Summary
Une nouvelle technique pour créer un reproductible
Abstract
Utilisation des souris génétiquement modifiées améliore notre compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent plusieurs troubles neurologiques tels qu'une blessure de la moelle épinière (SCI). commande manuelle de Freehand utilisé pour produire un modèle de lacération de la SCI crée blessures incompatibles souvent associés à une composante d'écrasement ou de contusion et, par conséquent, une nouvelle technique a été développée. Notre modèle de col de l'utérus lacération SCI a décidé difficultés inhérentes à la méthode à main levée en incorporant 1) stabilisation vertébrale cervicale par la fixation de la facette vertébrale, 2) le renforcement de l'exposition de la moelle épinière, et 3) la création d'une lacération reproductible de la moelle épinière à l'aide d'une lame oscillante avec une précision de ± 0,01 mm de profondeur sans contusion associée. Par rapport aux méthodes classiques de création d'une lacération SCI comme l'utilisation à main levée d'un scalpel ou des ciseaux, notre méthode a produit une lésion constante. Cette méthode est utile pour les études sur la régénération axonale des corticospinal, rubrospinal, et les voies ascendantes dorsales.
Introduction
La disponibilité des souris génétiquement modifiées est un outil puissant pour identifier les effets des gènes spécifiques qui jouent un rôle dans les mécanismes de la SCI. Lacération SCI est un modèle important utilisé pour examiner des agents ou des molécules thérapeutiques qui peuvent fournir un traitement efficace suite à cette blessure 8. Fixation des apophyses épineuses lors de la création de la blessure de lacération chez la souris est imprécis en raison de la difficulté à saisir les apophyses épineuses minces et fragiles impliqués dans le maintien de fixation rachidienne 5,11. La variabilité de la profondeur de la lacération de seulement 0,2 mm (10% du diamètre de la moelle épinière de souris) provoque l'interprétation erronée de données. La nature et l'étendue de la moelle épinière lacération lésion doivent être précisément définies 10. Pour relever ce défi, nous avons développé une nouvelle technique consistant en la stabilisation vertébrale et utilisé des lames fabriquées attachés à la blessure appareil de système Louisville (LISA) pour produire une lacération SCI 7,14. Cette lésion a été créée en utilisant une lame oscillante pointu qui évite la déformation des tissus au cours du processus de lacération. La profondeur de la déchirure était précis avec une précision de 0,01 mm à l'aide de micro-moteurs qui contrôlent la profondeur de lacération. Lames sont fabriquées sur mesure aux formes et largeurs spécifiques pour créer la lacération souhaité contour 9. Nous démontrons 1) la méthode de l'exposition du rachis cervical, 2) la technique de stabilisation vertébrale à l'aide d'un dispositif de fixation bilatérale des facettes, et 3) la création d'une blessure à la déchirure cervicale à l'aide d'une lame vibrante.
Protocol
1. Préparation des animaux et l'application de la stabilisation de la colonne vertébrale
Le rachis cervical de la souris est concave ventralement comme on le voit dans la vue latérale. Les apophyses épineuses de C3 à T1 sont petites et friable et, par conséquent, ne sont pas appropriés pour la stabilisation vertébrale communément décrite 3,4. Nous recommandons que la stabilisation de la colonne vertébrale être réalisée par fixation de la facette latérale. Le dispositif de fixation est constitué d'un profilé métallique en forme de U pour soutenir la souris et deux bras réglables en acier inoxydable que pour serrer chaque facette latéralement. Cela offre une excellente immobilisation de la vertèbre cible. Après fixation de colonne vertébrale, la colonne vertébrale est légèrement surélevé pour aplatir la courbure de la colonne vertébrale cervicale pour fournir une meilleure exposition de la moelle épinière.
- Stériliser les instruments chirurgicaux suivants: 2-3 paires de pinces, 2 paires de microciseaux, un porte-aiguille 30 G, suture et une aiguille, pince la peau, et l'applicateur de clips. Désinfecter la stabilisation de la colonne vertébrale. Anesthetize la souris en utilisant un cocktail intrapéritonéale de kétamine / xylazine (100 mg / 10 mg / kg). Raser les poils du cou de la souris.
