Summary
En ny teknikk for å skape en reproduserbar
Abstract
Anvendelse av genetisk modifiserte mus forbedrer forståelsen av molekylære mekanismene bak flere neurologiske forstyrrelser slik som en ryggmargsskade (SCI). Frihånd manuell kontroll som brukes til å produsere en rift modell av SCI skaper inkonsekvent skader som ofte forbindes med en klem eller contusion komponent, og derfor ble en ny metode utviklet. Vår modell av cervical sårskader SCI har løst iboende problemer med frihånd metode ved å innlemme en) cervical vertebral stabilisering av ryggvirvel fasett fiksering, 2) økt ryggmargen eksponering, og 3) etableringen av en reproduserbar laceration av ryggmargen med en oscillerende blad med en nøyaktighet på ± 0.01 mm i dybden uten assosiert contusion. Sammenlignet med standard metoder for å skape en SCI sårskader som frihånd bruk av en skalpell eller saks, har vår metode produsert en konsekvent lesjon. Denne metoden er nyttig for studier av aksonal regenerasjon av corticospinal, rubrospinal og rygg stigende traktater.
Introduction
Tilgjengeligheten av genmodifiserte mus er et kraftig verktøy for å kartlegge effekten av spesifikke gener som spiller en rolle i mekanismene for SCI. Sårskader SCI er en viktig modell brukes til å undersøke terapeutiske midler eller molekyler som kan gi effektiv behandling etter denne skaden åtte. Fiksering av spinous prosesser under etableringen av sårskader skader hos mus er upresis på grunn av vanskeligheter med å fatte de tynne og skjøre spinous prosesser som er involvert med å opprettholde spinal fiksering 5,11. Variasjon i dybden av sårskader på kun 0,2 mm (10% av diameteren av musen ryggmarg) fører misvisende tolkning av dataene. Typen og omfanget av ryggmargen sårskader lesjon må være presist definert 10. For å møte denne utfordringen, har vi utviklet en ny metode som består av ryggvirvel stabilisering og brukt fabrikkerte blader festet til Louisville Injury System Apparatus (LISA) for å produsere en laceration SCI 7,14. Denne skaden ble opprettet ved hjelp av en skarp oscillerende blad som unngikk vev deformasjon under sårskader prosessen. Dybden av sårskader var nøyaktig til en nøyaktighet på 0,01 mm ved hjelp av mikro-drivere som styrer sårskader dybde. Knivene er skreddersydd til bestemte former og bredder for å skape den ønskede laceration kontur ni. Vi demonstrerer 1) metoden for cervical spine eksponering, 2) teknikken for ryggvirvel stabilisering ved hjelp av en bilateral fasett fiksering enhet, og 3) etableringen av en cervical laceration skade ved hjelp av en vibrerende blad.
Protocol
En. Animal Forberedelse og bruk av Spine Stabilizer
Musen cervical spine er konkav ventrally sett fra lateral utsikt. Spinous prosesser fra C3 til T1 er små og pulver og derfor er ikke egnet for ryggvirvel stabilisering som ofte beskrives 3,4. Vi anbefaler at ryggraden stabilisering utføres av lateral fasett fiksering. Festeanordningen består av en U-formet metall-kanal for å støtte mus og to justerbare rustfrie armer som klemme til hver fasett lateralt. Dette gir utmerket immobilisering av mål-ryggvirvel. Etter spinal fiksering, er ryggraden litt forhøyet å flate nakkesøylen krumning for å gi bedre eksponering av ryggmargen.
- Steriliser følgende kirurgiske instrumenter: 2-3 par av tang, 2 par microscissors, en 30 G nål, sutur og nål holder, hud klipp og klippet applikator. Desinfiser ryggraden stabilisator. Anesthetize musen ved hjelp av en intraperitoneal cocktail av ketamin / xylazin (100 mg / 10 mg / kg). Barbere håret fra musen hals.
- Etter rensing av huden med en povidonjodid løsning og 70% alkohol, beveger musen på operasjonsbordet varmet med en varmepute. Dekke dyrets øyne med ophthalmic salve for å hindre hornhinnen tørking.
- Etter induksjon av anestesi (nådd når musen ikke reagerer på en hale klype), lage en posterior cervical midtlinjen hud innsnitt fra bakhodet til underhudsfett-pad av nedre cervical spine. Under forstørrelse, utføre en midtlinjesnitt mellom trapezius muskler på C2 og dele semispinalis capitis muskler. Identifikasjon av submuscular fett puten muliggjør disseksjon i riktig lag.
- Utvide midtlinjen muskel disseksjon caudally til T2 spinous prosess som fungerer som et pålitelig landemerke. Skjær muskler festet til T2 vertebra og fjerne brusk del av T2spinous prosess.
