Summary
In diesem Papier beschreiben wir eine nützliche Methode, um Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Neuronen akut isolierten Hirnschnitten studieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Arzneimittels, gefüllte Mikropipette zur lokalen Anwendung von Medikamenten, um unter Verwendung von Standard aufgezeichnet Neuronen Patch-Clamp-Techniken.
Abstract
Tabakkonsum führt zu zahlreichen gesundheitlichen Problemen wie Krebs, Herzkrankheiten, Emphysem und Schlaganfall. Sucht nach Zigarettenrauchen ist eine weit verbreitete neuropsychiatrische Erkrankung, die von den biophysikalischen und zellulären Wirkungen von Nikotin auf Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren (nAChR) im gesamten zentralen Nervensystem beruht. Das Verständnis der verschiedenen nAChR Subtypen, in Hirnregionen, die für Nikotinsucht existiert ist eine wichtige Priorität.
Experimente, die Elektrophysiologie Techniken wie whole-cell Patch-Clamp-oder Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Aufnahmen verwenden, sind für die pharmakologische Charakterisierung von nAChRs von Interesse nützlich. Exprimieren nAChRs, wie Säuger Gewebekulturzellen oder Xenopus laevis Oozyten sind galvanisch getrennt und können daher leicht studiert mit den Mitteln der modernen Pharmakologie. Große Fortschritte wurden gemacht mit diesen Techniken, insbesondere wenn die Target-Rezeptor bereits bekannt wurdend ektopische Expression wurde problemlos erreicht. Oft ist es jedoch notwendig, um nAChRs in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren: in Neuronen innerhalb Hirnschnitten akut vom Labor Mäusen oder Ratten geerntet. Beispielsweise exprimieren mice "hypersensitiven" nAChR-Untereinheiten wie α4 L9'A Mäusen 1 und α6 L9'S Mäusen 2, zur eindeutigen Identifizierung der Neuronen auf ihre funktionelle Expression eines spezifischen nAChR-Untereinheit basierend ermöglichen. Obwohl whole-cell Patch Clamp Messungen von Neuronen in Hirnschnitten wird routinemäßig durch den Fachmann Elektrophysiologen getan, ist es eine Herausforderung vor Ort gelten Drogen wie Acetylcholin oder Nikotin auf die aufgezeichneten Zelle innerhalb eines Hirnschnitt. Verdünnung der Wirkstoffe in die Superfusat (Badapplikation) nicht schnell reversible und U-Rohr-Systeme sind nicht leicht angepasst, um mit Hirnschnitten arbeiten.
In diesem Papier beschreiben wir ein Verfahren zur schnellen Anwendung nAChR-aktivierende Medikamente Neuronen im erwachsenen m erfasstOuse Hirnschnitten. Standard Ganzzellableitungen aus Neuronen in Scheiben hergestellt, und ein zweites Mikropipette mit einem Medikament gefüllt ist von Interesse in Position in der Nähe der Zelle aufgenommen manövriert. Eine Injektion von Druckluft oder inerten Stickstoff in das Medikament gefüllten Pipette entsteht eine kleine Menge an Arzneimittel Lösung aus der Pipette auf die aufgezeichnete Zelle ausgestoßen werden. Mit dieser Methode sind nAChR-vermittelten Ströme können mit Millisekunden-Genauigkeit gelöst werden. Medikamentenapplikation mal leicht variiert werden, und das Arzneimittel gefüllten Pipette kann zurückgezogenen und mit einer neuen Pipette ersetzt werden, so dass für Konzentrations-Wirkungs-Kurven für ein einziges Neuron geschaffen werden. Obwohl im Rahmen der nAChR Neurobiologie beschrieben wurde, sollte diese Technik nützlich sein für die Untersuchung vieler Arten von Liganden-gesteuerte Ionenkanäle oder Rezeptoren im Gehirn Neuronen von Scheiben.
Protocol
Ein. Herstellung von Lösungen für Brain Scheibe Vorbereitung und Elektrophysiologie
- Lösungen für die Herstellung von Hirnschnitten wurden bisher 3, 4 beschrieben. Planen N-Methyl-D-glucamin (NMDG)-basierten Schneiden und Recovery-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mM): 93 N-Methyl-D-Glucamin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 Glucose, 5 Na + Ascorbat, 2 Thioharnstoff, 3 Na + Pyruvat, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit NMDG. PH-Wert auf 7,3-7,4 mit 10 N HCl.
