Summary
Neste trabalho, nós descrevemos um método útil para o estudo ligante fechado função de canal iônico em neurônios de fatias de cérebro de forma aguda isolados. Este método envolve a utilização de uma micropipeta cheia de medicamento para aplicação local de medicamentos para os neurónios gravados utilizando técnicas padrão de fixação de patch.
Abstract
O uso do tabaco leva a inúmeros problemas de saúde, incluindo câncer, doenças cardíacas, enfisema e infarto. Vício de fumar cigarro é uma doença prevalente neuropsiquiátrica que decorre das ações biofísicas e celulares da nicotina sobre os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em todo o sistema nervoso central. Compreender os subtipos nAChR vários que existem em áreas do cérebro importantes para a dependência da nicotina é uma das prioridades.
Experimentos que empregam técnicas de eletrofisiologia, como célula inteira braçadeira patch ou dois eletrodos gravações braçadeira de tensão são úteis para a caracterização farmacológica de nAChRs de interesse. Células que expressam nAChRs, tais como as células do tecido de mamífero de cultura ou oócitos de Xenopus laevis, são fisicamente isoladas e são, portanto, facilmente estudado usando as ferramentas da farmacologia moderna. Muito progresso foi feito utilizando essas técnicas, particularmente quando o receptor alvo, já era conhecido umª expressão ectópica foi facilmente alcançado. Muitas vezes, no entanto, é necessário estudar nAChRs no seu ambiente nativo: em neurónios dentro fatias de cérebro de forma aguda colhidas a partir de ratos de laboratório ou ratos. Por exemplo, os ratos que expressa "hipersensíveis" subunidades nAChR tais como α4 ratinhos e ratos L9'A um α6 L9 é 2, permitir uma identificação inequívoca dos neurónios com base na sua expressão funcional de uma subunidade de nAChR específico. Apesar de célula inteira gravações remendo da braçadeira de neurônios em fatias de cérebro é feito rotineiramente pelo eletrofisiologista hábil, é um desafio para aplicar localmente drogas como a nicotina ou acetilcolina para a célula gravado dentro de uma fatia do cérebro. A diluição de drogas para os superfusate (aplicação do banho) não é rapidamente reversível, e tubo em U de sistemas não são facilmente adaptados para funcionar com fatias de cérebro.
Neste artigo, descrevemos um método para rapidamente aplicar nAChR drogas ativadoras de neurônios registrados em adultos mOuse fatias de cérebro. Padrão de célula inteira gravações são feitas a partir de neurónios em fatias, e uma segunda micropipeta cheia com uma droga de interesse é manipulado para a posição perto da célula registada. Uma injecção de ar comprimido ou de azoto inerte para a pipeta cheia de medicamento provoca uma pequena quantidade de solução de fármaco a ser ejectada a partir da pipeta da célula registada. Usando este método, nAChR mediadas correntes podem ser resolvidos com a precisão de milissegundos. Tempos de aplicação de drogas pode ser facilmente variada, e a pipeta cheia de medicamento pode ser recolhido e substituído por uma nova pipeta, permitindo curvas concentração-resposta para ser criado por um único neurónio. Embora tenha sido descrita no contexto de nAChR neurobiologia, esta técnica deverá ser útil para o estudo de muitos tipos de canais iónicos dependentes do ligando ou de receptores nos neurónios de fatias de cérebro.
Protocol
1. Preparação de Soluções de Preparação Cérebro Slice e Eletrofisiologia
- As soluções para a preparação de fatias de cérebro foram previamente descritos 3, 4. Preparar N-metil-D-glucamina (NMDG) baseada em corte e solução de recuperação com a seguinte composição (em mM): 93 N-metil D-glucamina, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 de NaHCO3, 20 mM de HEPES, 25 glucose, 5 de Na + ascorbato, 2-tioureia, 3 piruvato de Na +, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 2H 2 O. • Ajuste para 300-310 mOsm com NMDG. Ajustar o pH a 7,3-7,4 com 10 N de HCl.