- Dissekere paraspinal muskler fra C2 gjennom T2 lamellene ved hjelp av et par av mikro-saks. Muscle disseksjon begynner ved siden av spinous prosesser og strekker bilateralt til fasett leddene. Separer musklene umiddelbart tilstøtende til spinous prosesser og lameller (i periosteal layer) for å minimere blødning. Etter den laterale fasetter er utsatt, plasserer du musen på U-formet kanal av LISA scenen.
- Fest rustfritt stål armene under de synlige fasetter bilateralt. Når armene er på plass, skru tommeskruene av stål armene for å bremse den ryggraden. Dette opprettholder fast fiksering av målet vertebra og gir god eksponering. Armene kan justeres for å gi presis horisontal orientering av ryggraden.
- Incise ligamentum flavum mellom C5 og C6 å avsløre underliggende dura. Mellom interlaminar plass, bruk en 30 G nål for å lage en liten durotomy gjennom hvilke microscissors er plassert tilforlenge durotomy. Ryggmarg er nå klar til å gjennomgå den kontrollerte sårskader lesjon.
2. Cervical Spinal Cord Laserasjon Bruke LISA Device
- Bredden på det cervikale ryggmargen utvidelse varierer på forskjellige nivåer. Lag en dorsal hemisection lesjon i C5-6 ved hjelp av en 2,3 mm flatt blad og sette vibrasjonsamplitude å dekke hele bredden av ryggmargen. Blades er hentet fra Fine Science Tools Inc. (Foster City, California) og modifisert for ryggmargen sårskader. Opprettholde amplitude av bladet pendling på ≥ 0,5 mm, som lavere amplitude nivåer vil redusere den enkle ledningen sårskader.
- Plasser ryggraden stabilisator og mus på LISA scenen. Bladet er festet til LISA med dens posisjon styres av mikroelementer som kan tre områder i bevegelse. Komponenter av LISA og deres funksjoner er beskrevet i figur 1.
- Makt bladet-vibrerende bryteren på. Under magnification, beveger musen slik at den eksponerte ryggmargen er plassert rett under den vibrerende blad.
- Heve scenen støtte musa mot den oscillerende blad. "0"-posisjon registreres når bladet knapt berører dorsal vene i ryggmargen. Måle dybden av ryggmargen sårskader i forhold til "0"-stilling.
- Heve scenen posisjon ved mikro-driver kontroll: en 360 graders sving av mikro-føreren rattet løfter scenen med 0,25 mm. Dermed er en 0,75 mm dorsal hemisection lesjon skapt ved å dreie knotten mikro-driveren 3 ganger. Nøyaktigheten av lesjon er ± 0.01 mm. Som bladet begynner å lage rift i ryggmargen, smøre det kirurgiske feltet med saltvann vanning. Den skjæredybde av ryggmargen er styrt av den vertikale mikro-driver og er uavhengig av visuell veiledning.
- Når viss dybde er nådd, slår den vibrerende avslåing. Ideelt sett er det oscillerende blad plassert i lesion gap uten tegn på vev deformasjon. Senk scenen fra klingen og fjerne blod og saltvann fra det kirurgiske feltet ved hjelp av bomull Q-tips. Hemostase oppstår spontant hos <1 min.
- Slipp musen fra ryggraden stabilisator. Omtrentlige de paraspinal muskler bruker 6-0 silke sutur og lukke huden sår ved hjelp av rustfrie Michel klipp.
3. Animal Care
- Subkutant injisere totalt 1-2 ml saltvann for å opprettholde adekvat hydrering og plassere musen i restitusjonsmerd på en varmepute mens gjenvinne bevissthet.
- Gir vann-og myk mat ad lib og administrere analgesi i 48 timer postoperativt. Det er ikke behov for blære omsorg etter dorsal hemisection av ryggmargen.
Representative Results
Immobilisering av målet vertebra er av stor betydning for å generere nøyaktige lesjoner i mus ryggmargen. Vår ryggraden stabilisering enheten overvinner de anatomiske utgaver av korte spinous prosesser og ventral lordosis av musen cervical ryggraden. Cervical ryggvirvlene er godt eksponert ved hjelp av vårt cervical spine stabilisator (figur 2). Vår mus ryggraden stabilisere enheten er en pålitelig teknikk for å forberede ryggraden for cervical ryggmargen prosedyrer. Dybden av lesjon hjelp av LISA har en nøyaktighet på 0,01 mm 6,13. Den nøyaktige sårskader forårsaker ingen kontusjon på lesjon / vev-grensesnitt (figur 3). Presisjonen av dorsal hemisection lesjoner ble demonstrert i C57BL / 6 mus i en studie på aksonal regenerasjon der en 0,9 mm dyp rift utvidet like utenfor den sentrale kanalen i hver prøve bekreftes av patologiske deler av ryggmargen en. Locomotion av alle disse dyrene gjenoppretteed å følge denne ryggmargen sårskader skade.