- Après nettoyage de la peau avec une solution de polyvidone iodée et d'alcool à 70%, de déplacer la souris sur la table d'opération réchauffé avec un coussin chauffant. Couvrir les yeux de l'animal avec une pommade ophtalmique pour éviter dessèchement de la cornée.
- Après l'induction de l'anesthésie (atteint lorsque la souris ne répond pas à un pincement de la queue), faire une incision de la peau de la ligne médiane cervicale postérieure de l'occiput à la graisse sous-cutanée-pad du rachis cervical inférieur. Au microscope, effectuer une incision médiane entre les trapèzes en C2 et diviser les muscles de capitis de semispinalis. Identification du coussinet adipeux sous-musculaire facilite la dissection dans la couche correct.
- Prolonger la dissection du muscle ligne médiane caudale à l'apophyse épineuse T2 qui sert de point de repère fiable. Couper les muscles attachés à la vertèbre T2 et enlever la partie cartilagineuse du T2apophyse épineuse.
- Disséquer les muscles spinaux de la C2 par les lames T2 en utilisant une paire de micro-ciseaux. dissection musculaire commence adjacent aux apophyses épineuses et s'étend de manière bilatérale aux facettes articulaires. Séparez les muscles adjacents à des apophyses épineuses et des lamelles (dans la couche périostée) afin de minimiser les saignements. Après les facettes latérales sont exposés, placez la souris sur le canal en forme de U de la scène LISA.
- Fixez les bras en acier inoxydable sous les aspects exposés bilatérale. Une fois que les armes sont en place, serrez les vis de serrage des bras d'acier pour immobiliser la colonne vertébrale. Cela maintient fixation ferme de la vertèbre cible et offre une excellente exposition. Les bras peuvent être ajustés pour fournir une orientation horizontale précise de la colonne vertébrale.
- Inciser le ligament jaune entre C5 et C6 pour exposer sous-jacente dura. Entre l'espace interlaminaire, utilisez une aiguille de calibre 30 pour créer une petite durotomie à travers lequel microciseaux sont placés àétendre le durotomie. La moelle épinière est maintenant prêt à subir la lésion de lacération contrôlée.
2. Cervicale lacération de la moelle épinière en utilisant le dispositif LISA
- La largeur de l'élargissement de la moelle épinière cervicale varie à différents niveaux. Faire une lésion hemisection dorsale en C5-6 à l'aide d'une lame plate de 2,3 mm et régler l'amplitude de vibration pour couvrir toute la largeur de la moelle épinière. Les lames sont obtenues à partir Beaux Sciences Tools Inc. (Foster City, CA) et modifiées pour lacération de la moelle épinière. Maintenir l'amplitude de l'oscillation de la lame à ≥ 0,5 mm, en tant que niveaux d'amplitude plus faibles diminuent la facilité de la déchirure du cordon.
- Positionnez le stabilisateur de la colonne vertébrale et de la souris sur la scène LISA. La lame est fixée à la LISA à sa position commandée par les micro-moteurs capables de trois gammes de mouvement. Composantes de la LISA et leurs fonctions sont décrites dans la figure 1.
- Mettez le commutateur lame vibrante sur. Sous magnification, déplacer la souris pour que la moelle épinière exposée est positionnée directement en dessous de la lame vibrante.
- Surélever la scène soutenant la souris vers la lame oscillante. La position «0» est enregistré lorsque la lame touche à peine la veine dorsale de la moelle épinière. Mesurer la profondeur de la lacération de la moelle épinière par rapport à la position "0".
