Påvisning af protein palmitoylering i dyrkede hippocampale neuroner ved immunopræcipitation og Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Summary

Den reversible tilsætning af palmitat til proteiner er en vigtig regulator af intracellulært protein trafficking. Dette er af særlig interesse i neuroner, hvor mange synaptiske proteiner palmitoylated. Vi anvender en enkel biokemisk metode til at påvise palmitoylated proteiner i dyrkede neuroner, som kan tilpasses til flere celletyper og væv.

Abstract

Palmitoylering er en posttranslationel lipid modifikation involverer fastgørelsen af en 16-carbon-mættede fedtsyre, palmitat, at cysteinrester af substratproteiner via en labil thioesterbinding [revideret i ^1]. Palmitoylering af et substrat-protein øger dets hydrofobicitet, og typisk letter handel mod cellulære membraner. Nylige undersøgelser har vist, palmitoylering at være en af de mest almindelige lipid modifikationer i neuroner ^{1, 2,} hvilket antyder, at palmitat omsætningen er en vigtig mekanisme, ved hvilken disse celler regulerer målretning af og handel med proteiner. Den identifikation og detektion af palmitoylated substrater kan derfor bedre vores forståelse af protein handel med neuroner.

Påvisning af protein palmitoylering tidligere er blevet teknisk hindret på grund af manglen på en konsensussekvens blandt substratproteiner, og afhængigheden af ​​metaboliske labeling palmitoyl-proteiner med ^3H-palmitat, en tidskrævende biokemisk assay med lav følsomhed. Udvikling af Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay muliggør hurtigere og høj følsomhed påvisning af palmitoylated proteiner ^2-4, og er optimalt for måling af dynamisk omsætning palmitat på neuronale proteiner. The ABE assay består af tre biokemiske trin (figur 1): 1) irreversibel blokering af umodificerede cystein-thiolgrupper med N-ethylmaliemide (NEM), 2) specifik spaltning og demaskering af palmitoyleret cystein er thiolgruppe af hydroxylamin (HAM), og 3) selektiv mærkning af palmitoyleret cystein under anvendelse af en thiol-reaktiv biotinyleringsreagens, biotin-BMCC. Oprensning af de thiol-biotinylerede proteiner efter de ABE skridt er forskelligt, afhængigt af det overordnede mål for forsøget.

Her beskriver vi en fremgangsmåde til oprensning af en palmitoyleret protein af interesse i primære hippocampal neuroner efter en første immunpræcipitering (IP) under anvendelse af et antistof rettet mod proteinet, efterfulgt af ABE assay og western blotting for direkte at måle palmitoylering niveauer af dette protein, som betegnes den IP-ABE assay. Low-density kulturer af embryonale rotte hippocampus neuroner er ofte blevet brugt til at studere lokalisering, funktion og handel med neuronale proteiner, hvilket gør dem særdeles velegnede til at studere neuronal protein palmitoylation ved hjælp af IP-ABE assay. IP-ABE assay hovedsageligt kræver standard IP og western blotting-reagenser, og er kun begrænset af tilgængeligheden af ​​antistoffer mod målsubstratet. Dette assay kan let tilpasses til oprensning og påvisning af transficerede palmitoylated proteiner i heterologe cellekulturer, primære neuronale kulturer afledt fra forskellige hjernevæv af både mus og rotter, og selv primært hjernevæv selv.

