Summary
Новый метод для создания воспроизводимых
Abstract
Использование генетически модифицированных мышей увеличивает наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе некоторых неврологических расстройств, таких как травмы спинного мозга (SCI). Freehand ручным управлением используется для производства рваная рана модель ТСМ создает противоречивый травмы часто связаны с давку или ушиб компонентов и, таким образом, новый метод был разработан. Наша модель разрывы шейки SCI разрешил неизбежных трудностей с руки методом включения 1) шейных позвонков стабилизации позвоночного фиксации аспект, 2) усиление воздействия спинного мозга, и 3) создание воспроизводимых рваная рана спинного мозга использованием вибрирующий нож с с точностью ± 0,01 мм в глубину, не связанные контузии. По сравнению со стандартным методам создания SCI рваная рана руки, такие как использование скальпелем или ножницами, наш метод приводит к постоянному поражения. Этот метод полезен для исследования по регенерации аксонов из corticospИнал, rubrospinal и спинной возрастанию путей.
Introduction
Наличие генетически модифицированных мышей является мощным инструментом для выявления воздействия конкретных генов, которые играют роль в механизмах ТСМ. Надрыв SCI является важной модели используются для изучения терапевтических агентов или молекул, которые могут обеспечить эффективное лечение после этой травмы 8. Фиксация остистых отростков во время создания рваная рана травмы у мышей является неточным в связи с трудностями в понимании тонких и хрупких остистых отростков участвовать в ведении фиксации спинного 5,11. Изменчивость в глубине разрывы только 0,2 мм (10% диаметра мыши спинного мозга) вызывает заблуждение интерпретации данных. Характер и степень повреждения спинного разрыв шнура должны быть точно определены 10. Для решения этой проблемы, мы разработали новый метод, состоящий из позвоночного стабилизации и использовали лезвия изготовлены, подключенные к системе аппарата Травма Луисвилл (LISA), чтобы произвести разрыв SCI 7,14. Эта травма была создана с помощью острого вибрирующий нож, что избежать деформации ткани во время процесса рваная рана. Глубина разрыв был точным с точностью до 0,01 мм с помощью микро-драйверов, которые управляют разрыв глубины. Режущие диски специально разработанный для конкретной формы и ширины, чтобы создать желаемый контур рваная рана 9. Мы демонстрируем 1) метод воздействия шейки позвоночника, 2) техника стабилизации позвоночного использованием двустороннего устройства фиксации грани, и 3) создание травмы шейного рваная рана помощью вибрирующих лезвий.
Protocol
1. Подготовка животных и применение стабилизатора позвоночника
Позвоночник мышь шейки вогнутая снизу, как видно из боковой вид. Остистые отростки от C3 до T1 малы и рыхлый и, следовательно, не являются подходящими для стабилизации позвоночного как обычно описывается 3,4. Мы рекомендуем стабилизации позвоночника быть выполнена фиксация боковых граней. Устройство фиксации состоит из U-образных металлических канал для поддержки мыши и два регулируемых нержавеющей стали оружие, что зажим для каждой грани боков. Это обеспечивает отличную иммобилизации целевой позвонка. После спинного фиксации, позвоночник слегка повышенных чтобы сгладить шейного отдела позвоночника кривизны, чтобы обеспечить лучшее воздействие на спинной мозг.
- Стерилизовать следующих хирургических инструментов: 2-3 пары щипцов, 2 пары microscissors, 30 G иглы, шовный и держатель иглы, кожные скобки, и клип аппликатором. Лечить позвоночник стабилизатора. Anesthetize мыши с помощью внутрибрюшинной коктейль из кетамин / ксилазин (100 мг / 10 мг / кг). Брить волосы от шеи мыши.
- После очищения кожи с повидон-йода и 70% спирте, переместите мышь на операционном столе согрет грелку. Крышка глаза животного с глазной мази, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- После введения анестезии (достигается, когда мышь не реагирует на ущемление хвоста), сделать задний шейный разрез кожи средней линии от затылка до подкожного жира-Pad нижнего шейного отдела позвоночника. Под микроскопом, выполните срединный разрез между трапециевидных мышц у С2 и разделить мышцы semispinalis волосистой части головы. Определение жировой ткани под мышцу облегчает рассечение в правильном слое.
- Расширение средней линии рассечение мышц каудально к T2 остистым отростком, который служит в качестве надежного ориентира. Сокращение мышцы прикреплены к позвонку T2 и удаление хрящевой части Т2остистого отростка.
- Рассеките параспинальных мышц с С2 по T2 пластин с помощью пары микро-ножниц. Мышцы вскрытия начинается рядом с остистыми отростками и простирается на двусторонней основе для суставы. Отделить мышц непосредственно примыкающей к остистые отростки и пластинки (в периостальный слой), чтобы минимизировать кровотечение. После боковыми гранями подвергаются, наведите курсор на U-образный канал сцены Лизы.