- Élever la position de la scène par le contrôle micro-conducteur: un tour de 360 ° du bouton micro-conducteur élève le stade de 0,25 mm. Ainsi, une lésion dorsale mm de hemisection 0,75 est créé en tournant le bouton de micro-driver 3 fois. La précision de la lésion est de ± 0,01 mm. Comme la lame commence à lacérer la moelle épinière, lubrifier le champ opératoire avec irrigation saline. La profondeur de coupe de la moelle épinière est commandé par le micro-conducteur vertical et est indépendante de l'orientation visuelle.
- Une fois la profondeur prédéterminée a été atteinte, tournez le commutateur de vibration off. Idéalement, la lame oscillante est positionné dans la lécart de Esion sans preuve de la déformation des tissus. Abaisser le stade de la lame de coupe et retirer le sang et la solution saline du champ opératoire en utilisant du coton Q-tips. Hémostase se produit spontanément chez <1 min.
- Relâchez la souris du stabilisateur de la colonne vertébrale. Rapprocher les muscles spinaux utilisant 6-0 suture de soie et fermer la plaie de la peau avec Michel clips en acier inoxydable.
3. Animal Care
- Sous-cutanée injecter un total de 1-2 ml de solution saline pour maintenir une hydratation adéquate et placer la souris dans la cage de récupération sur un coussin chauffant tout en reprenant conscience.
- Fournir de l'eau et ad lib doux de nourriture et d'administrer des analgésiques pendant 48 heures après l'intervention. Il n'est pas nécessaire pour les soins de la vessie après hemisection dorsale de la moelle épinière.
Representative Results
Immobilisation de la vertèbre cible est d'une grande importance dans la génération de lésions précises de la moelle épinière de souris. Notre dispositif de stabilisation de la colonne vertébrale surmonte les problèmes anatomiques des apophyses épineuses courts et lordose ventrale du rachis cervical de la souris. Les vertèbres cervicales sont bien exposées avec notre stabilisateur de la colonne cervicale (figure 2). Notre colonne vertébrale de souris dispositif de stabilisation est une technique fiable pour préparer la colonne vertébrale des procédures de la moelle épinière cervicale. La profondeur de la lésion en utilisant le LISA est précis à 0,01 mm 6,13. La lacération précis ne provoque aucune contusion à l'interface de la lésion / de tissu (figure 3). La précision des lésions dorsales Hémisection a été démontrée chez la souris C57BL / 6 dans une étude sur la régénération axonale dans lequel un 0,9 mm de profondeur lacération étendu juste au-delà du canal central dans chaque spécimen confirmé par les articles pathologiques de la moelle épinière 1. Locomotion de tous ces animaux récupérered suite de cette blessure à la lacération de la moelle épinière.
Figure 1. (A) la souris dans la stabilisation de la colonne vertébrale placé sur la scène LISA. La lame vibrante est dirigée vers la moelle épinière d'être déchiré. Contrôles Micro-pilotes sont situés sous la scène et sont conçus pour placer la souris dans le site approprié. Le micro-conducteur vertical de contrôler l'intensité des lésions, et le bouton de commande de basculement du plan horizontal de la moelle épinière d'empêcher l'angulation de la lacération. L'interrupteur commande le moteur de vibration, et un autre bouton permet de régler son amplitude. (B) A mm dorsale hemisection lacération lésion 0,75 coupée sous arches laminaires intactes.
Figure 2. (A) de stabilisation de la colonne vertébrale de la souris comprenant un canal en forme de U et deux bras et les connecteurs. La souris est placée dans le creux C utilisée pour col de l'utérus SCI et dans l'auge pour T thoracique SCI. (B) Le rachis cervical est une fixation en plaçant les bras sous les facettes latérales, puis le blocage des vis de serrage. La dure est exposée entre les lames de C5-C6, C6-7, et C7-T1 sans enlèvement de l'os.
Figure 3. Quatre dorsale des lacérations de la moelle épinière à des profondeurs de 0,5, 0,8, 1,1 et 1,4 mm observés dans la vue sagittale (crésyl-violet et l'éosine) représentant le degré élevé de précision, en utilisant cette technique.