Protocol

1. Ekstraktion af målprotein fra dyrkede primære hippocampus neuroner

1. Før høst endogent protein fra primære hippocampale celler, fremstilling af en lysisbuffer (LB, tabel 1) med proteaseinhibitorer. Til 10 ml lysisbuffer, 0,1 ml phenylmethansulfonylfluorid opløsning (PMSF) tilsættes til en slutkoncentration på 10 mM, og der tilsættes 1 protease inhibitor cocktail tablet.
2. Fremstilling af N-ethylmaleimid (NEM) opløsning (tabel 1) fra lyofiliseret pulver. Forsigtigt opløses i 100% EtOH ved stuetemperatur (RT). Altid forberede NEM løsning frisk for dagen af ​​forsøget.
3. Næste kombinere lysisbuffer og NEM. Tilsæt 0,5 ml 2 M NEM opløsningen til et frisk 50 ml konisk rør. Der tilsættes 20 ml LB over toppen, og hurtigt sted LB + NEM (slutkoncentration på 50 mM) på en vippende platform ved 4 ° C til fuldt blandes i 5 min. Altid tilføje NEM / EtOH opløsning første og LB sekund, for på passende blande de to.
4. Fjern dyrkede neuroner fra kuvøse og sted på is *. Forsigtigt fjerne cellulære medier, og forsigtigt vaskes to gange med koldt phosphatbufret saltvand (PBS) 1x. Tilsæt 300 ml LB + 50 mM NEM til den første brønd i hippocampale neuroner, og skrabemærker celler under anvendelse af en engangs cell lifter. Opsamling af cellelysatet, så aflade lysatet til den næste brønd i denne gruppe. Skrab celler inden den anden godt bruge cellen løfteren, indsamle, og gentag med en tredje brønd, hvis det er nødvendigt for yderligere at koncentrere lysatet.
5. Collect cellelysat i en forud afkølet (på is), 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gentag trin 1,4 ved anvendelse af 100 ul LB + 50 mM NEM at indsamle eventuelle resterende cellelysat. Pass total cellelysat gennem en 26 ½ gauge sprøjte 5-6 gange for at hjælpe med mekanisk lysis, være omhyggelig med at ikke blæse bobler i opløsningen. Man kan i stedet sonikeres i 15 sekunder på is, hvis udstyr er til rådighed. Nutate cellelysat i ≥ 30 min ved 4 ° C.
6. Afklar cellen lysAte ved centrifugering ved 16.000 x g / 30 min, for at pelletere un-lyserede celler og detergent-uopløseligt materiale.
7. Collect ryddet cellelysat (supernatant) i et nyt for-kølet 1,5 ml rør på is. Gentag høst protokol for alle grupper af celler. Foranstaltning proteinkoncentration i alle lysatprøver med BCA-analyse, og normalisere mængden af ​​alle lysatprøver fra grupper af celler har præcis samme totale protein, med et acceptabelt minimum af 500 ug. Fyld alle prøver med LB + 50 mM NEM til 500 pi samlede volumen.
8. Tilføj 1-5 ug af primært antistof rettet mod målproteinet til hver af lysatprøve. Nutate de antistof-lysat blandede prøver natten over ved 4 ° C.

* Primære rotte hippocampale neuroner bør dyrket ved en tæthed på 250.000 celler / brønd i en 6-brønds skål, i et serumfrit medium indeholdende en B27 neuronal supplement, som tidligere beskrevet ^5, og dyrket i ønsketd tidsrum, typisk 14-16 dage in vitro (DIV) til at nå modenhed. Mindst 500 pg totalt protein anbefales at held immunpræcipitere og biotinylere et mål neuronal protein, hvilket typisk kræver 2-3 brønde i en 6-brønds skål.

2. Præcipitation af antistof-bundet målprotein

1. Før udfældning og immobilisering af et målprotein fremstilles der en 50% opslæmning af protein A-eller protein G-belagte sepharoseperler. Specifikt tilsættes ≥ 60 pi sepharoseperler per prøve til 1,5 ml rør og sikre, at alle prøver er ens mængder perler. Magnetiske perler er også egnede, hvis udstyr er til rådighed.
2. Tilsættes et lige volumen af ​​50% opslæmning til hver antistof-lysatprøve, og nutate i ≥ 1 time ved 4 ° C.

