Summary
Een nieuwe techniek om een reproduceerbare creëren
Abstract
Gebruik van genetisch gemodificeerde muizen verbetert ons begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan verschillende neurologische aandoeningen zoals een dwarslaesie (SCI). Freehand handbediening gebruikt om een scheur model van SCI produceren creëert inconsistent blessures vaak geassocieerd met een crush of kneuzing component en daarom werd een nieuwe techniek ontwikkeld. Ons model van cervicale laceratie SCI heeft inherente problemen met de vrije hand methode opgelost door het opnemen van 1) cervicale wervelkolom stabilisatie door wervel facet fixatie, 2) verbeterde spinal cord blootstelling, en 3) de oprichting van een reproduceerbare scheur van het ruggenmerg met behulp van een oscillerende mes met een nauwkeurigheid van ± 0,01 mm in de diepte zonder bijbehorende kneuzing. Vergeleken met de standaard methoden voor het maken van een scheur SCI zoals vrije hand gebruik van een scalpel of schaar is onze werkwijze produceerde een consistente laesie. Deze methode is nuttig voor studies op axonale regeneratie van corticospinal, rubrospinale, en dorsale oplopende traktaten.
Introduction
De beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muizen is een krachtig hulpmiddel om de effecten van bepaalde genen die een rol spelen bij de mechanismen van SCI identificeren. Laceration SCI is een belangrijk model gebruikt om therapeutische middelen of moleculen die een effectieve behandeling kan bieden na deze blessure 8 onderzoeken. Fixatie van de doornuitsteeksels tijdens het maken van de scheur letsel bij muizen is onnauwkeurig te wijten aan de moeilijkheden om de dunne en kwetsbare doornuitsteeksels betrokken bij het handhaven van spinale fixatie 5,11. Variabiliteit in de diepte van de scheur van slechts 0,2 mm (10% van de diameter van de muis ruggenmerg) veroorzaakt misleidende interpretatie van gegevens. De aard en omvang van het ruggenmerg scheur laesie moet exact worden gedefinieerd 10. Om deze uitdaging aan te pakken, hebben we een nieuwe techniek die bestaat uit vertebrale stabilisatie ontwikkeld en gebruikt gefabriceerd bladen bevestigd aan de Louisville Injury System Apparatus (LISA) een scheur SCI 7,14 produceren. Deze blessure is gemaakt met behulp van een scherpe oscillerend mes dat weefsel vervorming vermeden tijdens de scheur proces. De diepte van de scheur was precies met een nauwkeurigheid van 0,01 mm met behulp van micro-drivers die de scheur diepte te controleren. Snijbladen zijn op maat gemaakt voor de specifieke vormen en breedtes om de gewenste scheur creëren contour 9. We demonstreren 1) de methode van cervicale wervelkolom blootstelling, 2) de techniek van het wervellichaam stabilisatie met behulp van een bilaterale facet fixatie-apparaat, en 3) het creëren van een cervicale scheur letsel met behulp van een vibrerende mes.
Protocol
1. Animal Voorbereiding en toepassing van de Spine Stabilizer
De muis cervicale wervelkolom concaaf ventraal gezien vanaf de laterale. De doornuitsteeksels C3 tot T1 zijn klein en bros en derhalve niet geschikt voor vertebrale stabilisatie zoals algemeen beschreven 3,4. Wij raden wervelkolom stabilisatie worden uitgevoerd door laterale facet fixatie. De fixatie inrichting bestaat uit een U-vormig metalen kanaal naar de muis en twee verstelbare RVS armen die zijdelings klemmen elk facet ondersteunen. Hier vandaan immobilisatie van het doel wervel. Na spinale fixatie wordt de wervelkolom licht verhoogd om de cervicale wervelkolom kromming plat betere blootstelling van het ruggenmerg verschaffen.
- Steriliseren de volgende chirurgische instrumenten: 2-3 paren van tangen, 2 paar microscissors, een 30 G naald, hechtdraad en naald houder, huid clips en clip applicator. Ontsmet de wervelkolom stabilisator. Anesthetize de muis met een intraperitoneale cocktail van ketamine / xylazine (100 mg / 10 mg / kg). Scheer de haren van de hals van de muis.
