Summary
טכניקה חדשנית ליצירת שחזור
Abstract
שימוש בעכברים מהונדסים גנטי משפר את ההבנה של מנגנונים מולקולריים שבבסיס מספר הפרעות נוירולוגיות כגון פגיעה בחוט השדרה (SCI) שלנו. שליטה ידנית ביד חופשית משמשת לייצור דגם קריעה של SCI יוצרת פציעות לא עקביות הקשורים לעתים קרובות עם למחוץ או חבלת רכיב, ולכן טכניקה חדשנית שפתחה. המודל של צוואר הרחם קריעה SCI פתר קשיים הכרוכים בשיטת יד חופשית על ידי שילוב של 1) ייצוב חוליות צוואר הרחם על ידי קיבוע פן בחוליות, 2) חשיפת חוט השדרה משופרת, ו3) יצירה של חתך לשחזור של חוט השדרה באמצעות להב עם נדנוד דיוק של ± 0.01 מ"מ בעומק ללא חבלה קשורה. בהשוואה לשיטות הסטנדרטיות של יצירת קריעה SCI כגון שימוש ביד חופשית של אזמל או מספריים, השיטה שלנו יצרה נגע עקבי. שיטה זו שימושית עבור מחקרים על התחדשות axonal של corticospinal, rubrospinal, ושטחים עולים הגבי.
Introduction
הזמינות של עכברים מהונדסים גנטי היא כלי רב עוצמה כדי לזהות את ההשפעות של גנים ספציפיים שמשחקים תפקיד במנגנונים של SCI. קריעה SCI הוא מודל חשוב המשמש לבחינת סוכנים או מולקולות טיפוליים שעשויים לספק טיפול יעיל בעקבות פציעה זה 8. הקיבעון של תהליכי spinous במהלך יצירה של פציעת חתך בעכברים אינו מדויק בשל הקושי באחיזת תהליכי spinous הדקים ושברירית מעורב עם שמירה על קיבוע עמוד השדרה 5,11. השתנות בעומק של חתך של 0.2 מ"מ בלבד (10% מקוטרו של חוט השדרה עכבר) גורמת לפרשנות מטעה של נתונים. האופי וההיקף של נגע קריעה חוט השדרה חייבים להיות מוגדר 10 בדיוק. כדי להתמודד עם אתגר זה, פיתחנו שיטה חדשנית הכוללת ייצוב השדרה ומשמש להבים מפוברקים שצורפו לואיוויל מכשירי מערכת הפציעה (ליסה) כדי לייצר קריעה SCI 7,14. פציעה זו נוצרה על ידי שימוש בלהב נדנוד חד שנמנע עיוות רקמה בזמן תהליך קריעה. העומק של חתך היה מדויק ברמת דיוק של 0.01 מ"מ על ידי שימוש במייקרו נהגים השולטים על עומק קריעה. להבים לחיתוך הם מחוייט לצורות ורוחב ספציפיים כדי ליצור את קווי המתאר הרצוי קריעה 9. אנו מדגימים 1) שיטה של חשיפת עמוד השדרה הצווארי, 2) טכניקה של ייצוב השדרה באמצעות מכשיר קיבוע פן הבילטראלי, ו3) יצירה של פציעת חתך בצוואר רחם באמצעות סכין רוטט.
Protocol
1. הכנת בעלי חיים ויישום של מייצב השדרה
עמוד השדרה הצווארי העכבר הוא קעורה ventrally כפי שניתן לראות מהתצוגה לרוחב. תהליכי spinous מC3 לT1 הם קטנים ופריכים, ולכן אינם מתאימים לייצוב חוליות כמתואר בדרך כלל 3,4. אנו ממליצים לייצוב עמוד השדרה להתבצע על ידי קיבוע פן לרוחב. המכשיר מורכב מקיבעון ערוץ בצורת U מתכת כדי לתמוך בעכבר ושתי זרועות מתכווננות נירוסטה שמהדק לכל היבט רוחבי. זה מספק קיבוע מצוין של החוליה היעד. לאחר קיבוע עמוד השדרה, בעמוד השדרה הוא מוגבה מעט כדי לשטח את עקמומיות עמוד השדרה הצווארי כדי לספק חשיפה טובה יותר של חוט השדרה.