3. Acyl-Biotin Exchange: Hydroxylamin (HAM) Cleavage

1. Under udførelsen af ​​trin 2,2, forberede et antal rør med lysisbuffer (LB) different pH-værdier. PH er meget vigtigt for disse trin, og bør altid justeres med et pH-meter. Fremstilling af 2 ml LB pH 7,2 per prøve, og 0,5 ml Stringent buffer per prøve (tabel 1). Også forberede 0,5 ml LB + 10 mM NEM per prøve, som i trin 1.1-1.3. Tilføj PMSF og proteasehæmmere tabletter til alle lysis buffere, som i trin 1.1.
2. 1. Hydroxylamin (HAM) er et kraftigt reduktionsmiddel, hvis spaltning af palmitat fra cysteiner er nødvendig til biotinylering (figur 1), og udeladelsen af den HAM spaltning tjener som en negativ kontrol. Opdele hver prøve af perler i to prøver, en udeladelse af HAM spaltningstrin (-HAM), og en herunder HAM trin (+ HAM). At normalisere for proteinnedbrydning forårsaget af HAM behandling, bør man opdele hver prøve i tredjedele, med 1/3 af de perler, der anvendes til-HAM kontrol, og de resterende 2/3 anvendes til + HAM behandling.
   2. Udarbejde yderligere 1.5 ml rør på is, der er mærket som-HAM kontrol for hver prøve. Efter trin 2.2, centrifugeres forsigtigt alle prøver 'perler ved 0,5 x g / 1 min ved 4 ° C (centrifuge ved denne hastighed, varighed og temperatur i alle resterende trin med mindre andet er angivet), anbringe rørene på is, supernatanten fjernes, og genopslæmmes perlerne i 600 ul LB + 10 mM NEM.
3. Efter re-suspension af prøver "perler i lysepuffer + NEM 10 mM, indsamle straks 200 pi prøvens lysat-perle gylle og udledning til at prøvens-HAM rør på is. Tilføje yderligere 300 pi LB + 10 mM NEM til-HAM prøve, og yderligere 100 pi til + HAM prøven i alt 500 pi i hver prøve. Inkuber rørene i 10 minutter på is.
4. Resuspendere (vask) the-HAM og + skinke prøver forsigtigt med 0,5 ml stringent buffer, pr. Prøve Udføre dette trin hurtigt, som længere SDS inkubation vil resultere i fjernelse af bundet antistof fraperler.
5. Vask forsigtigt alle prøver tre gange i 0,5 ml / prøve af LB pH 7,2, og spin ned mellem hver vask som i trin 3.2b.
6. Under udførelsen af trin 3,5, forberede en HAM buffer (Tabel 1). Tilsættes passende rumfang hydroxylaminopløsning til et nyt rør, for at opnå en slutkoncentration på 1 M i et volumen på 0,5 ml LB pH 7,2, pr + HAM prøve. Altid forberede HAM buffer frisk for dagen af ​​forsøget. Tilsæt 0,5 ml / prøve af LB pH 7,2 til all-HAM prøver, og 0,5 ml / stikprøve af HAM buffer til alle + skinke prøver.
7. Nutate alle prøver i 1 time ved stuetemperatur (RT). Må ikke overstige 1 time.

4. Acyl-Biotin Exchange: Biotin-BMCC Labeling

1. Under udførelsen af trin 3,6, forberede 2 ml LB pH 6,2 per prøve (tabel 1), som i trin 3,1. Anbring LB pH 6,2 på is indtil brug. Også forberede en stamopløsning af Biotin-BMCC (tabel 1) umiddelbart før brug. Afvej exacjævnt og 2,1 mg Biotin-BMCC, indsamle i et 1,5 ml rør, og forsigtigt opløses i 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) ved at placere på en vuggende platform ved stuetemperatur, for at opnå 8mM koncentration (brug ikke en pipette til at bryde op pulveret ).
2. Når trin 3,6 er fuldført, forsigtigt vaske perlerne en gang i pH 6,2 lysepuffer, for at fjerne tilbageværende HAM-puffer. Supernatanten fjernes, og placere prøverne på is.
3. Biotin-BMCC er en maliemide konjugeret biotin-molekyle, der har en høj affinitet for frie thiolgrupper i cysteinrester (fig. 1). Under udførelsen af trin 4,2, forberede 0,5 ml Biotin-BMCC Buffer (tabel 1) per prøve, at arbejde koncentration mellem 0,5 uM til 5 uM. Koncentrationer på over 5 uM vil sandsynligvis mætte målproteinet ^6, og typisk bør ikke overskrides, men dette kan variere afhængigt af det ønskede målprotein. Tilsæt 0,5 ml Biotin-BMCC puffer til hver prøve, og nutate i nøjagtigt 1 time ved 4 ° C. Må ikke overstige 1 time.

