Summary
במאמר זה, אנו מתארים שיטה יעילה ללמוד לתפקד ערוץ יון יגנד מגודר בנוירונים של פרוסות מוח מבודד בחריפות. שיטה זו כרוכה בשימוש בתרופה micropipette מלא ליישום מקומי של תרופות לתאי עצב שנרשמו באמצעות טכניקות מהדקות תיקון סטנדרטיות.
Abstract
שימוש בטבק מוביל לבעיות בריאותיות רבות, כולל סרטן, מחלות לב, אמפיזמה, ושבץ. התמכרות לעישון סיגריות היא הפרעה נפוצה נוירופסיכיאטריות שנובעת מפעולות biophysical והסלולריות של ניקוטין על קולטני אצטילכולין ניאציניות (nAChRs) ברחבי מערכת העצבים המרכזית. ההבנה תת nAChR השונה שקיימת באזורי המוח רלוונטיים להתמכרות לניקוטין היא בעדיפות עליונה.
ניסויים המשתמשים בשיטות electrophysiology כגון מהדק תיקון כל תאים או הקלטות מהדק מתח 2 ואלקטרודות שימושיים לאפיון תרופתי של nAChRs של עניין. תאים המבטא nAChRs, כגון תאי יונקי רקמות תרבות או ביציות Xenopus laevis, מבודד מבחינה פיזית ולכן הם למדו בקלות להשתמש בכלים של פרמקולוגיה המודרנית. התקדמות הרבה כבר נעשתה שימוש בטכניקות אלה, במיוחד כאשר הקולטן היעד כבר היה ידועביטוי אקטופי nd הושג בקלות. אולם לעתים קרובות, יש צורך ללמוד nAChRs בסביבה הטבעית שלהם: בתאי עצב בתוך פרוסות מוח חריף נקטפו מעכברים או חולדות מעבדה. לדוגמה, עכברים להביע יחידות משנה "רגישות יתר" nAChR כגון α4 עכברי L9'A 1 ועכברי α6'S L9 2, מאפשר זיהוי חד משמעי של נוירונים המבוססים על ביטוים התפקודי של מקטע nAChR ספציפי. למרות שהקלטות מהדקות תיקון כל תא מתאי עצב בפרוסות מוח נעשות באופן שגרתי על ידי electrophysiologist המיומן, הוא מאתגר מקומי כדי להחיל תרופות כגון אצטילכולין או ניקוטין לתא נרשם בתוך פרוסת מוח. הדילול של תרופות לתוך superfusate (יישום אמבטיה) הוא לא מהירות הפיך, ומערכות U-צינור אינן מותאמות בקלות לעבודה עם פרוסות מוח.
במאמר זה, אנו מתארים שיטה ליישום במהירות תרופות nAChR-מפעילות לנוירונים שנרשמו במבוגרים מ 'ouse פרוסות מוח. קלטות סטנדרטיות כל תאים עשויות מנוירונים בפרוסות, וmicropipette שני, מלאי סמים של הריבית תמרן לעמדה ליד התא המוקלט. הזרקה של אוויר דחוס או חנקן אינרטי לתוך פיפטה תרופה המלאה גורמת לכמות קטנה של פתרון תרופה להיפלט פיפטה אל התא המוקלט. באמצעות שיטה זו, זרמי nAChR בתיווך יכולים להיפתר ברמת דיוק של האלפית שני. זמני יישום תרופה בקלות יכולים להיות מגוונים, ופיפטה תרופה המלאה ניתן חזרה בו והחליפה עם פיפטה חדשה, המאפשרת לעקומות ריכוז בתגובה לתיוצרנה לנוירון בודד. למרות שתאר בהקשר של nAChR נוירוביולוגיה, טכניקה זו צריכה להיות שימושית ללימוד סוגים רבים של ערוצי יגנד מגודרי יון או קולטנים בתאי עצב מפרוסות מוח.
Protocol
1. הכנה של פתרונות להכנת Slice מוח ואלקטרופיזיולוגיה
- פתרונות להכנת פרוסות מוח תוארו בעבר 3, 4. הכן N-methyl-D glucamine (NMDG)-מבוסס פתרון התאוששות וחיתוך של הרכב הבא (במ"מ): 93 N-methyl D-glucamine, 2.5 KCl, 1.2 nah 2 PO 4, 30 3 NaHCO, 20 HEPES, 25 גלוקוז, 5 Na + ascorbate, 2 Thiourea, 3 Na + פירובט, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0.5 CaCl 2 • 2H 2 O. התאם ל300-310 mOsm עם NMDG. התאם לחומציות 7.3-7.4 עם 10 N HCl.
