de los brazos de acero para inmovilizar la columna. Esto mantiene firme fijación de la vértebra destino y proporciona una excelente exposición. Los brazos pueden ajustarse para proporcionar la orientación horizontal exacta de la columna vertebral.
- Incisión en el ligamento amarillo entre C5 y C6 exponer subyace dura. Entre el espacio interlaminar, utilizar una aguja de 30 G para crear una pequeña durotomía través de la cual micro tijeras se colocan aampliar el durotomía. La médula espinal está dispuesto a someterse a la lesión desgarro controlado.
2. Laceración cervical de la médula espinal Uso del dispositivo LISA
- La anchura de la ampliación de la médula espinal cervical varía en los diferentes niveles. Hacer una lesión de hemisección dorsal en C5-6 utilizando una cuchilla plana de 2,3 mm y ajustar la amplitud de la vibración para cubrir toda la anchura de la médula espinal. Las cuchillas se obtuvieron a partir de Bellas Ciencia Tools Inc. (Foster City, CA) y modificar para laceración de la médula espinal. Mantener la amplitud de la oscilación de la cuchilla en ≥ 0,5 mm, como los niveles de amplitud más bajas disminuirán la facilidad de laceración espinal.
- Coloque el estabilizador de la columna vertebral y el ratón en el escenario LISA. La cuchilla está unido a la LISA con su posición controlada por micro-controladores capaces de tres rangos de movimiento. Componentes de la Lisa y sus funciones se describen en la Figura 1.
- Encienda el interruptor de cuchilla vibrante sucesivamente. Bajo magnifmedicación, mueva el ratón para que la médula espinal expuesta se coloca directamente debajo de la cuchilla vibrante.
- Eleve la plataforma de soporte el ratón hacia la cuchilla oscilante. La posición "0" se registra cuando la hoja apenas toca la vena dorsal de la médula espinal. Medir la profundidad de la laceración de la médula espinal en relación con la posición "0".
- Elevar la posición de fase de control micro-controlador: un giro de 360 º de la perilla micro-controlador eleva la etapa en 0,25 mm. Por lo tanto, una lesión de hemisección dorsal mm 0,75 se crea girando el botón de micro-controlador 3 veces. La precisión de la lesión es de ± 0,01 mm. A medida que la hoja empieza a lacerar la médula espinal, lubricar el campo quirúrgico con irrigación salina. La profundidad de corte de la médula espinal es controlado por el micro-controlador vertical y es independiente de la orientación visual.
- Una vez que se ha alcanzado la profundidad predeterminada, gire el interruptor de vibración fuera. Idealmente, la hoja oscilante se coloca en el lbrecha Esion sin evidencia de deformación del tejido. Baje la etapa de la cuchilla de corte y quitar la sangre y solución salina del campo quirúrgico con algodón Q-tips. La hemostasia se produce espontáneamente en <1 min.
- Suelte el botón del estabilizador de la columna vertebral. Aproximados de los músculos paravertebrales con sutura de seda 6-0 y cerrar la piel herida con clips de acero inoxidable Michel.
3. Cuidado de Animales
- Por vía subcutánea inyectar un total de 1-2 ml de solución salina para mantener una hidratación adecuada y coloque el puntero del ratón en la jaula de recuperación en una almohadilla eléctrica, mientras que la recuperación de la conciencia.
- Proporcionar agua y alimentos blandos ad lib y administrar analgésicos durante 48 horas después de la operación. No hay necesidad para el cuidado de la vejiga después de la hemisección dorsal de la médula espinal.
Representative Results
Inmovilización de la vértebra objetivo es de gran importancia en la generación de lesiones precisas de la médula espinal de ratón. Nuestro dispositivo de estabilización de la columna supera las cuestiones anatómicas de apófisis espinosas cortas y lordosis ventral del ratón de la columna cervical. Las vértebras cervicales son bien expuesta con nuestra columna vertebral estabilizador cervical (Figura 2). Nuestra columna vertebral del ratón dispositivo de estabilización es una técnica fiable para preparar la columna vertebral de los procedimientos de la médula espinal cervical. La profundidad de la lesión usando el LISA tiene una precisión de 0,01 mm 6,13. La laceración precisa no causa contusión en la interfaz de lesión / tejido (Figura 3). La precisión de las lesiones hemisección dorsal se demostró en ratones C57BL / 6 en un estudio sobre la regeneración axonal en el que una profunda laceración 0,9 mm extiende justo más allá del canal central en cada muestra confirmada por secciones patológicas de la médula espinal 1. Locomoción de todos estos animales se recuperaned después de esta lesión laceración de la médula espinal.
Figura 1. (A) El ratón en el estabilizador de la columna vertebral colocado en la etapa de LISA. La cuchilla vibrante se dirige hacia la médula espinal a ser desgarrado. Controles Micro-controladores están ubicados debajo del escenario y están diseñados para posicionar el ratón en el lugar apropiado. El micro-controlador verticales controla la profundidad de la lesión, y el mando de inclinación controla el plano horizontal de la médula espinal para prevenir la angulación de la laceración. El interruptor de encendido y apagado controla el motor de vibración, y otro mando ajusta su amplitud. (B) A mm dorsal lesión laceración 0.75 hemisección corte bajo arcos laminares intactos.