5. Eluering af Biotin-konjugeret målprotein og SDS-PAGE

1. Når trin 4,3 er færdig, forsigtigt vaske alle prøver en gang i LB pH 6,2. Hold alle prøver på is i mellem hver vask. Fjern 2x SDS-prøvepuffer uden reducerende midler (tabel 1) fra -20 ° C opbevaring og langsomt optøs på is.
2. Vask forsigtigt prøver tre gange i LB pH 7,5 + PMSF / Inhibitorer, og opbevare prøver på is i mellem hver vask.
3. Supernatanten fjernes af den tredje vask, hvilket efterlader de pelleterede perler i en opslæmning med resterende buffer i bunden af ​​røret. Dyp en pipette med en lille diameter spids (en gel loading tip eller P2 pipettespids er tilstrækkelige) ind i selve bunden af ​​glasset gennem opslæmningen, og hurtigt samle eventuelle resterende buffer, og pas på ikke at tage nogen perler.
4. Supplere 2x SDS-prøvebuffer med DL-dithiothreitol (DTT) for at opnå en slutkoncentration på 5 mM. Tilføj40-50 pi 2x Sample Buffer + 5 mM DTT til hver prøve. Om nødvendigt vortex perlerne helt at blive blandet med prøvepuffer, og umiddelbart centrifugeres ved høj hastighed for at indsamle alle perler i en pellet, nedsænket i prøvepuffer.
5. Kog alle prøver i 10 minutter ved 75-80 ° C. Lad prøver afkøles til stuetemperatur i ≥ 10 min på bordpladen, og centrifugeres ved 16.000 xg / 3 min til fuldstændig pellet perlerne.
6. Tilføj fuldstændig mængde eluerede protein (supernatant) fra hver prøve til en enkelt bane i en polyacrylamidgel egnet til western-blotting under anvendelse af SDS-PAGE ^7. Organisere alle prøverne, så-HAM kontrol eluent og + HAM elueringsmiddel for en enkelt prøve køres umiddelbart op til hinanden under SDS-PAGE (Fig. 2). Efter SDS-PAGE, til en PVDF-eller nitrocellulosemembran overføre.

6. Western blotting og påvisning af palmitoylering af målprotein

1. Når trin 5,6 er fuldført, skal du vaske membranento gange i Tris-pufret saltvand (TBS 1x) i 10 minutter på en vippende platform ved stuetemperatur.
2. Der fremstilles en blokerende buffer for at blokere ikke-specifik mærkning ved at afveje bovint serumalbumin (BSA), for at opnå en 3% vægt i et volumen på TBS 1x + Tween-20 0.05% (TBS-T), som er tilstrækkelig til fuldstændig nedsænkes membranen . For streptavidin blotting, altid blokere med BSA og ikke mælkepulver. Blokere membranen i 1 time ved stuetemperatur på en vippende platform.
3. Fremstille en antistof opløsning af TBS-T + 0,3% BSA. Tilsættes Streptavidin-HRP-antistof rekonstitueret med 1 mg / ml i destilleret vand, fortyndet 1:5,000-1:10,000. Når trin 6,2 er fuldført, vaskes membranen en gang i TBS-T i 10 minutter, derefter inkuberes membranen i Streptavidin antistofopløsning på en vippende platform for enten i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
4. Vask membranen tre gange i TBS-T i 10 minutter på en vippende platform. For at detektere palmitoylering signal, udsætte HRP luminescens under anvendelse af en chemiluminescent substrat kit.
5. For at normalisere palmitoylering niveauer til mængden af ​​proteinet af interesse, der blev immunpræcipiteret, strimler membranen ved hjælp af western blot stripping buffer for 5-10 min på en vippende platform ved stuetemperatur. Gentag trin fra 6,1 til 6,4 ved hjælp af primært antistof mod proteinet af interesse, der oprindeligt blev anvendt til immunfældning.
6. Kvantificere palmitoylering af proteinet af interesse ved hjælp af billedanalyse-software, og normalisere palmitoylering niveauer til mængden af ​​immunopræcipiteret protein.

