Summary
Bir tekrarlanabilir oluşturmak için bir roman tekniği
Abstract
Genetiği değiştirilmiş farelerin kullanımı böyle bir omurilik yaralanması (SKY) gibi çeşitli nörolojik bozukluklar altında yatan moleküler mekanizmaları anlayışımız artırır. SCI bir laserasyon modeli üretmek için kullanılan serbest manuel kontrol genellikle ezmeyin veya kontüzyon bileşen ve bu nedenle, yeni bir teknik geliştirildi ile ilgili tutarsız yaralanmaları oluşturur. Servikal laserasyon SCI Bizim modeli) vertebra faset sabitleme, 2 ile) gelişmiş omurilik maruz servikal vertebra stabilizasyonu 1 dahil ederek serbest yöntemi ile doğal sorunların ortadan kalktığını ve 3) omurilik bir tekrarlanabilir laserasyon yaratılması salınan bir bıçak kullanarak ilişkili kontüzyon olmadan derinlemesine ± 0.01 mm doğruluk. Böyle bir neşter ya da makas serbest kullanımı gibi bir SCI laserasyon oluşturma standart yöntemlerle karşılaştırıldığında, bizim yöntem tutarlı bir lezyon üretti. Bu yöntem corticosp bir aksonal rejenerasyon çalışmaları için yararlıdırinal, rubrospinal ve dorsal artan yolları.
Introduction
Genetik olarak değiştirilmiş farelerin durumu SCI mekanizmalarında rol oynayan spesifik genlerin etkilerini belirlemek için güçlü bir araçtır. Yırtığı SCI bu yaralanma 8 sonra etkili bir tedavi sağlayabilir terapötik ajanlar veya moleküller incelemek için kullanılan önemli bir modeldir. Farelerde laserasyon yaralanma oluşturulması sırasında spinöz süreçleri Tespit nedeniyle spinal fiksasyon 5,11 bakımı ile ilgili ince ve kırılgan spinöz süreçleri kavrama zorluk için kesin olmayan. Sadece 0.2 mm (fare omurilik çapının% 10) laserasyon derinliği değişkenlik verilerin yanıltıcı yorumlanması neden olur. Omurilik kesisi lezyonun doğası ve kapsamı tam 10 tanımlanmalıdır. Bu sorunu gidermek için, biz vertebra stabilizasyonu oluşan yeni bir teknik geliştirdi ve Louisville Sakatlık Sistemi Aparatı bağlı fabrikasyon bıçak kullanmış (LISA) bir kesi SCI 7,14 üretmek. Bu yaralanma laserasyon sürecinde doku deformasyon kaçınılması keskin salınan bıçak kullanılarak oluşturuldu. Laserasyon derinliği laserasyon derinliğini kontrol mikro-sürücüleri kullanarak 0.01 mm doğrulukla hassas oldu. Kesme bıçakları istenen laserasyon kontur 9 oluşturmak için belirli şekil ve genişlikleri için-özel yapılır. Biz, 1), servikal omurga maruz kalma, 2'nin yöntemi) karşılıklı bir yönüyle sabitleme cihazı kullanılarak omurga sabitleme tekniği ve titreşen bir bıçak kullanarak bir yırtılma servikal yaralanma 3) oluşturulmasını göstermektedir.
Protocol
1. Omurga Sabitleyici hayvan Hazırlama ve Uygulama
Fare servikal ventral olarak lateral görünümü görüldüğü içbükey olduğunu. C3 ila T1 spinöz proses küçük ve hassastır ve genellikle 3,4 tarif edildiği gibi, bu nedenle vertebra stabilizasyonu için uygun değildir. Biz omurga stabilizasyonu yan faset sabitleme tarafından yapılmalıdır öneririz. Tesbit yanal olarak her bir düzlük için kelepçe fare ve ayarlanabilen iki paslanmaz çelik kol desteklemek için bir U-şekilli metal kanal oluşur. Bu hedef vertebra mükemmel immobilizasyon sağlar. Spinal fiksasyon sonra, omurga biraz omurilik daha iyi poz sağlamak için servikal eğrilik düzleştirmek için yükselir.