- Прикрепить нержавеющей стали под оружие подвергается гранями на двусторонней основе. Как только руки на место затяните винты стали оружием для иммобилизации позвоночника. Это обеспечивает фирме фиксации целевого позвонка и дает прекрасную возможность. Руки могут быть скорректированы для обеспечения точного горизонтальной ориентации позвоночника.
- Надрезать желтой связки между С5 и С6 разоблачить, лежащие в основе оболочки. Между межслойном пространстве, использовать иглы 30 G, чтобы создать небольшой durotomy microscissors через которые помещаются врасширить durotomy. Спинного мозга в настоящее время, подготовленных для прохождения контролируемых поражения рваная рана.
2. Надрыв шейного отдела спинного шнура с помощью устройства LISA
- Ширина шейного отдела спинного расширение шнур изменяется на различных уровнях. Сделайте поражением спинного гемисекция С5-6, используя 2,3 мм плоское лезвие и установите амплитуду колебаний, чтобы покрыть всю ширину спинного мозга. Лезвия получаются из изобразительных инструментов науки Инк (Foster City, CA) и модифицированы для рваная рана спинного мозга. Поддержание амплитуда колебаний лезвие на уровне ≥ 0,5 мм, а более низкие уровни амплитуды будет уменьшаться легкость шнур разрыв.
- Установить стабилизатор позвоночника и мыши на сцене Лизы. Лезвие крепится к LISA с его положением управляется микродиффузоры поддерживает три диапазона движения. Компоненты Лиза и их функции описаны на рисунке 1.
- Мощность лезвие вибрирующей выключатель. Под Magnification, переместить мышь так, чтобы открытые спинного мозга расположены непосредственно под вибрирующим лезвием.
- Поднимите этапе поддержки мыши к вибрирующий нож. "0" записывается, когда лезвие едва касается заднюю вену спинного мозга. Измерьте глубину разрыв спинного шнура по отношению к "0".
- Поднимите этапе положение микро-драйверов управления: 360 ° поворот микро-водитель поднимает ручку сцене на 0,25 мм. Таким образом, 0,75 мм поражение спинного гемисекция создается путем поворота микро-водитель ручку 3 раза. Точность поражения составляет ± 0,01 мм. Поскольку лопасть начинает разрывать спинного мозга, смазывать операционное поле солевым раствором орошения. Глубина реза спинного мозга контролируется вертикальной микро-водитель и не зависит от визуальной ориентации.
- После того, заданную глубину не было достигнуто, повернуть вибрирующей выключатель. В идеале, вибрирующий нож позиционируется в лesion разрыв без признаков деформации ткани. Опустить столик от режущего диска и удалить кровь и физиологического раствора операционное поле с помощью ватного ватные палочки. Гемостаз происходит спонтанно в <1 мин.
- Отпустите кнопку мыши, от позвоночника стабилизатора. Приблизительная параспинальных мышцы использованием 6-0 шовный шелк и закрыть кожной раны использованием нержавеющей стали Мишель клипов.
3. Уход за животными
- Подкожно вводят в общей сложности 1-2 мл физиологического раствора для поддержания адекватного уровня гидратации и поместить курсор в клетку восстановления на грелку а приходя в сознание.
- Обеспечение водой и безалкогольными экспромтом еду и администрирования анальгетиков в течение 48 часов после операции. Там нет необходимости для мочевого пузыря помощи после спинной гемисекции спинного мозга.
Representative Results
Иммобилизация целевой позвонка имеет большое значение в создании точного поражения спинного мозга мыши. Наш позвоночник стабилизирующего устройства преодолевает анатомические вопросы коротких остистых отростков и вентральной лордоза позвоночника шейки мыши. Шейных позвонков хорошо подвергается с помощью нашего шейного отдела позвоночника стабилизатором (рис. 2). Наши мыши позвоночника стабилизирующего устройства является надежный способ, чтобы подготовить для позвоночника шейного отдела спинного процедур мозга. Глубину поражения использованием Лиза с точностью до 0,01 мм 6,13. Точная рваная рана не вызывает контузию на поражение / ткань интерфейс (рис. 3). Точность поражения спинного гемисекция была продемонстрирована в мышах C57BL / 6 в исследовании на регенерацию аксонов в которой 0,9 мм в глубину разрыв расширен только вне центрального канала в каждом образце подтверждено патологических участках спинного мозга 1. Передвижение всех этих животных восстанавливатьЭд после этой травмы спинного разрыв мозга.