- Dissolver MgSO 4 • 7H 2 O, e CaCl 2 2H 2 O • em água Millipore para fazer soluções de reserva 2 M de cada um.
- Pesar outros componentes na ordem indicada e adicionar a um frasco volumétrico de parcialmente cheio com água Millipore, agitando para dissolver. Uma vez que tudo é adicionado, preencherbalão volumétrico de água Millipore.
- Medir o pH e ajustar com 10 N de HCl.
- Medir a osmolaridade e ajustar com NMDG se necessário.
- Prepare HEPES prendem fluido cerebrospinal artificial (aCSF) com a seguinte composição (em mM): NaCl 92, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO3, 20 mM de HEPES, 25 glucose, 5 Na + ascorbato, 2, 3 de Na tioureia + piruvato, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajustar para 300-310 mOsm com sacarose. Ajustar o pH a 7,3-7,4 com 1 N HCl ou NaOH.
- Pesar os componentes na ordem indicada e adicionar a um frasco volumétrico de parcialmente cheio de água Millipore, agitando para dissolver. Uma vez que tudo é adicionado, encher balão volumétrico com água Millipore.
- Medir o pH e ajustar com NaOH ou HCl, se necessário.
- Medir e ajustar a osmolaridade com sacarose, se necessário.
- Preparar a solução de gravação de padrão de aCSF a seguinte composição (em mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 O. NaH 2 PO 4, 24 de NaHCO3, 12,5 glucose, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 2H 2 • Ajustar para 300-310 mOsm com sacarose. Ajustar o pH a 7,3-7,4 com 1 N HCl ou NaOH.
2. Preparação de fatias cerebral aguda
- Corte fatia cerebral e de recuperação são realizados como anteriormente descrito 3, 4. Pratos bolha cheia de dois cristais NMDG solução de recuperação com 95% de oxigénio / 5% de CO 2 do gás (carbogénio), um prato em gelo, o outro a 33 ° C.
- Bolha prato de cristal cheio de um HEPES segurando aCSF com carbogênio à temperatura ambiente.
- Anestesiar rato adulto (com idades entre 2 a 12 meses) com pentobarbital de Na + (200 mg / kg, ip). Prossiga com o procedimento quando o animal não tem resposta a um dedo do pé pitada.
- Se necessário, cortar uma amostra de tecido da cauda para posterior genotypção do animal.
- Abrir a cavidade torácica, expor o coração, e prender a aorta descendente. Dilacerar o átrio direito.
- Transcardially perfundir animal com 5-10 ml de 0-4 ° C uma solução de recuperação NMDG.
- Decapitar animal, remover o cérebro e colocá-lo em solução de 4 ° C NMDG recuperação durante 1 min.
- Sobre uma placa de metal em gelo refrigerados, aparar o cérebro na orientação desejada (coronal, parasagital, horizontal, etc), para incluir a área de interesse.
- Apor o bloco de cérebro com supercola para a superfície de fase seca de um cortador de vibração (DSK-Zero 1; Dosaka), submergir o bloco cerebral em 4 ° C uma solução de recuperação de NMDG e continuamente a solução de bolha com carbogénio.
- Cortar fatias de cérebro a área de interesse. Espessura de corte é 200-400 um, dependendo da área específica do cérebro de interesse, a idade do animal, e experimentar a ser executada.
- Imediatamente após o corte, incubar fatias desejados em carbogenated, 33 ° C NMDG a recuperação solution durante exactamente 12 min, em seguida, transferir para carbogenated, HEPES a temperatura ambiente prendem solução durante um período inicial de 60 min. Após esta incubação de 60 min, as fatias pode ser utilizado para gravação. Fatias são mantidas em tampão HEPES prendem solução ao longo do dia, até que sejam utilizados para a gravação.
3. Gravação de remendo da braçadeira de neurônios em fatias de cérebro
- Puxe uma micropipeta remendo padrão com uma programável Flaming-Brown extrator (Sutter P-97, ou puxador vertical, equivalente). Pipetas que são ideais para giga-ohm formação selo normalmente têm uma resistência de 4-6 MQ
- Transferir uma fatia para a câmara de gravação (RC-27L; Instrumentos Warner) no palco de um microscópio vertical (Nikon FN-1). Continuamente superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) a fatia com carbogenated, padrão de gravação aCSF aquecido e mantido a 32 ° C. Alternativamente, as fatias pode ser mantida à temperatura ambiente.