- Na reiniging van de huid met een povidonjood-oplossing en 70% alcohol, beweeg de muis naar de operatietafel verwarmd met een verwarmingselement. Bedek de ogen van het dier met oogzalf om cornea drogen te voorkomen.
- Na inductie van de anesthesie (bereikt wanneer de muis niet reageert op een staart knijpen), maak een posterieure cervicale middellijn incisie in de huid van de achterhoofdsknobbel tot de onderhuidse vet-pad van de lagere cervicale wervelkolom. Onder vergroting, het uitvoeren van een middellijn incisie tussen de trapezius spieren op C2 en splitsen de semispinalis capitis spieren. Identificatie van de submusculair vet pad vergemakkelijkt dissectie in de juiste laag.
- Verleng de middellijn spier dissectie caudaal aan de T2 doornuitsteeksels proces dat als een betrouwbare landmark fungeert. Snijd de spieren aan de T2 wervel en verwijder het kraakbeen gedeelte van de T2doornuitsteeksels proces.
- Ontleden de paravertebrale spieren van de C2 via T2 laminae met een paar micro-schaar. Muscle dissectie begint naast de doornuitsteeksels en strekt bilateraal de facetgewrichten. Scheid de spieren direct naast de doornuitsteeksels en laminae (in de periostale laag) tot bloeding minimaliseren. Nadat de laterale vlakken blootgesteld, zet de muis in de U-vormige kanaal van de LISA fase.
- Bevestig de RVS armen onder de blootgestelde facetten bilateraal. Zodra de armen zijn in de plaats, draai de duimschroeven van de stalen armen om de wervelkolom te immobiliseren. Deze onderhoudt stevige fixatie van de doelgroep wervel en zorgt voor een uitstekende belichting. De armen kunnen worden aangepast om nauwkeurige horizontale oriëntatie van de wervelkolom.
- Incise het ligamentum flavum tussen C5 en C6 te bloot onderliggende dura. Tussen de interlaminaire ruimte, gebruik maken van een 30 G naald een kleine durotomie waardoor microscissors worden geplaatst om te creërenbreiden de durotomie. Het ruggenmerg is nu bereid om de gecontroleerde scheur laesie ondergaan.
2. Cervicale ruggenmerg Laceration Met de LISA-apparaat
- De breedte van het ruggenmerg uitbreiding varieert op verschillende niveaus. Maak een dorsale hemisectie laesie op C5-6 met een 2,3 mm platte en stel de amplitude van de trilling van de gehele breedte van het ruggenmerg te dekken. Bladen worden verkregen van Fine Science Tools Inc (Foster City, CA) en aangepast voor het ruggenmerg snijwonden. Handhaaf de amplitude van de oscillatie blad op ≥ 0,5 mm, aangezien lagere amplitude niveaus zal het gemak van scheuren koord verminderen.
- Plaats de wervelkolom stabilisator en de muis op de LISA podium. Het blad is bevestigd aan de LISA haar positie gecontroleerd door micro-drivers kunnen drie bewegingsbereik. Onderdelen van de LISA en hun functies worden beschreven in figuur 1.
- Macht het mes-vibrerende schakelaar aan. Onder magnificatie, beweeg de muis zodat de blootgestelde ruggenmerg rechtstreeks wordt gepositioneerd onder de vibrerende mes.
- Verhoog het podium ondersteuning van de muis in de richting van de oscillerende mes. De "0"-stand wordt opgenomen wanneer het blad nauwelijks raakt de dorsale ader van het ruggenmerg. Meet de diepte van het ruggenmerg scheur ten opzichte van de "0" stand.