- לעקר את מכשירי הניתוח הבאים: 2-3 זוגות מלקחיים, 2 זוגות microscissors, מחזיק 30 G מחט, תפר ומחט, קטעי עור, ומוליך קליפ. לחטא את מייצב עמוד השדרה. Anesthetize העכבר באמצעות קוקטייל intraperitoneal של קטמין / Xylazine (100 מ"ג / 10 מ"ג / ק"ג). לגלח את השיער מצווארו של העכבר.
- לאחר ניקוי עור עם פתרון povidone-יוד ואלכוהול 70%, הזז את העכבר על גבי שולחן ניתוחים חימם עם כרית חימום. מכסה את עיניו של בעלי החיים עם משחת עיניים כדי למנוע התייבשות קרנית.
- לאחר האינדוקציה של הרדמה (הגיע כאשר העכבר אינו מגיב לקמצוץ זנב), לבצע חתך בעור קו האמצע צוואר הרחם אחורי מהעורף לשומן תת עורי, הכרית של עמוד השדרה הצווארי נמוכה יותר. תחת הגדלה, לבצע חתך קו האמצע בין שרירי הטרפז בC2 ולפצל את שרירי capitis semispinalis. זיהוי של כרית שומן submuscular מאפשר לנתיחה בשכבה הנכונה.
- להאריך את נתיחת שריר קו האמצע caudally לתהליך spinous T2 המשמש כנקודת ציון אמינה. חותכים את השרירים המחוברים לחוליות T2 ולהסיר את חלק הסחוסים של T2תהליך spinous.
- לנתח את שרירי paraspinal מC2 דרך רבדי T2 באמצעות זוג מיקרו מספריים. נתיחת שריר מתחילה בסמוך לתהליכי spinous ומרחיבה בילטרלי למפרקים הלוואי. הפרד את השרירים סמוכים מייד לתהליכי spinous והרבדים (בשכבת periosteal) כדי למזער את הדימום. לאחר ההיבטים הרוחביים חשופים, הנח את העכבר על הערוץ בצורת U של שלב ליסה.
- צרף את זרועות נירוסטה מתחת להיבטים שנחשפו בילטרלי. ברגע שהנשק נמצא במקום, להדק את ברגי האגודל של זרועות הפלדה כדי לשתק את עמוד השדרה. זו שומרת על קיבעון משרד של החוליה היעד ומספקת חשיפה מצוינת. ניתן להתאים את זרועות כדי לספק כיוון אופקי מדויק של עמוד השדרה.
- לחתוך flavum ligamentum בין C5 ו-C6 לחשוף בסיס דורה. בין מרחב interlaminar, להשתמש במחט 30 G ליצור durotomy קטן שדרכו microscissors ממוקמים ללהאריך את durotomy. חוט השדרה הוא עכשיו מוכן לעבור את נגע חתך המבוקר.
2. קריעת חוט השדרה הצווארי שימוש במכשיר ליסה
- הרוחב של התרחבות חוט השדרה הצווארי משתנה ברמות שונות. הפוך את נגע hemisection הגבי בC5-6 באמצעות סכין שטוח 2.3 מ"מ ולהגדיר את המשרעת של תנודות כדי לכסות את כל הרוחב של חוט השדרה. להבים מתקבלים מפיין מדע כלי Inc (פוסטר סיטי, קליפורניה) והותאמו לקריעת חוט השדרה. לשמור את המשרעת של תנודת הלהב ב≥ 0.5 מ"מ, כמו רמות משרעת נמוכות יותר תקטנה את הקלות של קריעה כבל.
- מקם את עמוד השדרה ומייצב את העכבר על הבמה ליסה. הלהב מחובר לליזה עם עמדתה הנשלטת על ידי מיקרו נהגים המסוגלים שלושה טווחי התנועה. מרכיבים של ליסה והפונקציות שלהם מתוארים באיור 1.
- כוח מתג להב רוטט על. תחת magnification, הזז את העכבר כך שחוט השדרה החשוף ממוקם ישירות מתחת ללהב הרוטט.
- לרומם את שלב תמיכה בעכבר לכיוון להב נדנוד. העמדה "0" נרשמת כאשר הלהב בקושי נוגע וריד הגבי של חוט השדרה. מדוד את העומק של קריעה חוט השדרה יחסית למצב "0".
- שפר את מיקום הבמה על ידי בקרת מיקרו נהג: 360 ° תורו של כפתור מיקרו הנהג מרומם את השלב ב -0.25 מ"מ. כך, נגע hemisection הגבי 0.75 מ"מ נוצר על ידי סיבוב ידית מיקרו נהג 3 פעמים. הדיוק של הנגע הוא ± 0.01 מ"מ. כלהב מתחיל לקרוע את חוט השדרה, לשמן את שדה הניתוח עם השקיה מלוחה. עומק החיתוך של חוט השדרה נשלט על ידי נהג מיקרו האנכי ואינו תלוי בהדרכתו החזותית.