- Lösen MgSO 4 • 7H 2 O und CaCl 2 • 2H 2 O in Millipore Wasser zu 2 M Stammlösungen von jedem machen.
- Abzuwiegen anderen Komponenten in der angegebenen Reihenfolge und in eine teilweise gefüllte Messkolben mit Millipore-Wasser unter Rühren zu lösen. Sobald alles zugegeben, füllenMesskolben mit Millipore-Wasser.
- Messen Sie den pH-Wert und die Einstellung mit 10 N HCl.
- Messen Sie die Osmolarität und stellen Sie mit NMDG wenn nötig.
- Planen HEPES Halten künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) der folgenden Zusammensetzung (in mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 Glucose, 5 Na + Ascorbat, 2 Thioharnstoff, 3 Na + Pyruvat, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit Saccharose. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 mit 1 N HCl oder NaOH.
- Abzuwiegen Komponenten in der angegebenen Reihenfolge und in eine teilweise gefüllte Messkolben mit Millipore-Wasser unter Rühren zu lösen. Sobald alles zugegeben, füllen Messkolben mit Millipore-Wasser.
- Messung des pH-Wertes und Einstellen mit NaOH oder HCl, wenn nötig.
- Messen Sie die Osmolarität und stellen mit Saccharose, wenn nötig.
- Standardlösungen aCSF Aufzeichnungs-Lösung folgender Zusammensetzung (in mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12,5 Glucose, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit Saccharose. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 mit 1 N HCl oder NaOH.
2. Vorbereitung der akuten Hirnschnitten
- Gehirnscheibe Schneiden und Wiederherstellung erfolgen wie zuvor 3, 4 beschrieben. Bubble zwei Kristall Gerichte mit NMDG Recovery-Lösung mit 95% Sauerstoff / 5% CO 2-Gas (Carbogen), eine Schüssel auf dem Eis, die andere bei 33 ° C gefüllt
- Blase ein Kristall Schale mit HEPES Halten aCSF mit Carbogen bei Raumtemperatur gefüllt.
- Anesthetize erwachsenen Maus (im Alter von 2 bis 12 Monaten) mit Na + Pentobarbital (200 mg / kg, ip). Fahren Sie mit dem Vorgang, wenn das Tier hat keine Antwort auf eine toe-Prise.
- Falls erforderlich, einen Schwanz Gewebeprobe für eine spätere GenotypIng. des Tieres.
- Öffnen Sie die Brusthöhle, Setzen Sie das Herz, und klemmen Sie die absteigende Aorta. Aufschlitzen den rechten Vorhof.
- Transkardial perfundieren Tier mit 5-10 ml 0-4 ° C NMDG-Recovery-Lösung.
- Enthaupten Tier, entfernen Sie das Gehirn und legen Sie es in 4 ° C NMDG-Recovery-Lösung für 1 min.
- Auf einer eisgekühlten Metallplatte, schneiden das Gehirn in der gewünschten Ausrichtung (koronal, parasagittal, horizontal, etc.), um den Bereich in der Nähe sind.
- Bringen Sie das Gehirn Block mit Sekundenkleber auf die trockene Bühne Oberfläche eines vibrierenden Allesschneider (DSK-Zero 1; Dosaka), tauchen das Gehirn Block in 4 ° C NMDG-Recovery-Lösung, und kontinuierlich bubble die Lösung mit Carbogen.
- Angeschnitten des Gehirns Bereich von Interesse. Scheibendicke beträgt 200-400 um, abhängig von der spezifischen Gehirn interessierenden Bereich, tierische Alter und Experiment durchzuführen.
- Unmittelbar nach dem Schneiden carbogenated inkubieren gewünschten Scheiben, 33 ° C NMDG-Recovery-Löauf genau 12 min, dann carbogenated, Raumtemperatur HEPES hält Lösung für einen anfänglichen Zeitraum von 60 min zu übertragen. Nach dieser 60 min Inkubation kann Scheiben für Aufnahmen verwendet werden. Scheiben werden in HEPES halten Lösung den ganzen Tag, bis sie für die Aufnahme verwendet werden beibehalten.