Рисунок 1. (A) мышь в позвоночнике стабилизатору на сцене Лизы. Вибрирующий лезвие направлено на спинной мозг быть рваной. Micro-водитель управления расположены под сценой и предназначены для позиционирования мыши в соответствующем сайте. Вертикальная микро-водитель управляет глубиной поражения, и Регулятор наклона горизонтальной плоскости спинного мозга для предотвращения углами рваная рана. На выключатель контролирует вибрацию двигателя, а другой регулятор амплитуды. (B) 0,75 мм поражением спинного сократить разрыв гемисекция под арками ламинарного нетронутыми.
Рисунок 2. (А) Стабилизатор мышь позвоночника, состоящий из U-образного канала и две руки и разъемов. Мышь помещают в корыто C используется для шейки SCI и в Т желоб для грудных ТСМ. (B) шейного отдела позвоночника фиксируется путем размещения руки под боковыми гранями, а затем блокировки винты с накатанной головкой. Длительность подвергается между пластинками С5-6, C6-7 и C7-T1 без удаления кости.
Рисунок 3. Четыре спинной рваные раны спинного мозга на глубине 0,5, 0,8, 1,1 и 1,4 мм наблюдали в сагиттальной просмотр (крезиловый-фиолетовой окраски и эозином), изображающие высокой точностью с помощью этой техники.
Discussion
Стабилизации позвоночного до рваной раны травмы спинного мозга была получена фиксацию остистых отростков. Оба шейного отдела позвоночника лордотический кривой и крепления зажимов к рыхлые короткие шейки остистых отростков от С3 до T1 в мышь предотвратить эффективной стабилизации позвоночника. Кроме того, использование лезвия бритвы или microscissors использованы в ручном режиме вызывает значительные деформации ткани, которая создает изменчивость в глубину поражения 6. Это может привести к искажению данных, в частности при регенерации аксонов специфических путей изучается. Например, избавлены спинной аксонов кортикоспинальных может быть неверно истолкованы как регенерированный аксонов, если спинной кортикоспинальных тракта не была полностью перерезана во время lesioning. Эти проблемы могут быть преодолены с помощью устройства стабилизации позвоночника с фиксацией в граней на одном уровне и точное lesioning из спинного мозга. Кроме того, использование ахIGH частоты вибрирующий нож производит резкий разрыв без дробления или contusing соседних спинного мозга. Этот метод был использован для производства рваная рана спинного мозга у крыс травм 9,12,14, с последующими изменениями, чтобы произвести рваные раны грудного отдела спинного мозга в мышах 6. В настоящем сообщении мы опишем метод создания надежной поражениях шейки матки Разрыв в мышь.
Поскольку передне-задний диаметр спинного мозга <2 мм в мышь, точные глубины поражения рваная рана имеют жизненно важное значение в создании надежной экспериментальной модели. Минимальная изменчивость в глубину поражения существенно изменят результаты экспериментов оценки регенерацию аксонов, а также объемные и поведенческих исследований. Точность поражения глубины с использованием этого метода составляет ± 0,01 мм, потому что мы использовали высокой точностью микродиффузоры для управления положением режущего лезвия. Этот метод сократил непоследовательность вкогерентное в других моделях создания рваная рана ТСМ. Этот метод особенно полезен при изучении регенерацию аксонов длинного спинного мозга путей, расположенных в спинном половины спинного мозга, таких как корково-кишечного тракта, тракт rubrospinal и спинной восходящей тракта. С помощью этого метода, эти волокна трактов может быть полностью и надежно перерезана. В этом отношении, ошибки интерпретации данных сводятся к минимуму, что повышает надежность отчетности экспериментальных исследований по ТСМ.
Таким образом, мы описали новый метод для создания воспроизводимых в естественных условиях модель травмы шейного отдела спинного мозга в рваной раны мыши. Этот метод основан на стабилизации позвоночника путем фиксации шейного граней и рваная рана спинного мозга использованием вибрирующий нож. С помощью этого метода в спинной грудного отдела спинного модели рваная рана шнура у мышей 6 мы показали, тесная корреляция между глубиной рваная рана, гистологии иПоведение восстановления. Такой метод также было обнаружено, что надежный несколько других лабораторий 2,12.
Disclosures
- Ряд авторов (YPZ, XMX, CBS) иметь финансовую заинтересованность в Луисвилле Импактор System, Inc
- Авторы, Чжан Йи Пин, Лиза BE щиты и Кристофер Б. Шилдс, являются сотрудниками Нортон Healthcare, Луисвилле, штат Кентукки. Другие авторы являются сотрудниками Университета Индианы, Индианаполис, Индиана.
- Авторы не получают финансирование от любой компании, которые производят реагентов или инструменты, используемые в этой статье.
Acknowledgments
Развитие этого устройства была поддержана LISA Ко, Луисвилле, штат Кентукки. Мы также признаем, постоянной поддержке Нортон здравоохранения, Луисвилл, Кентукки, чтобы CBS и NS050243 NIH, NS052290 и NS059622 к XMX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