Figura 2. (A) El estabilizador de la columna vertebral del ratón que consiste en un canal en forma de U y dos brazos y los conectores. El ratón se coloca en el canal C se utiliza para SCI cervical y en el canal T para SCI torácica. (B) La columna cervical se fija mediante la colocación de los brazos por debajo de las facetas laterales y a continuación, el bloqueo de los tornillos de mariposa. La duramadre está expuesto entre las láminas de C5-6, arilo C6-7, y C7-T1 sin la extracción del hueso.
Figura 3. Cuatro laceraciones dorsales de la médula espinal a profundidades de 0,5, 0,8, 1,1, y 1,4 mm observados en la vista sagital (cresil-violeta y eosina) que representa el alto grado de precisión usando esta técnica.
Discussion
Estabilización vertebral antes de la laceración lesiones a la médula espinal se ha obtenido por la fijación de las apófisis espinosas. Tanto la curva de la columna cervical lordosis y la fijación de las abrazaderas de los movedizos cortos apófisis espinosas cervicales de C3 a T1 en el ratón impiden la estabilización de la columna vertebral eficaz. Además, el uso de una hoja de afeitar o micro tijeras utilizado bajo control manual provoca la deformación tisular significativa que crea variabilidad en la profundidad de la lesión 6. Esto puede conducir a la mala interpretación de los datos en particular cuando se estudia la regeneración axonal de las vías específicas. Por ejemplo, escatimado axones corticoespinales dorsales pueden ser mal interpretados como axones regenerados si el tracto corticoespinal dorsal no se secciona completamente en el momento de lesioning. Estos problemas se pueden superar mediante el uso de un dispositivo de estabilización de la columna con la fijación de las facetas a un solo nivel y lesioning precisa de la médula espinal. Además, el uso de ahcuchilla oscilante frecuencia igh produce un fuerte desgarro sin aplastar o contusing la vecina médula espinal. Este método ha sido utilizado para producir laceración lesiones de la médula espinal en ratas 9,12,14, con modificaciones posteriores para producir laceraciones de la médula espinal torácica en ratones 6. En la presente comunicación se describe el método de crear lesiones laceración cervical fiables en el ratón.
En la medida en el diámetro antero-posterior de la médula espinal es <2 mm en el ratón, profundidades precisas de la lesión laceración son de vital importancia en la creación de un modelo experimental fiable. Variabilidad mínima en la profundidad de la lesión va a alterar significativamente los resultados de los experimentos de evaluación de la regeneración de axones, así como estudios volumétricos y de comportamiento. La exactitud de la profundidad de la lesión utilizando este método es de ± 0,01 mm debido a que utiliza micro-controladores de alta precisión para controlar la posición de la cuchilla de corte. Este método ha reducido la falta de coherencia eninherente a otros modelos de la creación de una laceración SCI. Este método es particularmente útil en el estudio de la regeneración axonal de la larga médula espinal vías situado en la mitad dorsal de la médula espinal, tales como el tracto corticoespinal, el tracto rubroespinal y el tracto ascendente dorsal. Con este método, estos tractos de fibras pueden ser completamente fiable y seccionado. A este respecto, los errores de interpretación de los datos se reducen al mínimo, lo que mejora la fiabilidad de la presentación de informes de los estudios experimentales en SCI.
En resumen, hemos descrito una nueva técnica para crear un reproducibles en el modelo in vivo de lesión espinal laceración espinal cervical en el ratón. Esta técnica se basa en la estabilización de la columna por la fijación de las facetas cervicales y laceración de la médula espinal utilizando una cuchilla oscilante. El uso de este método en un modelo de laceración dorsal de la médula espinal torácica en ratones 6, hemos demostrado una estrecha correlación entre la profundidad de laceración, histología, yrecuperación de comportamiento. Esta técnica también se ha encontrado para ser fiable por varios otros laboratorios de 2,12.
Disclosures
- Varios autores (YPZ, XMX, CBS) tienen un interés financiero en el Louisville Impactor System, Inc.
- Los autores, Yi Ping Zhang, Lisa BE Shields y Christopher B. Escudos, son empleados de Norton Healthcare, Louisville, KY. Otros autores son empleados de la Universidad de Indiana, Indianapolis, IN.
- Los autores no recibieron financiación de cualquier empresa que producen reactivos o instrumentos utilizados en este artículo.
Acknowledgments
El desarrollo de este dispositivo fue apoyada por el LISA Co., Louisville, Kentucky. También reconocemos el apoyo continuo de Norton Healthcare, Louisville, KY a CBS y NIH NS050243, NS052290 y NS059622 a XMX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
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| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