- Forseps, microscissors 2 çift, bir 30 G iğne, dikiş ve iğne tutucu, cilt klipleri ve klip aplikatör 2-3 çiftleri: Aşağıdaki cerrahi aletler sterilize edin. Omurga sabitleyici dezenfekte edin. AnesKetamin / Ksilazin (100 mg / 10 mg / kg) intraperitoneal kokteyl kullanarak fare thetize. Fare boynundan saç tıraş.
- Bir povidon-iyot çözeltisi ve% 70 alkol ile cilt temizliği sonra, bir ısıtma yastığı ile ısındı ameliyat masası üzerine fareyi hareket ettirin. Kornea kurumasını önlemek için oftalmik merhem ile hayvan gözleri Kapak.
- Anestezi (fare bir kuyruk tutam cevap vermediğinde ulaştı) oluşturulduktan sonra, alt servikal deri altı yağ-pad için oksiput bir posterior servikal orta hat cilt kesi yapmak. Büyütme altında, C2 de trapez kasları arasında bir orta hat kesi yapmak ve semispinalis kapitis kasları bölünmüş. Submüsküler yağ yastığı belirlenmesi doğru katmanda diseksiyonu kolaylaştırır.
- Güvenilir bir dönüm noktası olarak hizmet veren T2 spinöz proses için kaudal orta hat kas diseksiyonu uzatın. T2 vertebra bağlı kas kesin ve T2 kıkırdak kısmını çıkarınspinöz proses.
- Mikro bir makas kullanarak T2 lamina aracılığıyla C2 paraspinal kaslar parçalara ayır. Kas diseksiyonu spinöz süreçleri bitişik başlar ve faset eklem iki taraflı uzanır. Kanamayı en aza indirmek için, spinöz süreçleri ve lamina (periosteal katmanında) hemen bitişiğinde kasları ayırın. Lateral yönleri maruz sonra LISA aşamasının U-şekilli kanal üzerinde fare.
- Bilateral maruz yönü altında paslanmaz çelik kolları takın. Silah devreye girdikten sonra, omurga hareketsiz çelik silah başparmak vidaları sıkın. Bu hedef vertebra firma tespit korur ve mükemmel pozlama sağlar. Kollar omurga tam yatay yönünü sağlamak için ayarlanabilir.
- Dura altında yatan ortaya çıkarmak için, C5 ve C6 arasındaki ligamentum flavum İnsizyon. Interlaminar alanı arasında, microscissors yerleştirilir, üzerinden küçük bir durotomy oluşturmak için 30 G iğne kullanındurotomy uzatmak. Omurilik şimdi kontrollü laserasyon lezyon geçmesi hazırlanmıştır.
2. LISA Cihaz Kullanımı Servikal Omurilik yırtığı
- Servikal spinal kord genişleme genişliği farklı seviyelerde değişir. Bir 2.3 mm düz bıçak kullanarak C5-6 bir sırt hemiseksiyona lezyon yapın ve omurilik tüm genişliğini kapsayacak şekilde titreşim genliği ayarlayın. Bıçaklar Güzel Bilim Araçları A.Ş. (Foster City, CA) elde edilen ve omurilik yaralanması için değiştirilir. Düşük genliğe seviyeleri kord yaralanması kolaylığı azalacak şekilde, ≥ 0.5 mm bıçak titreşim genliği koruyun.
- LISA sahnede omurga sabitleme ve fare yerleştirin. Bıçak hareket üç aralıklarının sahip mikro-sürücüleri tarafından kontrol konumu ile Lisa takılır. Lisa ve bunların işlevleri bileşenleri Şekil 1 'de tarif edilmektedir.
- Güç bıçak-titreşimli anahtarı. Magnif altındamaruz omurilik titreşimli bıçak altına doğrudan konumlandırılmış böylece ication, fareyi hareket ettirin.
- Salınan bıçak doğru fareyi destekleyen sahne yükseltmek. Bıçak ancak omurilik dorsal ven dokunduğunda "0" konumuna kaydedilir. "0" pozisyonuna göre, omurilik yaralanması derinliği ölçün.