- ברגע שכבר הגיע לעומק שנקבע מראש, לכבות את מתג הרטט כבוי. באופן אידיאלי, להב נדנוד ממוקם בLesion פער ללא עדות לעיוות רקמה. מנמיכים את הבמה מלהב החיתוך ולהסיר את הדם ומלוח משדה הניתוח באמצעות הכותנה Q-טיפים. Hemostasis מתרחש באופן ספונטני ב< 1 דקות.
- שחרר את העכבר ממייצב עמוד השדרה. את שרירי paraspinal משוערים באמצעות תפר משי 6-0 ולסגור את עור פצע באמצעות קליפים מישל נירוסטה.
3. טיפול בבעלי חיים
- תת עורי להזריק כולל של 1-2 מ"ל מי מלח כדי לשמור על לחות נאותה ומניח את העכבר בכלוב ההתאוששות על כרית חימום בעת שב להכרתו.
- לספק מים ומזון רכה lib מודעות ולנהל משככי כאבים במשך 48 שעות שלאחר הניתוח. אין צורך בטיפול בשלפוחית השתן בעקבות hemisection הגבית של חוט השדרה.
Representative Results
קיבוע של החוליה היעד הוא בעלת חשיבות רבה ביצירת נגעים מדויקים של חוט השדרה העכבר. מכשיר ייצוב עמוד השדרה שלנו מתגבר על הבעיות אנטומיות של תהליכי spinous קצרים וורדוסה הגחון של עמוד השדרה הצווארי העכבר. חוליות צוואר הרחם נחשפות גם באמצעות עמוד השדרה הצווארי מייצבנו (איור 2). עמוד השדרה שלנו עכבר ייצוב מכשיר היא טכניקה אמינה כדי להכין את עמוד השדרה לנהלי חוט השדרה הצווארי. העומק של הנגע באמצעות ליסה הוא מדויק עד 0.01 מ"מ 6,13. חתך המדויק לא גורם לחבלה בממשק שהנגע / רקמה (איור 3). הדיוק של נגעי hemisection הגב הודגם בעכברי C57BL / 6 במחקר על התחדשות axonal שבקריעה עמוקה 0.9 מ"מ הוארכה ממש מעבר לתעלה המרכזית בכל דגימה אושר על ידי סעיפים פתולוגיים של חוט השדרה 1. תנועה של כל החיות האלה להתאוששאד בעקבות פציעת קריעה חוט השדרה הזה.
איור 1. () העכבר במייצב עמוד השדרה יוצב על הבמה ליסה. הלהב הרוטט מופנה כלפי חוט השדרה להיות פצועה. בקרות מיקרו נהג נמצאות מתחת לבמה ונועדו למקם את העכבר באתר המתאים. מיקרו הנהג האנכי שולט על עומק הנגע, ואת ידית ההטיה שולטת במישור האופקי של חוט השדרה כדי למנוע זווית של קריעה. המתג ב-off שולט מנוע הרטט, וכפתור אחר מתאים את המשרעת שלו. (ב) נגע קריעה hemisection הגבי מ"מ 0.75 לחתוך מתחת קשתות מינרית ללא פגע.
איור 2. () מייצב עמוד השדרה העכבר המורכב מערוץ בצורת U ושתי זרועות ומחברים. העכבר ממוקם בשוקת C משמשת לצוואר הרחם וSCI בשוקת T עבור SCI החזי. (ב ') עמוד השדרה הצווארי הוא מקובע על ידי הנחת הזרועות מתחת להיבטים לרוחב ולאחר מכן נועל את ברגי האגודל. הדורה חשופה בין הרבדים של C5-6, C6-7, C7-T1 וללא כל הסרת העצם.
איור 3. ארבעה חתכים בעמוד השדרה הגבי בעומק של 0.5, 0.8, 1.1, 1.4 מ"מ ונצפה בתצוגת sagittal (cresyl סגול ו eosin כתם) המתאר את הרמה הגבוהה של דיוק שימוש בטכניקה זו.