3. Patch Clamp Aufnahme von Neuronen im Gehirn Slices
- Ziehen Sie einen Standard-Patch-Mikropipette mit einer programmierbaren Flaming-Brown Puller (Sutter P-97 oder gleichwertig vertikale puller). Pipetten, die optimal für Giga-Ohm Dichtung Formation sind typischerweise einen Widerstand von 4-6 MOhm
- Übertragen einer Scheibe zur Aufnahme Kammer (RC-27L; Warner Instruments) auf der Stufe eines aufrechten Mikroskop (Nikon FN-1). Kontinuierlich superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) die Scheibe mit carbogenated, Standard-Aufnahme aCSF erhitzt und bei 32 ° C gehalten Alternativ kann Scheiben bei Raumtemperatur gehalten werden.
- Suchen und in der Mitte des Gehirns Bereich von Interesse mita 10X Luftobjektiv (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm).
- Visualisieren einzelnen Neuronen mit einem 40X Nah-Infrarot-(IR-) Wasser Immersionsobjektiv (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) mit IR-Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Optik und einem High-Speed-nahen Infrarot charged coupled device (CCD) Videokamera (Hamamatsu C-7500). Unter IR-DIC Beobachtung, weisen gesunde Neuronen eine glatte, hellgraue Plasmamembran.
- Füllen Sie eine Mikropipette mit einem geeigneten intrazellulären Recording-Lösung. Für die meisten Anwendungen, verwenden wir die folgende Lösung (in mM): 135 Kaliumgluconat, 5 EGTA, 0,5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP und 0,1 (pH-Wert auf 7,25 mit Tris-Base, Osmolarität eingestellt eingestellt auf 290 mOsm mit Saccharose). Stellen Sie eine whole-cell-Aufnahme von einer visualisierten Neurons.
4. Lokale Anwendung von Medikamenten zu Neuronen in Scheiben
- Ziehen Sie ein Standard-Patch-Clamp-Mikropipette wie oben beschrieben. Miteine Pipette Abziehvorrichtung wie eine Sutter P-97, die zwei identische "Schwester" Spitzen aus dem gleichen Stück Glas produziert, ist von Vorteil, wenn multiple drug Lösungen auf derselben Zelle verwendet werden sollen. Tip Größen, die einen Widerstand von ~ 5 MW haben würden, wenn sie mit der intrazellulären oben beschriebenen Lösung gefüllt wurden, sind optimal.
- Hinterfüllung die Mikropipette mit einer Lösung des Wirkstoffs in carbogenated, Standard-Aufzeichnungs aCSF verdünnt. Richten Sie die Spitze nach unten, und Flick die Droge gefüllte Mikropipette, um Luftblasen in der Spalte der Lösung aufgefangen entfernen.
- Montieren das Medikament gefüllte Mikropipette in einem Pipettenhalter mit Schlauch an einem geeigneten Druck Lastausstoßsystem wie eine Picospritzer III (General Valve Co.) verbunden ist. Der Pipettenhalter sollte auf einem Mikromanipulator mit der gleichen Auflösung montiert werden als Manipulatoren allgemein für Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet (z. B. Sutter MP-285). Außerdem sollte der Manipulator für diagonale Bewegungen in und aus der Scheibe zu ermöglichen. Mannmanuell auswerfen Druck 3 bis 4 Mal in die Mikropipette, um den Aufbau ausreichender Druck hinter der Säule der Flüssigkeit.
- Mit den Mikromanipulator Kontrollen senken das Medikament Pipette in der Scheibe, während die Visualisierung der Spitze unter IR-DIC-Optik. Idealerweise sollte ein visuell zu identifizieren und in der Mitte ein Neuron aus aufgezeichnet werden, durch Positionieren des Medikaments Pipette nahe der Zelle vor dem Absenken des Aufzeichnungs Mikropipette in die Scheibe folgt. Positionieren der Pipette kann Medikaments Bewegung von Gewebe in der Nähe der Zelle, die die aufgezeichneten Aufzeichnungs stören könnte, wenn das Medikament Pipette in die Position nach Festlegung eines Gigaohm Dichtung bewegt verursachen.