Representative Results

IP-ABE assay specifikt detekterer thiol-palmitoylering af cysteinrester langs substratproteiner, og kan anvendes til at detektere palmitoylering af immunpræcipiterede neuronale proteiner på en måde vist i figur 1.. Behandling af det immunopræcipiterede neuronal protein med HAM (fig. 1) spalter thioester binding mellem palmitat og en cystein s thiolgruppe, hvilket muliggør specifik inkorporering af biotin-BMCC på den nyligt tilgængelige thiolgruppe, som efterfølgende kan påvises under anvendelse af western blotting. Udeladelsen af ​​HAM (minus-HAM) spaltning forhindrer inkorporering af biotin-BMCC og fungerer som en negativ kontrol for specifik palmitoyl-biotinylering af den plus-HAM prøve, og bør derfor altid køres ved siden af ​​plus-HAM prøve til western blotting ved SDS-PAGE (figur 2).

I en optimeret eksperiment (figur 2A), den palmitoyleringsignal af den neuronale protein δ-catenin ² kan let påvises ved blotting for biotin-BMCC ved en koncentration på 1 uM, under anvendelse af streptavidin konjugeret med HRP, mod parallelle minus-og plus-HAM prøver. Den specifikke palmitoylering signal for δ-catenin syne ved sin forudsete størrelse af 160kD, kun i plus-HAM prøve. Specificiteten af ​​dette signal blev bekræftet ved reprobing for δ-catenin med det specifikke antistof, der oprindeligt var anvendt til at immunpræcipitere det, hvilket resulterer i et signal i begge HAM behandlinger på samme forudsagte størrelse. Optimering af IP-ABE assay (figur 2A) vil resultere i en western blotting profil af en minus-HAM prøve, som let kan skelnes fra den plus-HAM prøve, og udviser minimal eller ingen palmitoylering signal.

Koncentrationen af ​​biotin-BMCC til at mærke palmitoylated cysteiner kræver omhyggelig optimering, og hvis en super-mættende koncentration af biOtin-BMCC bruges de ABE kemi trin (figur 2B), overdreven baggrund og ikke-specifikke signaler vil være synlige. Et lineært respons-kurven for biotinylering af en palmitoyleret neuronal protein, α7 nicotin-acetylcholin-receptor ved anvendelse af biotin-BMCC er tidligere blevet bestemt ⁶ og viser næsten fuldstændig mætning ved en koncentration på 5-10 uM. Selv om den optimale koncentration af biotin-BMCC vil afvige en smule afhængigt af den neuronale målprotein, vil behandling med biotin-BMCC i en koncentration på over 5 uM sandsynligvis super-mætte målproteinet, og resultere i en western blot profil med synlig baggrund og ikke-specifikke signaler. En koncentration på 0,5 uM til biotin-BMCC er tidligere blevet anvendt til at detektere palmitoylering af andre neuronale proteiner, herunder SNAP-25, huntingtin, AMPA-receptor-underenheder GluA1 og GluA2, og paralemmin ^8, og bestemmelse af den optimale koncentration for en hidtil ukendtmålprotein kan opnås ved forsøg-fejl lineært, som begynder i området fra 0,5 til 5 uM, som er beskrevet her. De resulterende streptavidin western blot profiler blandt de minus-og plus-HAM prøver til δ-catenin palmitoylation ligne, når de behandles med 4 uM biotin-BMCC (figur 2B), med yderligere baggrund signaler ved forskellige størrelser, hvilket indikerer, at uhensigtsmæssig biotinylering opstod.

Hydroxylamin er et effektivt reduktionsmiddel, som resulterer i begrænset nedbrydning af målproteinet i tillæg til dens effektive spaltning af thioester-binding. Derfor optimering af ABE kemi nødvendiggør en til at normalisere mængden af ​​immunopræcipiteret protein, der anvendes til minus-og plus-HAM prøver (trin 3,2 til 3,3). Normalisering kræver brug af dobbelt så meget af immobiliseret målprotein i plus-versus den minus-HAM prøve, der faktisk resulterer i skelnes Western blotting profiler for målproteinet, som det er vist for δ-catenin (figur 2A, B). Hvis mængden af ​​immobiliseret målprotein ikke normaliseres mellem minus-og plus-HAM prøver, kan det resulterende Western blot signal for målproteinet i plus-HAM prøve gå tabt, som det er vist for δ-catenin, når lige mængder af protein blev anvendt i både HAM behandlinger (figur 2C).