Figur 1. (A) I mus i ryggraden stabilisator plassert på LISA scenen. Den vibrerende blad er rettet mot ryggmargen å bli flenget. Micro-driver kontroller er plassert under scenen og er utformet for å plassere musen i riktig område. Den vertikale mikro-føreren styrer lesjon dybde, og vippe bryteren skrus horisontalplanet i ryggmargen for å hindre vinkling av sårskader. Den på-bryter styrer vibrasjonene motoren, og en annen knott justerer amplitude. (B) En 0,75 mm dorsal hemisection sårskader lesjon kuttet under intakte laminære buer.
Figur 2. (A) I mus ryggrad stabilisator som består av en U-formet kanal og to armer og kontakter. Musen er plassert i C trough brukes for cervical SCI og i T trau for thorax SCI. (B) Den cervical spine er fiksert ved å plassere armene under laterale fasetter og deretter låse tommeskruene. Dura er eksponert mellom sjiktene av C5-6, C6-7, og C7-T1 uten fjerning av bein.
Figur 3. Fire dorsal ryggmargen flenger på dybder på 0,5, 0,8, 1,1, og 1,4 mm observert i sagittal visning (cresyl-fiolett og eosin beis) skildrer den høye graden av presisjon ved hjelp av denne teknikken.
Discussion
Ryggvirvel stabilisering før laceration skader i ryggmargen har blitt oppnådd ved fiksering i spinous prosesser. Både cervical spine lordotic kurve og festing av klemmer til bulk korte cervical spinous prosesser fra C3 gjennom T1 i musen hindre effektiv ryggraden stabilisering. Videre bruk av et barberblad eller microscissors utnyttet kontrolleres manuelt forårsaker betydelig vev deformasjon som skaper variasjon i dybden av lesjon seks. Dette kan føre til feiltolkning av data spesielt når aksonal regenerasjon av konkrete trasé er studert. For eksempel kan spart rygg corticospinal axoner mistolkes som regenerert axoner hvis dorsal corticospinal skrift ikke ble fullstendig transektert på tidspunktet for lesioning. Disse utfordringene kan løses ved hjelp av en ryggrad stabilisering enheten med fiksering til de fasetter på et enkelt nivå og presis lesioning av ryggmargen. I tillegg bruker ahigh frekvens oscillerende blad gir et skarpt laceration uten å knuse eller contusing tilstøtende ryggmarg. Denne metoden har blitt brukt til å produsere ryggmargen laceration skader hos rotter 9,12,14, med senere endringer for å produsere thorax ryggmargen flenger i mus 6. I denne henvendelsen, beskriver vi metoden for å skape pålitelige livmorhalskreft laceration lesjoner i mus.
I den utstrekning anteroposterior diameter av ryggmargen er <2 mm i musen, presise dypet av sårskader lesjon er avgjørende for å skape et pålitelig eksperimentell modell. Minimal variasjon i lesjon dybde vil vesentlig endre resultatene av eksperimenter vurdere axon regenerering samt volum og atferdsmessige studier. Nøyaktigheten av lesjon dybde ved hjelp av denne metode er ± 0,01 mm fordi vi brukte høy presisjon mikroelementer for å kontrollere posisjonen av skjærebladet. Denne metoden har redusert inkonsekvens ihørende i andre modeller for å skape en rift SCI. Denne metoden er spesielt nyttig i å studere aksonal regenerering av den lange ryggmarg trasé lokalisert i dorsal halvdel av ryggmargen, som corticospinal tarmkanalen, den rubrospinal tarmkanalen, og den dorsale stigende tarmkanalen. Med denne metoden kan disse fiber traktater være fullstendig og pålitelig transektert. I dette henseende blir feil av datafortolkningen minimeres, og dermed forbedre påliteligheten til rapportering av eksperimentelle studier på SCI.
Oppsummert har vi beskrevet en ny teknikk for å skape en reproduserbar in vivo modell av cervikal ryggmarg sårskader skade i musen. Denne teknikken er basert på ryggraden stabilisering ved fiksering av de cervikale fasetter og laceration i ryggmargen ved hjelp av en oscillerende kniv. Ved hjelp av denne metoden i en dorsal thorax ryggmargen sårskader modell i mus 6, viste vi en tett sammenheng mellom sårskader dybde, histologi, ogatferd utvinning. En slik teknikk har også blitt funnet å være pålitelig ved flere andre laboratorier 2,12.
Disclosures
- Flere forfattere (YPZ, Xmx, CBS) har en økonomisk interesse i Louisville Impactor System, Inc.
- Forfatterne, Yi Ping Zhang, Lisa BE Shields og Christopher B. Shields, er ansatt i Norton Healthcare, Louisville, KY. Andre forfattere er ansatt ved Indiana University, Indianapolis, IN.
- Forfatterne fikk ikke støtte fra noen selskap som produserer reagenser eller instrumenter som brukes i denne artikkelen.
Acknowledgments
Utviklingen av denne enheten ble støttet av LISA Co, Louisville, Kentucky. Vi erkjenner også den pågående støtte fra Norton Healthcare, Louisville, KY til CBS, og NS050243 NIH, NS052290, og NS059622 til Xmx.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