- ממס MgSO 4 • 7H 2 O וCaCl 2 • 2H 2 O במי Millipore לעשות 2 פתרוני מניות M של כל אחד.
- תשקול את הרכיבים אחרים בהסדר המפורט ולהוסיף לבקבוק נפחית מלאה חלקית במי Millipore תוך ערבוב להמסה. פעם הכל הוא הוסיף, למלאבקבוק מים עם הנפח Millipore.
- מדוד את ה-pH ולהתאים עם 10 N HCl.
- מדוד את אוסמולריות ולהתאים עם NMDG במידת צורך.
- הכן HEPES מחזיק נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF) של הרכב הבא (במ"מ): 92 NaCl, KCl 2.5, 1.2 nah 2 PO 4, 30 3 NaHCO, 20, 25 HEPES גלוקוז, 5 Na + ascorbate, 2, 3 Thiourea Na + פירובט, 2 4 MgSO • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. התאם ל300-310 mOsm עם סוכרוז. התאם לחומציות 7.3-7.4 עם N HCl 1 או NaOH.
- תשקול את המרכיבים לפי הסדר הרשום ולהוסיף לבקבוק נפחית מלאה חלקית במי Millipore תוך ערבוב להמסה. פעם הכל הוא הוסיף, למלא בקבוק במי נפחית Millipore.
- מדוד את ה-pH ולהתאים עם NaOH או HCl במידת צורך.
- מדוד את אוסמולריות ולהתאים עם סוכרוז במידת צורך.
- הכן את הפתרון הסטנדרטי aCSF הקלטה של הרכב הבא (במ"מ): 124 NaCl, KCl 2.5, 1.2 nah 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12.5 גלוקוז, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. התאם ל300-310 mOsm עם סוכרוז. התאם לחומציות 7.3-7.4 עם N HCl 1 או NaOH.
2. הכנה של פרוסות מוח החריפות
- חיתוך והתאוששות פרוסת מוח נעשים כמתוארים 3, 4 בעבר. שתי מנות קריסטל בועות מלאות בNMDG פתרון התאוששות עם חמצן 95% / 5% 2 גז CO (carbogen), צלחת אחת על קרח, השני על 33 ° C.
- מנת גביש בועה אחד מלא עם HEPES מחזיק aCSF עם carbogen בטמפרטורת חדר.
- הרדם עכבר בוגר (גילי 2 עד 12 חודשים) עם Na + פנטוברביטל (200 מ"ג / ק"ג, ip). להמשיך בהליך כאשר בעלי החיים אין לה מענה לבוהן קמצוץ.
- במידת צורך, לחתוך דגימת רקמת זנב למועד מאוחר יותר genotyping של בעלי החיים.
- פתח את חלל החזה, לחשוף את הלב, ומהדק את אב העורקים היורד. פצע את העלייה הימנית.
- Transcardially ינקב את החיה עם 5-10 מ"ל של 0-4 ° C NMDG פתרון התאוששות.
- לערוף חיה, הסר את המוח ולמקם אותו בפתרון 4 ° C-NMDG התאוששות עבור 1 דקות.
- על לוחית מתכת קרח צוננת, חתוך את המוח בכיוון הרצוי (עטרה, parasagittal, אופקי, וכו ') כך שאכלול את השטח של עניין.
- להדביק בלוק המוח בדבק מגע למשטח השלב היבש של מבצעה רוטט (DSK-Zero 1; Dosaka), להטביע את הבלוק במוח 4 מעלות צלזיוס פתרון NMDG התאוששות, והרף בועת הפתרון עם carbogen.
- לחתוך פרוסות של האזור במוח של עניין. עובי פרוסה הוא 200-400 מיקרומטר, בהתאם לאזור הספציפי במוח של עניין, גיל חיה, והניסוי שבצע.