- Localize e centro a área do cérebro de interesse usandoum objectivo ar 10X (Nikon Plano Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm).
- Visualizar os neurónios individuais usando um 40X infravermelha (IR) objectiva de imersão em água (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) ligados a IR-contraste de interferência diferencial (DIC) e uma óptica de alta velocidade do infravermelho próximo Charged Coupled Device (CCD) da câmera de vídeo (Hamamatsu C-7500). Sob IR-DIC de observação, os neurônios saudáveis apresentam uma superfície lisa, membrana plasmática cinza claro.
- Encher uma micropipeta com uma solução de gravação adequado intracelular. Para a maioria das aplicações, que utilizam a solução seguinte (em mM): 135 Gluconato de potássio, 5 EGTA, 0,5 CaCl2, 2 de MgCl2, 10 mM de HEPES, 2 de Mg-ATP, GTP e 0,1 (pH ajustado a 7,25 com base Tris, osmolaridade ajustado para 290 mOsm com sacarose). Estabelecer uma gravação de células inteiras de um neurônio visualizado.
4. A aplicação local de medicamentos para Neurônios em fatias
- Puxar uma micropipeta grampo padrão adesivo, como descrito acima. Usoum extractor de pipeta, tal como um Sutter P-97 que produz dois idênticos "irmãs" pontas da mesma peça de vidro é vantajoso quando as soluções de múltiplas drogas estão a ser utilizados na mesma célula. Tamanhos de ponta que tem uma resistência de ~ 5 MQ se eles foram preenchidos com a solução intracelular descritas acima são o ideal.
- Backfill micropipeta o com uma solução de fármaco diluído em carbogenated aCSF gravação, padrão. Apontar a ponta para baixo, e agite a micropipeta e recheada de drogas para remover quaisquer bolhas de ar retidas na coluna de solução.
- Montar a micropipeta e recheada de drogas num suporte de pipeta ligada com tubagem a um sistema adequado de pressão de ejecção, como um Picospritzer III (General Valve Co.). O titular da pipeta deve ser montado sobre um micromanipulador com a mesma resolução que manipuladores comumente utilizado para a gravação de fixação de membranas (por exemplo, Sutter MP-285). Além disso, o manipulador deve permitir o movimento diagonal para dentro e fora da fatia. Homemdualmente ejectar pressão 3 a 4 vezes para a micropipeta, a fim de construir-se uma pressão adequada por trás da coluna de líquido.
- Usando os controles micromaniplador, abaixe a pipeta de drogas na fatia, enquanto visualiza a ponta sob IR-DIC óptica. Idealmente, deve-se identificar visualmente e centro de um neurónio para ser gravado a partir de, seguido pelo posicionamento da pipeta droga perto da célula antes de baixar a micropipeta de gravação para a fatia. Posicionar a pipeta de drogas podem causar o movimento do tecido na vizinhança da célula gravada que poderiam interromper a gravação se a pipeta de droga é movido para a sua posição depois de se estabelecer uma vedação gigaohm.
- Usando vídeo IR, posicionar a micropipeta droga na superfície superior da fatia de tecido. Executar uma pressão de ejecção e do monitor 1) na proximidade da ponta para o movimento de detritos relacionados com a ejecção, e 2) a ponta micropipeta para detectar quaisquer sinais de que a ponta está obstruída ou bloqueada. Se a ponta está bloqueada / entupidos, recolha a pipetae e substituí-la por uma nova.
- Abordagem a célula gravado na diagonal a partir do topo da fatia de tal modo que quando em posição final, a ponta da pipeta e recheada de drogas é 1) no mesmo plano focal (ou ligeiramente inferior) como a célula gravada e a ponta do eléctrodo de registo , e 2) de 10 a 40 um da célula registada. Se a droga-cheia ponta da pipeta está acima da célula gravada, a força da pressão de ejecção poderiam perturbar o selo gigaohm.