Specificiteten af ​​ABE kemi til mærkning palmitoylated proteiner er meget følsom og kræver optimering. De fælles faldgruber opstod under IP-ABE assay omfatter de sub-optimale resultater er vist i figur 2B og 2C, og nedbrydning af målproteinet, uafhængig af HAM behandling, som er typisk forårsaget af ældre reagenser og buffere, og forkert pH. For at undgå disse faldgruber og korrigere for optimal ABE kemi, friskhed og koncentrationen af ​​reagenserne, der kræves tilbuffere, der er anført i tabel 1, bør altid undersøges, og pH-justeringer for alle de buffere bør altid kontrolleres, inden du kører eksperimentet.

Buffer		Arbejdskoncentration	Kommentarer
Lysis Buffer (LB)	I destilleret H2O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCI 10% glycerol	N / A	Forbered før eksperiment og opbevar ved 4 ° C
NEM Solution	I 100% EtOH: NEM lyofiliseret pulver	2 M	Fremstilles frisk, umiddelbart før brug.
Stringent Buffer	I LB: 10 mM MEM 0,1% SDS	N / A	Forbered kort før brug, holde på is.
LB pH 7,2	I LB: justere pH til præcis 7,2	N / A	Anvende et pH-meter til indstilling af pH umiddelbart før brug.
HAM Buffer	I LB pH 7,2: Stock HAM løsning	1 M (endelig HAM koncentration)	Forbered umiddelbart før brug.
LB pH 6,2	I LB: pH justeres til præcis 6,2	N / A	Samme som for LB pH 7,2
Stock Biotin-BMCC Solution	I DMSO: 2,1 mg Biotin-BMCC opløsning	8 mM	Forbered umiddelbart før brug.
Biotin-BMCC Buffer	I LB pH 6,2: Tilføj Biotin-BMCC løsning	1-5 uM (endelig biotin-BMCC koncentration)	Forbered umiddelbart før brug.
2x SDS Sample Buffer, ingen reduktionsmidler	I destilleret H2O: 5% SDS 5% glycerol 125 mM Tris-HCL pH 6,8 0,01% bromphenolblåt	N / A	Forberedelse før forsøget, og opbevar ved -20 ° C indtil anvendelse. Supplere med 5 mM DTT før brug.

Tabel 1. Buffere og reagenser nødvendige for IP-ABE assay. Mange af de lyse-buffere kan fremstilles før påbegyndelse af forsøget, men pH-værdien skal kontrolleres og justeres umiddelbart før brug med et pH-meter, for at sikre succes ABE kemi. Størstedelen af ​​stamopløsninger skal tilberedes frisk for hver eksperiment, umiddelbart før brug. Mange af bufferne kræver reagenser, der er fælles for de fleste laboratorier er udstyret til biokemi og specielle reagenser med sælger information, er anført i tabellen over reagenser og udstyr.

Figur 1. Skematisk af Immunopræcipitation og Acyl-Biotin Exchange (IP-ABE) assay til at oprense og detektere palmitoylering af neuronale proteiner. Dyrkede hippocampale neuroner lyseres, (1) et målprotein oprenses derefter under anvendelse af en target-specifikt antistof, og immobiliseret på sepharose perler overtrukket med protein G eller A. Det oprensede target-protein er derefter (2) behandlet med N-ethylmaliemide (NEM) for irreversibelt at binde og blokere frie thiol (-SH)-grupper langs umodificerede cysteiner (C). Målproteinet derpå (3) underkastes behandling med hydroxylamin (HAM), hvilket resulterer i specifik spaltning af thioesterbindinger ved palmitoylated cysteiner og demaskering af en fri palmitoyleret thiolgruppe (-SH). Dernæst målproteinet er (4) treated med en thiol-reaktiv biotinmolekyle, biotin-BMCC, hvilket resulterer i specifikke biotinylering af palmitoyleret cystein. Endelig, (5) det biotinylerede mål-protein elueres og fjernes fra antistoffet og perle. Målproteinet med dets palmitoyleret cystein (er) mærket med biotin er nu egnet til SDS poly-acrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og western blotting med streptavidin til påvisning af for palmitoylering af det oprensede neuronal protein. se større tal .