- מייד לאחר חיתוך, פרוסות רצויות אינקובטורים בcarbogenated, 33 ° C-NMDG התאוששות solutiבבדיוק 12 דקות, ולאחר מכן להעביר ל, HEPES טמפרטורת החדר carbogenated מחזיק פתרון לתקופה ראשונית של 60 דקות. לאחר הדגרת 60 דקות זה, פרוסות יכולות לשמש להקלטה. פרוסות נשמרות בHEPES מחזיק פתרון כל היום, עד שהם משמשים להקלטה.
3. הקלטת קלאמפ תיקון מנוירונים בפרוסות מוח
- משוך micropipette תיקון סטנדרטי עם תכנות Flaming-בראון חולץ (סאטר P-97 או חולץ אנכי מקביל). Pipettes שהם אופטימליים להיווצרות חותם גיגה אוהם בדרך כלל יש התנגדות של 4-6 MΩ
- העברת פרוסה אחת לתא ההקלטה (RC-27L; מכשירי Warner) על הבמה של מיקרוסקופ זקוף (ניקון FN-1). רציפות superfuse (1.5-2.0 מ"ל / דקה) עם פרוסת carbogenated, ההקלטה aCSF הסטנדרטי מחוממת ומתוחזק על 32 ° C. לחלופין, פרוסות יכולות להישמר בטמפרטורת חדר.
- אתר ומרכז האזור במוח של ריבית באמצעותמטרת אוויר 10X (ניקון התכנית פלואוריד 10X; NA 0.3; WD: 16 מ"מ).
- דמיינו נוירונים בודדים באמצעות אובייקטיבי 40X קרוב אינפרא אדום (IR) מי טבילה (ניקון APO 40XW; NA: 0.80; WD: 3.5 מ"מ) מחוברים לניגוד IR-הפרש התערבות (DIC) אופטיקה ומהירות גבוהה ליד אינפרא אדום טעון מכשיר יחד (CCD) מצלמת וידאו (Hamamatsu C-7500). תחת תצפית IR-DIC, נוירונים בריאים מפגינים קרום פלזמה חלקה, בצבע אפור בהיר.
- מלא micropipette עם פתרון הקלטה תאי מתאים. עבור רוב היישומים, אנו משתמשים בפתרון הבא (במ"מ): 135 גלוקונאט האשלגן, 5 EGTA, 0.5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, ו -0.1 GTP (חומציות מותאמת ל7.25 עם טריס בסיס, אוסמולריות מותאם ל290 mOsm עם סוכרוז). להקים הקלטה כל תא מתאי עצב באופן חזותי.
4. יישום מקומי של תרופות לנוירונים בפרוסות
- משוך micropipette מהדק תיקון סטנדרטי כפי שתואר לעיל. שימושחולץ פיפטה כגון סאטר P-97 שמייצר שני טיפים זהים "אחותי" מאותה חתיכת הזכוכית הוא יתרון כאשר פתרונות תרופתיים רבים יש לעשות שימוש באותו התא. עצת גדלים שיש להם התנגדות של ~ 5 MΩ אם הם היו מלאים בפתרון התאי שתואר לעיל הם אופטימליים.
- המילוי החוזר micropipette עם תמיסה של תרופה בדילול aCSF ההקלטה carbogenated, הסטנדרטי. כוון את הקצה כלפי מטה, ומעיפי micropipette תרופה המלא כדי להסיר כל בועות אוויר שנלכדו בעמודה של פתרון.
- הר micropipette תרופה המלאה בבעל פיפטה מחובר עם צינורות למערכת מתאימה לחץ פליטה, כגון Picospritzer III (כללי Valve ושות). בעל פיפטה צריך להיות מותקן על גבי micromanipulator עם אותה הרזולוציה של מניפולטורים נפוצים להקלטת מהדק תיקון (לדוגמה, סאטר MP-285). בנוסף, מניפולטור צריך לאפשר תנועה אלכסונית לתוך ומחוץ לפרוסה. גברually להוציא לחץ 3 עד 4 פעמים בmicropipette כדי לבנות את הלחץ מתאים מאחורי עמוד הנוזל.
- באמצעות פקדי micromanipulator, להנמיך פיפטה התרופה לפרוסה תוך לדמיין את הקצה מתחת אופטיקה IR-DIC. אופן אידיאלי, צריך לזהות ויזואלית והמרכז נוירון שיירשם מ, ואחרי המיצוב של פיפטה הסמים ליד התא לפני הפחתת micropipette ההקלטה לפרוסה. מיצוב פיפטה התרופה יכולה לגרום לתנועה של רקמות באזור התא המוקלט שעלולות לשבש את ההקלטה אם פיפטה התרופה עברה לתפקיד לאחר הקמת חותם gigaohm.