- Registar a resposta celular desejado enquanto mantém a célula em modo de grampo de tensão ou de corrente de modo de fixação. Rotineiramente gravar acetilcolina e / ou nicotina provocou correntes de celulares, mantendo os neurônios no modo de fixação de voltagem. Embora a pressão de ejecção pode ser activado manualmente quando se utiliza um Picospritzer III, para resultados mais reprodutíveis, é aconselhável para provocar a ejecção de pressão através do sistema de aquisição (Axon Digidata 1440 e pClamp 10,3) com um TTL digital de pulso.
5. ControladorMicropipeta a Drug-cheia com um tradutor piezoelétrico
- Se possível, montar o suporte de pipeta e recheada de drogas a um tradutor de dimensão única piezoeléctrica (por exemplo Piezojena PA-100 ou Burleigh PZM-150) que é capaz de aceitar uma entrada de tensão analógico (mais uma vez, a partir do sistema de aquisição), que é então montado sobre o micromanipulador de alta precisão (Sutter MP-285). Um tradutor piezoeléctrico é útil porque o movimento da pipeta e recheada de drogas para dentro e para fora da fatia, incluindo o tempo e a velocidade de entrada / saída, pode ser mais facilmente controlado e reproduzido de experiência para experiência. Ao estudar nAChRs, os efeitos de dessensibilização de vazamento de nicotina a partir da pipeta cheia de medicamento, deve ocorrer que alguma vez, são minimizadas quando a pipeta é movido apenas perto da célula com um tradutor piezoeléctrico para o momento de ejecção de pressão.
- Através do potenciômetro controlado manualmente no amplificador de controle de tensão piezoelétrico, disque a tensãopara o seu valor máximo.
- Usando o micromanipulador posição, a pipeta de droga-cheia na fatia onde a pipeta ejecta o seu conteúdo para a célula gravada, e retrair a pipeta manualmente, reduzindo a tensão para zero no amplificador piezoeléctrico tensão de controlo.
- Utilizando um sinal de saída analógico do sistema de aquisição de gravação, mover a pipeta e recheada de drogas na fatia por um período de 250 mseg a partir de 300 ms antes do impulso de pressão de ejecção TTL ocorre. Retrair a pipeta durante um período de 250 mseg, a partir de 50 ms após o impulso TTL termina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Em nossos experimentos, nós rotineiramente gravar a partir de dopamina (DA) de produção de neurônios da área tegmental ventral (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNc). Em tensão-grampo modo, a aplicação de pressão ou de acetilcolina nicotina para essas células normalmente resultam em uma rápida corrente de catiões, para o interior, que atinge o pico dentro de 100-200 mseg (Figura 1A-B). Decaimento da corrente é em grande medida ditada por difusão da droga a partir do local de acção e, se enzimas na fatia estão presentes para metabolizar a droga numa forma inactiva. Por exemplo, a ACh é rapidamente hidrolisado por acetylcholinesterases que residem na superfície de células em áreas do cérebro que são ricas em neurónios DA 5. Isto resulta numa rápida decomposição da corrente evocada (Figura 1A). Em contraste, a nicotina não é hidrolisado e nicotina evocadas correntes não se deterioram tão rapidamente quanto ACh evocada correntes (Figura 1B), o que permite que a força de Activcomeu e dessensibilizar nAChRs 6.
Sistemas de ejecção de pressão permite que o operador se variar o tempo do impulso de pressão. Esta característica é útil no estudo de nAChRs na superfície de neurónios dentro fatias do cérebro, uma vez que permite ao investigador para determinar se a corrente máxima evocada foi alcançado, em resposta a um pulso de droga. Por exemplo, os dois traços na Figura 2 mostram que 250 ms de aplicação do fármaco (cinzento traço) podem ou não revelam um máximo definitivo evocado actual, enquanto que 1.000 msec de aplicação do fármaco (preto traço) rende um máximo de corrente mais clara alguns constante de estado de dessensibilização. Resolver esses "picos" correntes é fundamental na construção de uma curva de concentração-resposta exata, ou quando se estuda dessensibilização nAChR.