- Verhoog het podium positie door micro-driver control: een 360 ° bocht van de micro-driver knop verheft het podium met 0,25 mm. Aldus wordt een 0,75 mm dorsale hemisectie laesie gecreëerd door de micro-driver knop 3 keer. De nauwkeurigheid van de laesie ± 0.01 mm. Als het blad begint het ruggenmerg verscheuren Smeer het chirurgische veld met irrigatie zoutoplossing. De snijdiepte van het ruggenmerg wordt door de verticale micro-driver en is onafhankelijk van visuele geleiding.
- Zodra de vooraf bepaalde diepte is bereikt, zet de vibrerende schakelaar uit. Idealiter wordt de oscillerende mes gepositioneerd in het lEsion kloof zonder bewijs van weefsel vervorming. Verlaag het podium van het snijmes en verwijder het bloed en zout uit het chirurgische veld met behulp van katoen Q-tips. Hemostase spontaan in <1 min.
- Laat de muis van de wervelkolom stabilisator. Geschatte de paraspinale spieren met behulp 6-0 zijden hechtdraad en sluit de huid gewonden met RVS Michel clips.
3. Animal Care
- Subcutaan injecteren van een totaal van 1-2 ml zoutoplossing om een adequate hydratatie te handhaven en plaats de muis in het herstel kooi op een verwarmingselement tijdje weer bij bewustzijn.
- Zorg voor water en zacht voedsel ad lib en beheren pijnstillers voor 48 uur post-operatief. Er is geen noodzaak voor blaas zorg na dorsale hemisectie van het ruggenmerg.
Representative Results
Immobilisatie van de doelstelling wervel van groot belang genereren nauwkeurige laesies van de muis ruggenmerg. Onze wervelkolom stabilisatie apparaat overwint de anatomische aspecten van korte doornuitsteeksels en ventrale lordose van de muis cervicale wervelkolom. De halswervels zijn goed belicht met behulp van onze cervicale wervelkolom stabilisator (Figuur 2). De muis wervelkolom stabilisatie-inrichting is een betrouwbare techniek om de wervelkolom bereiden ruggenmerg procedures. De diepte van de laesie met de LISA nauwkeurig tot 0,01 mm 6,13. De precieze scheur veroorzaakt geen kneuzing aan de laesie / weefsel-interface (Figuur 3). De nauwkeurigheid van de dorsale hemisectie laesies aangetoond in C57BL / 6 muizen in een studie op axonale regeneratie waarbij een 0,9 mm diepe snijwonden uitgebreid net buiten het centrale kanaal in elk specimen bevestigd pathologische secties van het ruggenmerg 1. Locomotion van al deze dieren te herstellened volgt deze ruggenmerg scheuren letsel.
Figuur 1. (A) De muis in de wervelkolom stabilisator bovenaan de LISA podium. De trillende blad is gericht op het ruggenmerg te worden verscheurd. Micro-driver bedieningselementen bevinden zich onder het podium en zijn ontworpen om de muis te positioneren in de juiste website. De verticale micro-bestuurder de controle over de laesie diepte, en het kantelen knop regelt het horizontale vlak van het ruggenmerg naar hoeking van de scheuren te voorkomen. De aan-uit schakelaar regelt de vibratie motor, en een andere knop regelt de amplitude. (B) A 0.75 mm dorsale hemisectie laceratie laesie te snijden onder intact laminaire bogen.
Figuur 2. (A) De muis wervelkolom stabilisator bestaat uit een U-vormig kanaal en twee armen en connectoren. De muis wordt in het C trog voor cervicale SCI en de T drinkbak thoracale SCI. (B) de cervicale wervelkolom wordt gefixeerd door het plaatsen van de armen onder de laterale vlakken en vergrendelen de duimschroeven. De dura wordt belicht tussen de bladen van C5-6, C6-7, en C7-T1 zonder verwijdering van het bot.
Figuur 3. Four dorsale ruggenmerg snijwonden diepte van 0.5, 0.8, 1.1 en 1.4 mm waargenomen in het sagittale (cresyl-violet en eosine kleuring) die de grote nauwkeurigheid met deze techniek.