- Mikro-sürücü kontrolü ile sahne konumunu yükseltmek: mikro-sürücü topuzu bir 360 ° dönüş 0,25 mm sahne yükseltir. Bu nedenle, 0,75 mm sırt hemiseksiyona lezyon mikro sürücü kolu 3 kez çevrilerek oluşturulur. Lezyonun doğruluğu ± 0.01 mm'dir. Bıçak omurilik lacerate başladığında, tuzlu sulama ile cerrahi alan yağlayın. Omurilik kesme derinliği dikey mikro-sürücü tarafından kontrol ve görsel rehberlik bağımsızdır.
- Önceden belirlenmiş derinlik ulaşıldığında, titreşimli anahtarını kapatın. İdeal olarak, salınan bıçak l konumlandırılmışdoku deformasyon delil olmadan esion boşluğu. Kesme bıçağı gelen sahne indirin ve pamuk Q-ipuçlarını kullanarak cerrahi alanında kan ve tuzlu çıkarın. Hemostaz <1 dakika içinde kendiliğinden oluşur.
- Omurga sabitleyici gelen fareyi bırakın. 6-0 ipek sütür ve cilt kapatın kullanarak paraspinal kaslar Yaklaşık paslanmaz çelik Michel klipler kullanarak yara.
3. Hayvan Bakımı
- Subkutan bilinç kazanmak ise yeterli hidrasyon korumak ve bir ısıtma yastığı kurtarma kafeste fare yerleştirmek için serum fizyolojik 1-2 ml toplam enjekte.
- Su ve yumuşak gıda reklam lib sağlamak ve 48 saat sonrası ameliyat için analjezikler yönetmek. Omurilik dorsal hemiseksiyona sonra mesane bakımı için gerek yoktur.
Representative Results
Hedef vertebra immobilizasyonu fare omurilik lezyonları hassas üreten büyük önem taşımaktadır. Bizim omurga stabilizasyon cihaz kısa spinöz süreçleri ve fare servikal ventral lordoz anatomik sorunları üstesinden gelir. Servikal vertebra de bizim servikal sabitleyici (Şekil 2) ile maruz kalmaktadır. Cihaz stabilize Bizim fare omurga servikal omurilik işlemleri için omurga hazırlamak için güvenilir bir tekniktir. LISA kullanarak lezyonun derinliği 0.01 mm 6,13 için doğrudur. Kesin laserasyon lezyon / doku arayüzü (Şekil 3) hiçbir kontüzyon neden olur. Dorsal hemiseksiyona lezyonların hassas bir 0.9 mm derinliğinde kesi sadece omurilik 1 patolojik bölümleri ile teyit her numunede merkezi kanal ötesine hangi aksonal rejenerasyon üzerine bir çalışmada C57BL / 6 farelerde gösterilmiştir. Bu hayvanların tüm hareket kurtarmakBu omurilik kesisi yaralanma sonrası ed.
Şekil 1,. (A) Lisa sahne üzerine yerleştirilen omurga sabitleyici fare. Titreşimli bıçak yırtılmış için omurilik doğru yönlendirilir. Mikro-sürücü kontrol sahne altında bulunan ve uygun site içinde fare konumlandırmak için tasarlanmıştır. Dikey mikro-sürücü lezyon derinliği kontrol ve devirme topuzu yırtık açılanma önlemek için omurilik yatay düzlem kontrol eder. Açma-kapama düğmesi titreşim motoru kontrol eder ve başka bir düğme ile genlik ayarlar. (B) 0.75 mm sırt hemiseksiyona laserasyon lezyon sağlam laminer kemerler altında kesti.
Şekil 2. (A), U-şekilli bir kanalı ve iki kol ve konektörler oluşan fare omurga sabitleyici. Fare servikal SCI için kullanılan C çukur ve göğüs SCI için T çukur yerleştirilir. (B) servikal lateral yönü altında silah yerleştirerek ve sonra başparmak kilitleme vidaları ile sabitlenmiş olduğunu. Dura kemik herhangi bir temizleme olmadan C5-6 lamina, C6-7, ve C7-T1 arasında maruz kalmaktadır.
Şekil 3. 0.5 derinliklerinde, 0.8, 1.1, ve sagital görünümü (leke kresil-mor ve eozin) gözlenen 1.4 mm Dört dorsal spinal kord laserasyon bu tekniği kullanarak hassas yüksek derecede tasvir.