- Verwendung von IR-Video, das Medikament zu positionieren Mikropipette an der oberen Fläche des Gewebeschnitts. Ausführen ein Druck Ausstoßen und Monitor 1) der Umgebung der Spitze für eine Bewegung von Trümmern im Zusammenhang mit dem Ausstoßen, und 2) die Mikropipettenspitze auf Anzeichen, daß die Spitze verstopft oder blockiert. Wenn die Spitze blockiert / verstopft, zurückziehen pipette und ersetzen sie durch eine neue.
- Nähern das aufgezeichnete Zelle diagonal von oben der Scheibe derart, dass, wenn in der Endposition ist die Spitze des Medikaments gefüllten Pipette 1) in derselben Fokalebene (oder leicht darunter) als aufgezeichnete Zelle und der Spitze der Aufzeichnungselektrode und 2) 10 bis 40 um aus dem aufgenommenen Zelle. Wenn das Medikament gefüllte Pipettenspitze ist oberhalb des aufgezeichneten Zelle könnte die Kraft von dem Druck Ausstoßen stören die Gigaohm Dichtung.
- Notieren Sie die gewünschte zelluläre Reaktion, während die Zelle in Voltage-Clamp-Modus oder Stromzange Modus. Wir routinemäßig aufzeichnen Acetylcholin und / oder Nikotin-induzierte zelluläre Ströme, während Neuronen im Voltage-Clamp-Modus. Obwohl Druck Ausstoßen manuell ausgelöst werden kann, wenn unter Verwendung eines Picospritzer III, für mehr reproduzierbare Ergebnisse empfiehlt es sich, den Druck über das Ausstoßen Erfassungssystem (Axon Digidata 1440 und pClamp 10.3) mit einem digitalen TTL-Impuls auszulösen.
5. RegelungDie Drug-gefüllte Mikropipette mit einem piezoelektrischen Übersetzer
- Wenn möglich, den Wirkstoff gefüllten Pipettenhalter um ein eindimensionales piezoelektrischen Übersetzer (zB Piezojena PA-100 oder Burleigh PZM-150), die in der Lage zur Annahme eines analogen Spannungseingang (wiederum aus der Übernahme-System), welches dann ist befestigt auf der hochpräzisen Mikromanipulator (Sutter MP-285). Piezoelektrischer Übersetzer ist nützlich, da die Bewegung des Medikaments gefüllten Pipette in die und aus der Scheibe, einschließlich des Zeitpunkts und der Geschwindigkeit der Eingangs / Ausgangs, leichter beherrscht werden kann, und wiedergegeben von Experiment zu Experiment. Bei der Untersuchung von nAChR, die desensibilisierende Wirkung von Nikotin Leckage aus dem Arzneimittel gefüllten Pipette, sollten sie je vorkommen, werden minimiert, wenn die Pipette wird nur in der Nähe der Zelle mit einem piezoelektrischen Übersetzer verschoben auf den Augenblick der Druck Ausstoßen.
- Mit dem manuell gesteuerten Potentiometer auf dem piezoelektrischen Spannungsregelverstärker, wählen Sie die Spannungum ihren maximalen Wert.
- Mit dem Mikromanipulator, Position der Droge gefüllte Pipette in der Scheibe, wo die Pipette seinen Inhalt auf die aufgezeichneten Zelle wird ausgeworfen, und Einfahren der Pipette durch manuelle Reduzierung der Spannung auf Null auf dem piezoelektrischen Spannungsregelverstärker.
- Verwendung eines analogen Ausgangssignals von dem Aufzeichnungs-Erfassungssystem, bewegen das Medikament gefüllten Pipette in das Segment über einen Zeitraum von 250 msec beginnend 300 msec bevor der Druck Ausstoßen TTL-Impuls auftritt. Einfahren der Pipette über einen Zeitraum von 250 msec, 50 msec beginnend nach der TTL-Impuls endet.