Figur 2. Påvisning af palmitoylation af den neuronale protein δ-catenin ved hjælp af IP-ABE assay. Primære rotte hippocampus neuroner blev dyrket som præligere beskrevne ^5, ved en densitet på 130 celler / mm ² til udløb ved 14DIV, blev derefter lyseret og underkastet IP-ABE assay til påvisning palmitoylering af et nyligt identificeret palmitoylated neuronal substrat, δ-catenin ^2. Oprenset immunpræcipitater (VP) i δ-catenin (målprotein) blev isoleret under anvendelse af 5 pg af δ-catenin antistof per prøve (BD Transduction Laboratories), og blev derefter underkastet SDS-PAGE parallelt minus-og plus-hydroxylamin (HAM) prøver. Palmitoylering blev detekteret ved Western-blotting (WB) med streptavidin-HRP (palmitoylering), og membranen blev strippet og underkastes en reprobe WB for δ-catenin. (A) En optimeret repræsentative IP-ABE resultat for palmitoyleret δ-catenin (pilespids) behandles med 1 pM biotin-BMCC, illustrerer specificiteten af ABE kemi til detektering af thiol-palmitoylated proteiner fra IP-prøver. (B) En sub-optimale repræsensentant IP-ABE resultat for δ-catenin, hvor et overskud koncentration på 4 uM biotin-BMCC blev anvendt, hvilket resulterede i ikke-specifikke signaler og baggrund i både minus-og plus-HAM prøver (pile). (C) Et andet suboptimal repræsentative IP-ABE WB for δ-catenin, hvor en overdreven 4 uM koncentration af biotin-BMCC blev anvendt, og mængden af protein, der anvendes til plus-HAM IP prøve var ikke normaliseret for HAM-medieret proteinnedbrydning, hvilket resulterer i en tabt signal i reprobe WB for δ-catenin. Klik her for at se større figur .

Discussion

IP-ABE assay præsenteret her er en enkel og meget følsom fremgangsmåde til påvisning palmitoylated proteiner i dyrkede primære hippocampale neuroner ved anvendelse meste standard biokemiske teknikker. Dette gør analysen let at tilpasse til laboratorier, der allerede er udstyret med vestlige blotting materialer. IP-ABE assay kombinerer en standard immunoprecipitation protokol til at isolere og immobilisere ens målprotein efterfulgt af tidligere beskrevet ABE kemi ^2-4 til hurtigt at detektere niveauer af palmitat på et substrat-protein. Den ABE teknik har en bred vifte af applikationer til at undersøge palmitoylated proteiner i forskellige væv og cellelinier, herunder storstilet palmitoyl-proteomisk screening af globale palmitoylering profiler, og hurtig detektion af palmitoylering niveauer af et enkelt mål protein.

Tidligere beskrivelser af ABE kemi har anvendt forskellige metoder cellelyse og detergentekstraktion af neuronal proteins ^{2, 9,} fri thiol-blokade ^{10, 11,} biotinylering, og oprensning af målproteinet ^4, afhængigt af anvendelsen af forsøget. Tilsætningen af ​​palmitat til neuronale proteiner resulterer i deres målretning mod cellulære membraner, og detektion af palmitoyleret del af et målprotein vil kræve dets ekstraktion fra disse membraner. Tidligere beskrevne ABE metoder har anvendt en række ionisk ⁹ og ikke-ioniske detergenter ⁸ at ekstrahere ønskede målproteiner, og anvendelsen af en bestemt detergent afhænger af målproteinet og dets kendte membran handel. Her udnytter vi den ikke-denaturerende og ikke-ionisk detergent IGEPAL CA-630 for at udtrække palmitoylated proteiner, som vi har valideret til udvinding og påvisning af palmitoyleret neuronal protein δ-catenin (figur 2). Strukturen af ​​IGEPAL CA-630 omfatter en voluminøs og stiv ikke-polære hovedgruppe, som ikkeforstyrre native protein konformation eller interaktioner, men som giver sit samarbejde med de hydrofobe regioner membran-associerede proteiner, og dermed gav blandbarhed til dem og tillader deres udvinding. Mange neuronale proteiner lokaliseret i den synaptiske membran eller postsynaptisk tæthed af synapser skal ekstraheres ved hjælp IGEPAL CA-630, men nogle kan ikke fuldstændigt opløseliggøres, og kan kræve anvendelse af et andet ikke-denaturerende detergent såsom Triton X-100, som har er tidligere blevet anvendt til ABE kemi ^{2, 8.}