- באמצעות וידאו IR, למקם micropipette הסמים במשטח העליון של פרוסת הרקמה. Execute פליטה 1 לחץ וצג 1) הסביבה של הקצה לתנועה של פסולת קשורה לפליטה, ו 2) בקצה micropipette עבור כל סימנים שהעצה היא סתומה או חסומים. אם הקצה חסום / סתום, לחזור בי pipettדואר ולהחליפו באחד חדש.
- מתקרב לתא המוקלט אלכסון מהחלק העליון של הפרוסה כך שכאשר במצב סופי, קצה פיפטה תרופה המלאה הוא 1) באותו המישור מוקד (או מעט מתחתיו) כתא מוקלט וקצה החוט הרושם , ו 2) 10-40 מיקרומטר מהתא המוקלט. אם קצה פיפטה תרופה מלאה הוא מעל לתא המוקלט, הכח מפליטת הלחץ עלול לשבש את חותם gigaohm.
- רשום את התגובה התאית הרצויה תוך כדי החזקה הסלולרית במצב מהדק מתח או במצב הנוכחי מהדק. אנחנו באופן שגרתי להקליט אצטילכולין ו / או ניקוטין שהושר זרמים סלולריים תוך החזקת נוירונים במצב מהדק מתח. למרות שיכולה להיות מופעלת על פליטת לחץ ידני בעת שימוש Picospritzer שלישי, לתוצאות יותר לשעתק מומלץ להפעיל לחץ הפליטה באמצעות מערכת הרכישה (אקסון Digidata 1440 וpClamp 10.3) עם דיגיטלי TTL דופק.
5. שליטהmicropipette תרופות המלאה עם מתורגמן פיזואלקטריים
- אם אפשר, הר בעל פיפטה תרופה המלאה למתרגם-ממד אחד פיזואלקטריים (למשל Piezojena רשות-100 או Burleigh PZM-150), כי הוא מסוגל לקבל קלט אנלוגי מתח (שוב, ממערכת הרכישה), אשר לאחר מכן רכוב על micromanipulator הדיוק גבוה (סאטר MP-285). מתורגמן פיזואלקטריים שימושי כי התנועה של פיפטה תרופה המלאה לתוך ומחוץ לפרוסה, כולל תזמון והמהירות של כניסה / יציאה, ניתן לשלוט בקלות רבה יותר ולשכפל מניסוי לניסוי. כאשר לומדים nAChRs, השפעות להקהות רגישויות של דליפה מניקוטין פיפטה תרופה המלאה, צריכים פעם הם מתרחשים, הם מזעריים כאשר פיפטה מועברת רק בסמוך לתא עם מתרגם פיזואלקטריים לרגע של פליטת לחץ.
- שימוש בפוטנציומטר ידני המבוקר על מגבר בקרת המתח פיזואלקטריים, חייג מתחלערכו המקסימאלי.
- שימוש micromanipulator, עמדת פיפטה תרופה המלאה בפרוסה בי פיפטה תהיה להוציא את תכולתו על התא המוקלט, ולחזור בו באופן ידני על ידי הפחתת פיפטה המתח לאפס על מגבר בקרת המתח פיזואלקטריים.
- שימוש באות פלט אנלוגית מרכישת מערכת ההקלטה, להזיז את פיפטה תרופה המלאה לפרוסה על פני תקופה של 250 אלפיות שניים מתחילים 300 אלפיות שניים לפני שלחץ פליטת TTL הדופק מתרחש. לחזור בי פיפטה על פני תקופה של 250 אלפיות שני, החל 50 אלפית שני לאחר TTL הדופק מסתיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסויים שלנו, אנחנו באופן שגרתי להקליט מדופמין (DA)-ייצור תאי עצב באזור גחון tegmental (VTA) וsubstantia nigra החלקי compacta (SNC). במצב מתח מהדק, יישום לחץ של אצטילכולין או ניקוטין לתאים אלה בדרך כלל תוצאה נוכחית מהירה, פנימה קטיון שמגיע לשיא תוך 100-200 אלפיות (איור 1 א, ב). דעיכתו של הזרם מוכתבת במידה רבה על ידי הפצת הסמים מהאתר של פעולה, והאם אנזימים בפרוסה נמצאים לעכל את התרופה לצורה פעילה. לדוגמה, אח הוא במהירות על ידי הידרוליזה acetylcholinesterases הנמצא על פני השטח של תאים באזורים במוח שעשיר בDA נוירונים 5. דבר זה מביא לדעיכה מהירה של עכשווי הוליד (איור 1 א). בניגוד לכך, ניקוטין הוא לא עבר הידרוליזה וזרמי ניקוטין עוררו לא יתפרקו באותה מהירות כמו ACH-עורר זרמים (1B איור), המאפשר לה מאוד פעיליםאכלתי ורגישות 6 nAChRs.