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Representative Results
In unseren Experimenten haben wir routinemäßig von Dopamin (DA)-produzierenden Neuronen des ventralen Tegmentum (VTA) und der Substantia nigra pars compacta (SNC) aufzuzeichnen. Im Spannungs-Clamp-Modus wird Druckbeaufschlagung von Acetylcholin oder Nikotin an diese Zellen typischerweise in einer schnellen, einwärts Kationenstrom die Spitze erreicht innerhalb von 100 bis 200 ms (Fig. 1A-B) führen. Abklingen des Stroms wird weitgehend durch die Diffusion des Arzneimittels aus dem Wirkort diktiert, und ob Enzyme in der Schicht vorhanden sind, um das Medikament zu verstoffwechseln einer inaktiven Form. Beispielsweise ist ACh rasch hydrolysiert acetylcholinesterases, die auf der Oberfläche von Zellen in Bereichen des Gehirns, die reich an DA-Neuronen sind 5 befinden. Dies führt zu einem schnellen Zerfall der hervorgerufenen Stromes (1A). Im Gegensatz dazu ist das Nikotin nicht hydrolysiert und Nikotin-hervorgerufene Ströme nicht so schnell wie Ströme (Abbildung 1B), die es ermöglicht, stark ACTIV ACh hervorgerufenen Zerfallaß und desensibilisieren nAChRs 6.
Druck Ausstoßen Systeme ermöglichen es dem Bediener, die Zeit des Druckimpulses zu variieren. Diese Funktion ist nützlich bei der Untersuchung nAChRs auf der Oberfläche der Neuronen innerhalb Hirnschnitten, wie es der Prüfer, um festzustellen, ob die maximale evozierten Strom in Reaktion auf einen Impuls des Arzneimittels erreicht werden kann. Zum Beispiel die beiden Kurven in Abbildung 2 zeigen, dass 250 ms der Drug Application (graue Kurve) kann oder nicht offenbaren kann eine definitive maximale hervorgerufenen aktuellen, während 1000 ms der Drug Application (schwarze Kurve) ergibt sich ein deutliches Maximum Strom plus einige stetigen -state Desensibilisierung. Lösung solcher "peak" Ströme ist von entscheidender Bedeutung bei der Konstruktion eine genaue Konzentrations-Wirkungs-Kurve oder beim Studium nAChR Desensibilisierung.
DA Neuronen im ventralen Mittelhirn oft feuern spontane Aktionspotentiale, wenn sie innerhalb akuten Hirnschnitten 7, 8 aufgezeichnet. α6 L9'S Mäuse, die exnAChRs drücken, die stark auf 10 bis 100-fach niedrigeren Konzentrationen von Nikotin oder ACh 2, 9-11 reagieren, eine erhöhte Fortbewegung in Reaktion auf Nikotin Injektionen. Um neuronale Aktivität (Aktionspotential firing) mit Verhalten korrelieren, ist es nützlich, um Nikotin an α6 L9'S DA-Neuronen in den Strom-Clamp-Modus aufgezeichnet sind. Typischerweise wird die lokale Applikation von Nikotin (1 uM) zu α6 L9'S DA Neuronen in einer schnellen und transienten Beschleunigung Abfeuern darauf, dass zerfällt wieder auf den Ausgangswert innerhalb von 30-40 sec 2 (Abbildung 3, oben) führen. Solche Reaktionen auf Nikotin sind leicht quantifizierbar (Abbildung 3, unten) mit den entsprechenden Analyse-Software (zB pClamp; Molecular Devices Corp.)