Flere beskrivelser af ABE kemi har også anvendt et andet thiol-reaktive biotinyleringsreagens fra molekylet denne beskrivelse, kaldet Biotin-HPDP (Thermo Scientific), hvilket nødvendiggør også en anden metode til proteinrensning ^4. Biotin-HPDP er et andet thiol-reaktiv, maliemide-konjugeret biotin-molekyle, der indeholder en disulfidbinding i maliemide linkerarm, strukturelt differentiating det fra biotin-BMCC, som ikke indeholder denne disulfidbinding. Efter thiol-biotinylering af et proteins fri eller palmitoyleret cystein med Biotin-HPDP, kan den resulterende disulfidbinding mellem målproteinet og biotin-gruppen spaltes ved reduktion reagenser til frigivelse biotingruppen og regenerere proteinet i dets umodificerede form, hvilket gør biotinylering af Biotin-HPDP forbigående og reversible. Derfor er brugen af ​​dette biotinyleringsreagens kræver oprensning af et målprotein ved immobiliseret avidin reagenser, såsom streptavidin-belagte kugler. Imidlertid thiol-biotinylering af et målprotein ved biotin-BMCC, som er beskrevet her, er stabile og relativt permanent, og kræver rensning af målproteinet med et antistof rettet mod målet, og immobiliseret på sepharoseperler. Begge ABE teknikker er tidligere blevet anvendt til store skærme, og påvisning af palmitoylering af enkelte proteiner ^{2, 8-10, 12,} ogIP-ABE assay vi beskriver her er optimal til hurtig påvisning af palmitoylation af enkelte neuronale målproteiner.

Et overvældende flertal af cellulær palmitoylation involverer reversible tilsætning af palmitat til thiolgruppen af ​​cysteiner (betegnet S-palmitoylation, som vi generaliserer som 'palmitoylation' i denne protokol), er imidlertid en meget begrænset gruppe af proteiner udsat for irreversibel palmitoylation på glycin og cysteinrester ved dannelsen af stabile amidbindinger, betegnet N-palmitoylering ^13. En begrænsning ved ABE kemi er den manglende evne til at detektere N-palmitoylering grund af stabiliteten af amidbindingen og således screening af et hidtil ukendt målprotein for palmitoylering bør bekræftes ved anvendelse af 3H-palmitat metabolisk mærkning ^1.

Som tidligere nævnt kan IP-ABE assay let tilpasses til undersøgelse palmitoylering i proteinekstrakter fra flere kilder, herunder transfected heterologe cellelinjer, primære væv og primære neuronale kulturer fra forskellige hjerneområder. IP-ABE assay er blevet anvendt til at undersøge palmitoylering tilstrækkeligheden af muterede cystein-til-serin-proteiner for at identificere placeringen af en palmitoyleret cystein langs et målprotein ^8, for at behandle dynamisk palmitat omsætning på synaptiske proteiner i dyrkede neuroner under basale betingelser ^10, og ændringer i palmitoylering niveauer af neuronale proteiner efter induktion af neuronal aktivitet ^9. Følsomheden og tilpasningsevne IP-ABE assay gør det ideelt til at undersøge palmitoylering profiler af neuronale proteiner, og optimal til detektering dynamiske ændringer i palmitoylation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
PMSF	Fluka	93482
Protease Inhibitor Cocktail	Roche Complete Mini	11 836 153 001
NEM	Sigma	E3876
HAM solution	Sigma	46780-4
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads	GE Healthcare	17-6002-35
Biotin-BMCC	Thermo Scientific	21900
Streptavidin-HRP	Thermo Scientific	21126	Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	21059