Discussion
ייצוב החוליות לפני קריעת פציעות בחוט השדרה שהושג על ידי קיבוע של תהליכי spinous. גם עקומת עמוד השדרה הצווארי lordotic וההתקשרות של מלחציים לתהליכי צוואר הרחם הקצרים תפזורת spinous מC3 דרך T1 בעכבר למנוע ייצוב עמוד השדרה יעיל. יתר על כן, שימוש בסכין גילוח או microscissors מנוצל תחת שליטה ידנית גורמת לעיוות משמעותית רקמה שיוצרת השתנות בעומק של 6 הנגע. זה עשוי להוביל לפירוש לא הנכון של הנתונים במיוחד כאשר התחדשות axonal של מסלולים ספציפיים שלמדה. לדוגמה, האקסונים corticospinal גב חסכו עלולים להתפרש שלא כהלכה כאקסונים התחדשות אם מערכת corticospinal הגבי לא transected לחלוטין בזמן lesioning. ניתן להתגבר על אתגרים אלה על ידי שימוש במכשיר ייצוב עמוד השדרה עם קיבוע להיבטים ברמה יחידה וlesioning המדויק של חוט השדרה. בנוסף, שימוש באהלהב נדנוד תדירות igh מייצר קריעה חדה ללא ריסוק או מבלבל חוט השדרה הסמוך. בשיטה זו נעשתה שימוש כדי לייצר פציעות קריעת חוט השדרה בחולדות 9,12,14, עם השינויים הבאים כדי לייצר חתכים בעמוד השדרה החזי ב6 עכברים. בתקשורת הנוכחית, אנו מתארים את השיטה של יצירת נגעים בצוואר הרחם קריעה אמינות בעכבר.
ככל שקוטר anteroposterior של חוט השדרה הוא <2 מ"מ בעכבר, עומק מדויק של נגע קריעה הוא חיוני ביצירת מודל ניסיוני אמין. שונות מינימאלי בעומק הנגע באופן משמעותי תהיה לשנות תוצאות של ניסויי הערכת התחדשות אקסון, כמו גם מחקרי נפח והתנהגותי. הדיוק של עומק הנגע בשיטה זו הוא ± 0.01 מ"מ כיוון שהשתמשנו במייקרו דיוק נהגים גבוהים כדי לשלוט על המיקום של להב החיתוך. שיטה זו צמצמה את חוסר העקביות בHerent בדגמים אחרים של יצירת קריעה SCI. שיטה זו שימושית במיוחד בחקר התחדשות axonal של חוט השדרה הארוך משעולים הממוקם במחצית הגב של חוט השדרה, כגון מערכת corticospinal, מערכת rubrospinal, ומערכת עולה הגבי. באמצעות שיטה זו, קטעי סיבים אלה יכולים להיות לחלוטין וtransected באופן מהימן. במובן זה, טעויות של נתונים לפרשנות הן מזעריות, ובכך לשפר את אמינות דיווח של מחקרים ניסיוניים בSCI.
לסיכום, יש לנו תאר טכניקה חדשנית כדי ליצור שחזור במודל vivo של פגיעת קריעה חוט השדרה הצווארי בעכבר. טכניקה זו מתבססת על ייצוב עמוד השדרה על ידי קיבוע של היבטים בצוואר הרחם והקריעה של חוט השדרה באמצעות להב נדנוד. שימוש בשיטה זו במודל גב החזי קריעה חוט השדרה ב6 עכברים, הראה מתאם הדוק בין עומק חתך, היסטולוגיה, והתנהגות התאוששות. כגון טכניקה נמצאה גם להיות אמין על ידי מספר מעבדות אחרות 2,12.
Disclosures
- מספר חוקרים (YPZ, XMX, הלשכה המרכזית לסטטיסטיקה) שיש לו אינטרס כלכלי בלואיוויל Impactor המערכת, Inc
- המחברים, יי פינג ג'אנג, שילדס BE ליסה, וכריסטופר ב ילדס, הם עובדים של נורטון בריאות, Louisville, KY. מחברים אחרים מועסקים על ידי אוניברסיטת אינדיאנה, אינדיאנפוליס, אינדיאנה.
- המחברים לא מקבלים מימון מכל חברה שמייצרות חומרים כימיים או מכשירים המשמשים במאמר זה.
Acknowledgments
הפיתוח של מכשיר זה נתמכה על ידי ושות ליסה, לואיסוויל, קנטאקי. כמו כן, אנו מכירים את התמיכה המתמשכת של נורטון בריאות, Louisville, KY ללשכה מרכזית לסטטיסטיקה, וNS050243-NIH, NS052290, וNS059622 לXMX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