Experimente in kultivierten Zellen oder Xenopus-Oozyten, ektopisch exprimiert nAChRs haben den Vorteil, daß eine Reihe von Arzneimittelkonzentrationen zu jedem aufgezeichneten Zelle 12 angelegt werden kann. InNeuronen innerhalb Hirnschnitten, typischerweise eine Konzentrations-Wirkungs-Kurve nicht möglich ist, und Antworten auf eine einzelne Konzentration des Wirkstoffs angesehen 1 angegeben. Jedoch kann ein Medikament gefüllten Pipette nach dieser Veröffentlichung beschrieben wiederholt verändert werden, um nach mehreren Konzentrationen des Medikaments auf die gleiche Zelle in einem aufgezeichneten Hirnschnittkultur 2, 8, 13, 14 gegeben sein muss. Abbildung 4 zeigt repräsentative Daten aus einer einzigen aufgezeichneten DA Neuronen, die mit drei Konzentrationen von ACh stimuliert wurde. Erfahrung der Ermittler, mit einem hochstabilen Mikromanipulator hält das Medikament gefüllte Pipette kombiniert, sind kritische Faktoren für den Erfolg in dieser Art von Experiment. Wenn erfolgreich, bietet dieser Ansatz eine wertvolle pharmakologische Informationen zu nativen nAChR.
Neuronen in Hirnschnitten, einschließlich charakterisierten Zelltypen oder Anwesenden in Hirnarealen mit einer heterogenen Bevölkerung, werden häufig klassifiziert mit verschiedenen Grundelementectrophysiological und / oder morphologische Maßnahmen 15. Zum Beispiel sind die Expression von I h Strom, Ruhemembranpotential, spontane Feuerrate, und Zellgröße typische Maßnahmen zur DA Neuronen 2, 7, 8, 16, 17 zu charakterisieren. Verwendung unserer Verfahren ist es auch möglich, Neuronen auf ihre Reaktion auf lokal angewendet Nikotin oder ACh 18, 19 zu charakterisieren. Zum Beispiel ist die überlegene colliculus (SC) eine heterogene und relativ uncharakterisierten Hirnareal mit extrem hoher Expression verschiedener nAChRs, einschließlich derer, die α6-Untereinheiten 20 enthalten. In Hirnschnitten von α6 L9'S Mäusen verzeichneten wir aus mehreren SC Neuronen und angewendet Nikotin (1 uM) unter Druck Auswerfen mit einem Nikotin-gefüllten Pipette. Zwei unterschiedliche Reaktion Typen beobachtet: 1) Aktivierung von inhibitorischen postsynaptischen Ströme (IPSCs) (Abbildung 5, Typ I Reaktionen), und 2) große innen-Kation Ströme mit einigen Induktionauf der exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) (Abbildung 5, Typ II Antworten).
Die Verwendung eines piezoelektrischen Übersetzer bietet den Vorteil, dass das Medikament gefüllten Pipette in einer stationären Position gehalten mindestens 100 um weg von der Zelle aufgenommen werden, bis er sich schnell bewegt wird neben der Zelle für den Druck Ausstoßen. Dies ist nützlich, weil der Pipette Bewegung automatisiert werden und ist konsistent von Zelle zu Zelle und von Tag zu Tag. Es ist auch nützlich, wenn hohe Konzentrationen an Nikotin (die desensibilisieren nAChR) an die aufgezeichnete Zelle angewendet werden, da sie die Wirkung von Nikotin Leckagen minimiert aus der Droge gefüllten Pipette sollten sie je vorkommen. Um die Konsistenz der nAChR Ströme zeigen, bei Verwendung eines piezoelektrischen Übersetzer wiesen wir von VTA DA-Neuronen im Gehirn von Scheiben von α6 L9'S Mäusen. 6 zeigt aufeinanderfolgende Reaktionen in demselben α6 L9'S VTA DA Neurons in Reaktion auf Konzentrationen der nicotine, die stark aktivieren überempfindlich α6 * nAChRs (1 uM: 6A; 10 uM: 6B). Wenn erlaubt, kontinuierlich auf die aufgezeichneten Zelle austreten würden diese Konzentrationen von Nikotin erwartet nAChRs auf der Zelloberfläche zu desensibilisieren, und die zweite Antwort würde gedämpft relativ zum ersten Reaktion.
Abbildung 1. Vertreter nAChR Antworten in DA Neuronen. A. Ein DA Neurons im WT Mäusehirn Scheibe geklemmt war, gefolgt von lokalen Applikation von ACh (100 pM) über Druckleitungen Auswerfen (250 ms) unter Verwendung eines zweiten Arzneimittels gefüllten Pipette. Maßstab: 100 pA, 3 sec B.. Experiment wurde durchgeführt, wie in A beschrieben, außer dass Nikotin (100 uM) wurde der DA Neuronen angewendet. Maßstab: 60 pA, 3 sek.