Discussion
Omuriliğe laserasyon yaralanmaları önce vertebra stabilizasyonu spinöz süreçleri tespit ile elde edilmiştir. Fare T1 ile C3 oynak kısa servikal spinöz süreçlerine kelepçeler servikal lordoz ve eki hem etkili omurga stabilizasyon önlemek. Ayrıca, manuel kontrol lezyonun 6 derinliği değişkenlik oluşturur önemli doku deformasyon neden altında kullanılan bir jilet veya microscissors kullanın. Bu özel yolların aksonal rejenerasyon incelenmiştir özellikle verilerin yanlış yol açabilir. Dorsal kortikospinal yolu tamamen lezyon sırasında nakledilmiştir değildi Örneğin, bağışladı dorsal kortikospinal akson yeniden akson olarak yanlış olabilir. Bu sorunlar tek bir seviyesi ve omuriliğin kesin lezyon de yönleriyle için tespit ile bir omurga stabilizasyon cihazı kullanılarak aşılabilir. Buna ek olarak, ah kullanılaraküksek frekans salınan bıçak komşu omurilik kırma veya contusing olmadan keskin bir kesi oluşturur. Bu yöntem, farenin 6 toraks omurilik laserasyon üretimi için müteakip değişiklikler ile birlikte, 9,12,14 sıçanlarda omurilik yaralanması yaralanmaları üretmek için kullanılmıştır. Mevcut iletişim olarak, fare güvenilir servikal laserasyon lezyonların oluşturma yöntemi açıklanmaktadır.
Omurilik ön-arka çapı fare <2 mm olduğu ölçüde, laserasyon lezyonun kesin derinliklerinde güvenilir bir deneysel model oluşturmada önemlidir. Lezyon derinliği minimal değişkenlik önemli ölçüde akson rejenerasyonu yanı sıra hacim ve davranış çalışmaları değerlendirmek deney sonuçları değiştirecektir. Biz kesme bıçağı yerini kontrol etmek için yüksek hassasiyetli mikro-sürücüler kullanılır, çünkü bu yöntemi kullanarak lezyon derinlik hassasiyeti ± 0.01 mm'dir. Bu yöntem, en tutarsızlık azalttıbir yırtık SCI yaratma diğer modellerinde herent. Bu yöntem, kortikospinal sistem, rubrospinal sistem ve dorsal artan sistemi gibi omurilik dorsal yarısında bulunan uzun omurilik yolakların aksonal rejenerasyon inceleyerek özellikle yararlıdır. Bu yöntemle, bu lif yolları tamamen olması ve güvenilir transeksiyon olabilir. Bu bağlamda, veri yorumlama hataları böylece SCI üzerinde deneysel çalışmalar raporlama güvenilirliğini geliştirerek, en aza indirilir.
Özetle, biz fare servikal spinal kord yaralanması yırtık in vivo modelinde bir tekrarlanabilir oluşturmak için yeni bir teknik tarif var. Bu teknik bir salınım bıçak kullanarak omurilik servikal yönleri ve yırtık tespit ile omurga stabilizasyon dayanmaktadır. Fareler 6 bir dorsal torasik omurilik kesisi modelinde Bu yöntemi kullanarak, biz laserasyon derinliği, histoloji ve arasında sıkı bir korelasyon gösterdidavranış kurtarma. Böyle bir teknik, ayrıca çok sayıda diğer laboratuar 2,12 ile güvenilir olduğu bulunmuştur.
Disclosures
- Bazı yazarlar (YPZ, XMX, CBS) Louisville Darbeli System, Inc bir mali ilgi var
- Yazarlar, Yi Ping Zhang, Lisa BE Shields ve Christopher B. Shields, Norton Sağlık, Louisville, KY çalışanlarıdır. Diğer yazarlar IN Indiana Üniversitesi, Indianapolis, tarafından istihdam edilmektedir.
- Yazarlar bu makalede kullanılan reaktifler veya araçlarında herhangi bir şirket fon almadı.
Acknowledgments
Bu cihazın geliştirilmesi LISA Co, Louisville, Kentucky tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Norton Sağlık, Louisville, CBS için KY ve NIH NS050243, NS052290 ve XMX için NS059622 devam eden desteği kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