Neurônios de DA no mesencéfalo ventral muitas vezes disparar potenciais de ação espontâneos quando gravado dentro fatias cerebrais agudas 7, 8. camundongos α6 L9, que expressione nAChRs que respondem fortemente aos 10 a 100 vezes menores concentrações de nicotina ou ACh 2, 9-11, apresentam locomoção aumentada em resposta a injecções de nicotina. Para correlacionar a atividade neuronal (queima de potencial de ação) com o comportamento, é útil para aplicar nicotina aos neurônios α6 L9'S DA registrados no grampo de modo atual. Tipicamente, a aplicação local de nicotina (1 uM) para os neurónios α6 L9'S DA resultará numa aceleração rápida e transiente de disparo que se decompõe de volta à linha de base dentro de 30-40 segundos 2 (Figura 3, painel superior). Tais respostas a nicotina são facilmente quantificáveis (Figura 3, painel inferior) com o software de análise apropriado (por exemplo, pClamp; Molecular Devices Corp.)
Experiências em células de cultura ou oócitos de Xenopus com nAChRs ectopicamente expressas aproveitar a vantagem de uma série de concentrações de fármaco pode ser aplicada a cada célula gravado 12. Emneurônios dentro fatias de cérebro, tipicamente uma curva de concentração-resposta não é possível, e as respostas a uma única concentração de droga são muitas vezes relatados 1. No entanto, uma pipeta e recheada de drogas, tal como descrito no presente documento pode ser alterada para permitir que várias vezes para concentrações múltiplas de fármaco a ser aplicado para a mesma célula dentro de uma fatia gravada cérebro 2, 8, 13, 14. A Figura 4 mostra os dados representativos de um único neurónio DA gravado que foi estimulado com três concentrações de ACh. Experiência do investigador, combinado com um micromanipulador altamente estável segurando a pipeta e recheada de drogas, são fatores críticos que levam ao sucesso neste tipo de experimento. Quando bem sucedida, esta abordagem fornece informações valiosas sobre farmacológica nAChRs nativas.
Neurônios em fatias de cérebro, incluindo tipos de células descaracterizados ou aqueles presentes em áreas do cérebro com uma população heterogênea, muitas vezes são classificados utilizando elementos básicos diversosctrophysiological medidas e / ou morfológica 15. Por exemplo, a expressão de I h actual potencial de membrana, em repouso, a taxa de descarga espontânea, e o tamanho das células são medidas típicas usadas para caracterizar os neurónios DA 2, 7, 8, 16, 17. Utilizando este método, é possível caracterizar também os neurónios com base na sua resposta à nicotina localmente aplicado ou ACh 18, 19. Por exemplo, o colículo superior (CS) é uma região do cérebro heterogénea e relativamente descaracterizada com expressão extremamente elevado de nAChRs diferentes, incluindo aqueles que contêm subunidades α6 20. Em fatias de cérebro de ratos α6 L9'S, nós gravado a partir de vários neurónios SC e nicotina aplicada (1 uM), utilizando a pressão de ejecção com uma pipeta de nicotina-cheia. Dois tipos de resposta distintos foram observados: 1) ativação de correntes inibitórias pós-sinápticos (iPSCs) (Figura 5, as respostas de tipo I), e 2) grandes correntes de cátions para dentro com alguma Inductiem correntes de pós-sinápticas excitatórias (EPSCs) (Figura 5, as respostas do tipo II).