Abbildung 2. Lösen Stromspitzen durch Variation drug application Zeit. A DA Neuronen in einer WT-Maus Hirnschnitt Spannung war gespannt, gefolgt von lokalen Applikation von ACh (100 uM). Zwei Ergebnisse werden für den gleichen aufgezeichneten Zelle, wo ACh aus dem Arzneimittel gefüllten Pipette für 250 msec (graue Kurve) bzw. 1000 ms (schwarze Kurve) ausgeworfen wurde gezeigt. Maßstab: 50 pA.
Abbildung 3. Studieren Aktionspotential Brennen nach lokaler drug application. A DA Neuronen in einem α6 L9'S Maushirn Scheibe wurde in Stromzange (I = 0)-Modus und spontane Aktionspotentiale beobachtet wurden aufgezeichnet. Nikotin (1 pM) wurde mittels Druck Auswurf (250 ms) und Veränderungen im Aktionspotential Feuerrate und Ruhemembranpotential warenbeobachtet. Verwendung pClamp Software (Schwellenwertsuchphase) wurde momentanen Impulsauslösungsfrequenz abgeleitet und wird im unteren Bereich dargestellt.
Abbildung 4. Multiple Drug Applications auf den gleichen aufgezeichnet Zelle. A DA Neuronen in einem α6 L9'S Maushirn Scheibe wurde in Voltage-Clamp-Modus aufgenommen. Ein Medikament gefüllte Pipette wurde verwendet, um lokal gelten ACh (1 uM, 250 ms). Während weiterhin aus der Zelle aufzunehmen, wurde das Arzneimittel gefüllten Pipette aus der Scheibe abgezogen und durch ein anderes Pipette mit 3 uM ACh gefüllt. Eine Reaktion auf 3 uM ACh wurde aufgezeichnet, und das Verfahren wurde erneut 10 uM ACh wiederholt. Maßstab: 100 pA, 1,5 sek.
Abbildung 5. Klassifizierung von Neuronen durch nAChR Antworttyp.Eine Gruppe von Colliculus superior (SC) Neuronen in einem α6 L9-Maus Hirnschnitt waren geklemmt, gefolgt von lokalen Applikation von Nikotin (1 uM) über Druck Auswurf. Typ-I-Neurone zeigten eine erhöhte IPSCs nach Nikotin Anwendung. Typ II Neuronen zeigten große Einwärtsströme und erhöhte EPSCs in Reaktion auf Nikotin Anwendung. Maßstab: 20 pA, 3 sek.
Abbildung 6. Piezoelektrische Übersetzer bietet Kontinuität und schützt vor Drogen Leckage. A. A VTA DA Neuronen im Gehirn Scheibe von einem α6 L9'S Maus wurde in Voltage-Clamp-Modus während der Anwendung von 1 uM Nikotin aufgenommen. Das Nikotin-gefüllten Pipette wurde in die endgültige Position vor dem Druck Auswerfen manövriert und eingefahren nach dem Auswerfen mit einem piezoelektrischen Übersetzer. Eine zweite Reaktion wurde 2 min nach dem aufgezeichneten first zu beweisen, dass keine nAChR Desensibilisierung stattgefunden hatte. Maßstab: 100 pA, 8 Sek. B.. nAChR Antworten in α6 L9'S VTA DA Neuronen wurden wie in A aufgenommen, aber 10 uM Nikotin angewendet wurde. Maßstab: 100 pA, 8 sec.
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Discussion
Das Verfahren in diesem Papier ist weitgehend nützlich für die Untersuchung Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Hirnschnitt Vorbereitungen. Es gibt jedoch eine Reihe von Faktoren wesentlich beeinflussen die Qualität und Reproduzierbarkeit der experimentellen Daten, die sich aus der Verwendung dieser Methode. Beispielsweise sind hervorgerufene Ströme sehr empfindlich auf den Durchmesser der Spitze des Arzneimittels gefüllten Pipette. Kleine Tipps werden Schwierigkeiten mit Ausstoßen der Arzneimittellösung und große Spitzen mit niedrigem Widerstand wird eher um die Dichtung zwischen dem Gigaohm aufgezeichneten Zelle und der Aufzeichnungselektrode stören verursachen. Eine andere Begrenzung der vorgestellte Verfahren ist, dass Zellen innerhalb 10 um des aufgezeichneten Zelle bis zu Medikamenten aus dem Wirkstoff gefüllten Pipette, die ihre Aktivität erhöhen kann und möglicherweise auf die aufgezeichneten Zelle ausgesetzt werden.