Discussion
Stabilisation vertébrale avant des lacérations à la moelle épinière a été obtenue par la fixation des apophyses épineuses. Tant la courbure cervicale de la colonne vertébrale lordose et la fixation des brides pour les courtes apophyses épineuses cervicales friables de C3 à T1 chez la souris empêcher la stabilisation de la colonne vertébrale efficace. En outre, l'utilisation d'une lame de rasoir ou microciseaux utilisé sous contrôle manuel provoque une déformation importante des tissus qui crée la variabilité de la profondeur de la lésion 6. Cela peut conduire à une mauvaise interprétation des données, en particulier lorsque la régénération axonale des voies spécifiques est étudiée. Par exemple, épargnés axones cortico dorsales peuvent être mal interprétés comme des axones régénérés si le tractus cortico-spinal dorsal n'a pas été complètement sectionné au moment de lesioning. Ces défis peuvent être surmontés en utilisant un dispositif de stabilisation de la colonne vertébrale avec fixation à facettes à un seul niveau et lesioning précise de la moelle épinière. En outre, en utilisant ahaute lame oscillante de fréquence produit une déchirure nette sans écraser ou contusing la moelle épinière adjacent. Cette méthode a été utilisée pour produire de lésions à la moelle lacération de la moelle chez le rat 9,12,14, avec modifications ultérieures de produire thoraciques lacérations de la moelle épinière chez les souris 6. Dans la présente communication, nous décrivons la méthode de créer des lésions de lacération cervicale fiables chez la souris.
Dans la mesure où le diamètre antéro-postérieure de la moelle épinière est <2 mm chez la souris, des profondeurs précises de la lésion de lacération sont essentiels dans la création d'un modèle expérimental fiable. Variabilité minimale dans la profondeur lésion va modifier considérablement les résultats d'expériences évaluant la régénération des axones ainsi que des études volumétriques et comportementaux. La précision de la profondeur des lésions à l'aide de cette méthode est de ± 0,01 mm parce que nous avions l'habitude de précision micro-conducteurs haute pour contrôler la position de la lame de coupe. Cette méthode a permis de réduire l'incohérenceHerent dans d'autres modèles de la création d'une lacération SCI. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier la régénération axonale de la longue moelle épinière voies de situé dans la partie dorsale de la moelle épinière, comme le faisceau cortico-spinal, les voies rubrospinal, et l'ascendant voies dorsale. Avec cette méthode, ces faisceaux de fibres peuvent être complètement sectionné et fiable. À cet égard, les erreurs d'interprétation des données sont réduits au minimum, ce qui améliore la fiabilité des rapports d'études expérimentales sur SCI.
En résumé, nous avons décrit une nouvelle technique pour créer un reproductible modèle in vivo de lésions cervicales de lacération de la moelle épinière chez la souris. Cette technique est basée sur la stabilisation de la colonne vertébrale par la fixation des facettes cervicales et lacération de la moelle épinière à l'aide d'une lame oscillante. L'utilisation de cette méthode dans la moelle modèle de lacération de la moelle thoracique dorsal chez la souris 6, nous avons démontré une corrélation étroite entre la profondeur de lacération, histologie, etrécupération de comportement. Cette technique a également été jugée fiable par plusieurs autres laboratoires 2,12.
Disclosures
- Plusieurs auteurs (YPZ, XMX, CBS) ont un intérêt financier dans le Louisville Impactor System, Inc.
- Les auteurs, Yi Zhang Ping, Lisa servir de boucliers, et Christopher B. Shields, sont des employés de Norton Healthcare, Louisville, KY. D'autres auteurs sont employés par l'Université de l'Indiana, Indianapolis, IN.
- Les auteurs n'ont pas reçu de financement de toute entreprise qui produit les réactifs ou les instruments utilisés dans cet article.
Acknowledgments
Le développement de ce dispositif a été soutenue par le LISA Co., Louisville, Kentucky. Nous reconnaissons aussi le soutien continu de Norton Healthcare, Louisville, KY à CBS, et NIH NS050243, NS052290 et NS059622 à XMX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
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| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
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