A utilização de um conversor piezoeléctrico, oferece a vantagem de que a pipeta cheia de medicamento pode ser mantido numa posição fixa, pelo menos, 100 mm de distância da célula registada até ser movido rapidamente adjacente à célula para a ejecção de pressão. Isto é útil, porque o movimento da pipeta podem ser automatizadas e é consistente de célula para célula e de dia para dia. Também é útil quando altas concentrações de nicotina (que dessensibilizar nAChRs) são aplicadas à célula registada, uma vez que minimiza o efeito de fuga de nicotina a partir da pipeta e recheada de drogas caso venha a ocorrer. Para demonstrar a consistência do nAChR correntes quando se utiliza um tradutor piezoeléctrico, nós gravado a partir de neurónios DA na VTA fatias de cérebro de ratos α6 L9'S. Figura 6 mostra as respostas consecutivas no mesmo α6 L9'S VTA DA neuronal em resposta a concentrações de nicotine que activar fortemente hipersensíveis α6 * nAChRs (1 uM: Figura 6A, 10 uM: Figura 6B). Se for permitido que continuamente vazar para a terceira célula gravada, estas concentrações de nicotina seria esperado para dessensibilizar nAChRs na superfície da célula, e a segunda resposta seria atenuado em relação à primeira resposta.
Figura 1. Respostas nAChR de Representação em neurônios de DA. Uma. Um neurónio AD em uma fatia WT rato cérebro foi fixado tensão, seguido pela aplicação local de ACh (100 uM) por meio de pressão de ejecção (250 msec) com um medicamento cheio segunda pipeta. Barra de escala: 100 pA, 3 seg B.. Experiência foi realizada como descrito em A, excepto que a nicotina (100 uM), foi aplicada ao neurónio DA. Barra de escala: 60 pA, 3 seg.
Figura 2. Resolver correntes de pico por tempo variando de drogas aplicação. Um neurónio AD em uma fatia WT rato cérebro foi fixado tensão, seguido pela aplicação local de ACh (100 uM). Duas respostas são indicados para a mesma célula gravado, onde ACh foi ejectado a partir da pipeta e recheada de drogas durante 250 msec (cinza de rastreio) ou msec 1000 (traço preto). Barra de escala: 50 pA.
Figura 3. Estudar o potencial de ação disparando após a aplicação local da droga. Um neurônio DA no cérebro de um rato L9 α6'S fatia foi gravado em pinça de corrente (I = 0), modo e potenciais de ação espontâneos foram observados. A nicotina (1 uM) foi aplicada usando pressão de ejecção (250 ms), e as alterações na taxa de queima potencial de acção e do potencial de membrana em repouso foramobservado. Usando o software pClamp (pesquisa de limiar), a taxa de disparo instantâneo foi derivado e é mostrada no painel inferior.
Figura 4. Aplicações múltiplas drogas para a mesma célula registada. Um neurônio DA no cérebro de um rato L9 α6'S fatia foi gravado no modo braçadeira de tensão. Uma pipeta e recheada de drogas foi usado para aplicar localmente ACh (1 uM, 250 ms). Enquanto continua a gravar a partir da célula, a pipeta cheia de medicamento foi retirado da fatia e substituída por uma outra pipeta cheia com 3 uM de ACh. Uma resposta a 3 uM ACh foi gravado, e o processo foi repetido mais uma vez para 10 uM ACh. Barra de escala: 100 pA, 1,5 seg.
Figura 5. Classificação de neurônios por nAChR tipo de resposta.Um grupo de colículo superiores (SC) neurónios no cérebro uma fatia α6 L9'S rato foram fixadas tensão, seguido pela aplicação local de nicotina (1 uM) por meio de ejecção de pressão. Tipo I neurônios expostos iPSCs aumentou após a aplicação da nicotina. Neurónios do tipo II apresentaram grandes correntes para dentro e EPSCs aumentadas em resposta à aplicação de nicotina. Barra de escala: 20 pA, 3 seg.