Beim Aufbringen Arzneimittels an eine Zelle mehrere Male mit der gleichen Arzneimittel-Pipette, ist es entscheidend, dass die Pipette zurückzugebendengenau die gleiche Position in der Scheibe für jede Anwendung. Selbst kleine Abweichungen (zB 1-2 um) in die Platzierung von einer Reaktion auf die nächsten oft erhebliche Unterschiede in der beobachteten Peak-Ansprechen führen. Eine programmierbare piezoelektrischen Übersetzer (wie oben beschrieben) oder Roboter Mikromanipulator ist vorteilhaft für die Positionierung des Medikaments Pipette. Eine weitere wichtige Überlegung ist die Tiefe der Zelle aufgenommen innerhalb der Schicht. Medikament wird oft diffundieren weg von einer Zelle auf der Oberfläche der Scheibe schneller, während Medikament "gefangen" werden innerhalb der Schicht, wenn sie auf einer Zelle, die tief innerhalb des Slice befindet ausgeworfen. Dies ist oft ein wichtiger Aspekt bei der Anwendung Nikotin, die leicht desensibilisiert nAChRs bei Belichtungszeiten länger als 100-200 ms sind. Ähnlich sind der Druck (in bar), das in dem Medikament gefüllten Pipette und der Zeitdauer, während der Druck aufgebracht wird (Figur 2) ausgestoßen wird, wichtige Überlegungen zum Interpretieren nAChR aktuellen data. Wir verwenden routinemäßig 10-12 psi Druck, und wir finden, dass 250 ms ausreichend Zeit, um nAChR Stromspitzen, ohne dass umfangreiche Rezeptordesensibilisierung zu lösen ist.
Ein wesentlicher Vorteil des Verfahrens wir beschreiben, ist die Fähigkeit zum Austausch Medikament gefüllte Pipettenspitzen sodass mehrere Arzneimittelkonzentrationen zu demselben Neuron angewendet werden können. Wichtige Überlegungen beim Austausch von Pipetten sind 1) Veränderung in Pipettenspitze Standort von einer Konzentration auf die nächste, und 2) die Variabilität in Pipettenspitze Durchmesser. Pipettenspitze Speicherort kann typischerweise angemessen mit einem hochauflösenden nahes Infrarot-Videokamera und ein präzises Mikromanipulator gesteuert werden. Variabilität in Pipettenspitze Durchmesser kann mit Hilfe von "Schwester Pipetten", wann immer möglich, und mit Hilfe einer Pipette, die Abzieher Mikropipetten zieht mit einem hohen Grad an Genauigkeit und Konsistenz geregelt werden.
Insgesamt ist das Medikament gefüllte Pipette Methode in diesem Papier beschrieben eine sehr nützliche Lösung, wenn studying nativen nAChR in Neuronen in akuten Hirnschnitten gefunden ausgedrückt. Zusätzlich dazu, dass nützlich für die Untersuchung der Neurobiologie von Nikotinabhängigkeit und nicotinischen cholinergen Biologie ist diese Methode leicht auf andere Liganden-gesteuerte Ionenkanäle. 5-HT 3-Rezeptoren, GABA A-Rezeptoren und Glycin-Rezeptoren sind einige der anderen "cys-loop"-Rezeptoren, die untersucht die Verwendung dieser Techniken 21 werden kann.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Gewährung DA030396 unterstützt. Dank an die Mitglieder des Drenan Labor für hilfreiche Diskussionen und Kritik des Manuskripts. Besonderer Dank geht an Mi Ran Kim für technische Hilfe und Jonathan Thomas Ting um Rat bezüglich erwachsenen Maus Hirnschnitten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
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