Discussion
Vertebrale stabilisatie vóór scheuren verwondingen aan het ruggenmerg werd verkregen door fixatie van de doornuitsteeksels. Zowel de cervicale wervelkolom lordotic curve en bevestiging van klemmen om de broze korte baarmoederhals doornuitsteeksels C3 tot T1 in de muis te voorkomen effectieve wervelkolom stabiliseren. Bovendien wordt het gebruik van een scheermesje of microscissors gebruikt onder handbediening weefsel veroorzaken aanzienlijke vervormingen die variabiliteit leidt in de diepte van de laesie 6. Dit kan leiden tot een verkeerde interpretatie van de gegevens in het bijzonder wanneer axonale regeneratie van specifieke studierichtingen wordt bestudeerd. Bijvoorbeeld kan gespaard dorsale corticospinal axons worden geïnterpreteerd als geregenereerde axonen als de dorsale corticospinal darmkanaal is niet helemaal doorgesneden bij de laesie. Deze problemen worden opgelost met een ruggengraat stabilisatieapparaat bevestigingsmateriaal om de facetten op een niveau en nauwkeurige laesie van het ruggemerg. Bovendien zou het gebruik ahoge frequentie oscillerend mes produceert een scherpe scheur zonder pletten of contusing de aangrenzende ruggenmerg. Deze werkwijze is gebruikt voor de productie ruggenmerg verwonding letsel bij ratten 9,12,14, met latere wijziging van thoracale ruggenmerg snijwonden produceren muizen 6. In deze mededeling, beschrijven we de methode van het creëren van betrouwbare cervicale letsels scheur in de muis.
Voorzover de achterwaartse diameter van het ruggenmerg is <2 mm in de muis, nauwkeurige diepte van de scheur laesie cruciaal zijn voor een betrouwbaar experimenteel model. Minimale variabiliteit in de laesie diepte zullen de resultaten van de experimenten beoordelen axonregeneratie evenals volumetrische en gedragsstudies aanzienlijk veranderen. De nauwkeurigheid van de laesiediepte deze methode is ± 0,01 mm omdat we gebruikten hoge precisie micro-stuurprogramma om de positie van het zaagblad te beheersen. Deze methode heeft de inconsistentie verminderdherent in andere modellen van het creëren van een scheur SCI. Deze werkwijze is bijzonder nuttig bij het bestuderen van axonale regeneratie van het ruggenmerg lange trajecten in de dorsale helft van het ruggenmerg, zoals de corticospinale tractus, de rubrospinale darmkanaal en de dorsale opgaande kanaal. Met deze methode kunnen deze vezelbanen volledig en betrouwbaar zijn doorgesneden. In dit opzicht zijn onjuiste interpretatie van gegevens geminimaliseerd, waardoor de betrouwbaarheid van de rapportage van experimenteel onderzoek van SCI.
Samengevat hebben we een nieuwe techniek beschreven om een reproduceerbare maken in vivo model van ruggenmerg verwonding schade in de muis. Deze techniek is gebaseerd op de rug stabilisatie door fixatie van de cervicale facetten en scheuren van het ruggenmerg met een oscillerend mes. Met behulp van deze methode in een dorsale thoracale ruggenmerg rijwond model in muizen 6, hebben we aangetoond een strakke correlatie tussen de scheur diepte, histologie, engedrag herstel. Een dergelijke techniek is ook gevonden betrouwbaar door verscheidene andere laboratoria 2,12.
Disclosures
- Verschillende auteurs (YPZ, XMX, CBS) een financieel belang in de Louisville Impactor System, Inc
- De auteurs, Yi Ping Zhang, Lisa BE Shields en Christopher B. Shields, zijn medewerkers van Norton Healthcare, Louisville, KY. Andere auteurs zijn in dienst van de Universiteit van Indiana, Indianapolis, IN.
- De auteurs hebben geen financiering te ontvangen van elk bedrijf dat reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel te produceren.
Acknowledgments
De ontwikkeling van dit apparaat werd ondersteund door LISA Co, Louisville, Kentucky. Wij erkennen ook de voortdurende steun van Norton Healthcare, Louisville, KY naar CBS, en NIH NS050243, NS052290 en NS059622 te XMX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