Figura 6. Tradutor piezoelétrico oferece consistência e protege de vazamento de drogas. Uma. A VTA DA neurônio em uma fatia do cérebro de um rato L9 α6 foi gravado no modo braçadeira de tensão durante a aplicação de um nicotina iM. A pipeta de nicotina cheia foi manobrado para a posição final antes da ejeção de pressão e retraído após a ejeção usando um tradutor piezoelétrico. Uma segunda resposta foi registada após 2 min a first para demonstrar que não tinha ocorrido a dessensibilização nAChR. Barra de escala: 100 pA, 8 seg B.. respostas nAChR em α6 L9'S neurónios DA VTA foram registadas como em A, mas 10 uM de nicotina foi aplicado. Barra de escala: 100 pA, 8 seg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O método apresentado neste artigo é de grande utilidade para o estudo de ligante fechado função de canal iônico em preparações fatia do cérebro. No entanto, há uma série de factores que irão afectar significativamente a qualidade e reprodutibilidade dos dados experimentais, que resultam da utilização deste método. Por exemplo, as correntes evocadas são muito sensíveis ao diâmetro da ponta da pipeta e recheada de drogas. Pequenas dicas irá causar dificuldade com esvaziando a solução de drogas, e dicas de grande porte com baixa resistência será mais susceptível de perturbar o selo gigaohm entre a célula gravado eo eletrodo de gravação. Uma outra limitação do método é a de que as células dentro de 10 um da célula registada pode ser exposto a drogas a partir da pipeta cheia de medicamento, o que pode aumentar a sua actividade e pode potencialmente afectar a célula registada.
Ao aplicar o medicamento a uma célula várias vezes com o mesmo fármaco da pipeta, é crucial que a pipeta ser devolvidoprecisamente a mesma posição na fatia para cada aplicação. Mesmo pequenos desvios (por exemplo, 1-2 mm) na colocação de uma resposta para a seguinte, muitas vezes, resultar em diferenças significativas na resposta do pico observado. Um tradutor programável piezoeléctrico (como descrito acima) ou micromanipulador robótico é vantajoso para posicionar a pipeta de drogas. Outra consideração importante é a profundidade da célula registada dentro da fatia. Droga, muitas vezes difundem para longe a partir de uma célula na superfície da fatia mais rapidamente, ao passo que droga pode ser "aprisionada" no interior da fatia quando ejectados para uma célula que está localizado profundamente dentro da fatia. Isso é muitas vezes uma questão fundamental para a aplicação de nicotina, que prontamente dessensibiliza nAChRs quando os tempos de exposição são mais do que 100-200 mseg. Da mesma forma, a pressão (em psi), que é ejectado na pipeta e recheada de drogas e a quantidade de tempo que é aplicada uma pressão (Figura 2), são considerações importantes para a interpretação da actual nAChRta. Nós usam rotineiramente 10-12 psi de pressão, e nós achamos que 250 ms é tempo suficiente para resolver correntes de pico nAChR sem causar dessensibilização do receptor extensa.
Uma das principais vantagens do método que descrevemos é a capacidade de trocar dicas droga pipetas cheias de modo que as concentrações de múltiplas drogas podem ser aplicadas para o mesmo neurónio. Principais considerações ao pipetas troca são: 1) variação na pipeta localização dica de uma concentração para o próximo, e 2 variabilidade) em pipeta de diâmetro da ponta. Pipeta localização ponta geralmente pode ser adequadamente controlada com uma câmera de vídeo de alta resolução quase IR e um micromanipulador preciso. Variabilidade no diâmetro da ponta da pipeta podem ser controlados usando pipetas de "irmãs" sempre que possível, e utilizando um extractor de pipeta que puxa micropipetas com um elevado grau de precisão e consistência.
No geral, o método de pipeta e recheada de drogas descrito neste trabalho é uma abordagem muito útil quando studying nAChRs nativo expresso em neurónios encontrados em fatias cerebrais agudas. Para além de ser útil para o estudo da neurobiologia da dependência de nicotina e biologia colinérgico nicotínico, este método é facilmente aplicável a outros canais iónicos dependentes do ligando. 5-HT 3 de receptores, os receptores GABA A, e receptores de glicina são várias das outras "cis-loop" receptores que podem ser estudados utilizando as técnicas 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) concessão DA030396. Graças aos membros do laboratório Drenan para discussão útil e crítica do manuscrito. Agradecimentos especiais a Mi Ran Kim para assistência técnica e Thomas Jonathan Ting para aconselhamento sobre fatias de cérebro de rato adulto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscience. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