מערכות פליטת לחץ לאפשר למפעיל להשתנות הזמן של דופק הלחץ. תכונה זו שימושית בלימוד nAChRs על פני השטח של תאי עצב בתוך פרוסות מוח, שכן היא מאפשרת לחוקר לקבוע אם הנוכחי עורר המרבי הושג בתגובה לדופק של תרופה. לדוגמה, שתי העקבות ב2 תכנית איור ש250 אלפיות השני של יישום תרופה (אפור זכר) או אולי לא יכול לחשוף סופי מרבית-עורר נוכחי, בעוד 1,000 אלפיות של יישום תרופה (עקבות שחורות) מניב מקסימום ברור נוכחי ועוד כמה יציב מדינת הקהיה. פתרון זרמים כאלה "שיא" הוא חיוני בעת בניית עקומה מדויקת ריכוז תגובה, או כאשר לומדים הקהית nAChR.
הנוירונים במוח התיכון DA הגחון לעתים קרובות לירות פוטנציאלי פעולה ספונטניים כאשר נרשמו בתוך פרוסות מוח חריפה 7, 8. עכברי'S α6 L9, הלשעברלחץ nAChRs שמגיב בחריפות לריכוזים נמוכים 10-100-קיפול של ניקוטין או ACH 2, 9-11, מפגין תנועה מוגברת בתגובה לזריקות ניקוטין. כדי לקשר בין פעילות עצבית (ירי פוטנציאל פעולה) עם התנהגות, כדאי ליישם ניקוטין לנוירונים α6 L9 התובע המחוזי שנרשמו במצב-מהדק נוכחי. בדרך כלל, יישום מקומי של ניקוטין (1 מיקרומטר) לנוירונים α6 L9 של דה ויגרום להאצה מהירה וזמנית של ירי שדועך בחזרה לנקודת התחלה תוך שניות 30-40 2 (איור 3, פנל העליון). תגובות כאלו לניקוטין בקלות לכימות (3 איור, פנל תחתון) עם תוכנת ניתוח מתאימה (למשל pClamp; התקנים המולקולריים קורפ).
ניסויים בתאי תרבית או ביציות Xenopus עם nAChRs הביע ectopically ליהנות מהיתרון שסדרה של ריכוז תרופה יכולה להיות מיושמת על כל תא רשם 12. בתוךהנוירונים בתוך פרוסות מוח, בדרך כלל עקומת ריכוז-תגובה לא אפשרי, ותגובות לריכוז יחיד של תרופה לעתים קרובות דיווחו 1. עם זאת, פיפטה תרופה מלאה כפי שתואר במאמר זה ניתן לשנות שוב ושוב כדי לאפשר לריכוזים שונים של תרופה שיחולו על אותו התא שהוקלט בתוך פרוסת מוח 2, 8, 13, 14. איור 4 מראה נתונים מייצגים מן נוירון הבודד נרשם התובע שהיה מגורה עם שלושה ריכוזים של ACH. ניסיון של החוקר, בשילוב עם micromanipulator מאוד יציב מחזיק פיפטה תרופה המלאה, הם גורמים קריטיים מובילים להצלחה בסוג זה של ניסוי. כשמוצלח, גישה זו מספקת מידע רב ערך אודות תרופתי nAChRs ילידים.
הנוירונים במוח, כולל פרוסות סוגי התאים uncharacterized או אלה המצויים באזורי מוח עם אוכלוסייה הטרוגנית, לעתים קרובות מסווגים באמצעות ele הבסיסי השונהצעדי ctrophysiological ו / או מורפולוגי 15. לדוגמה, הביטוי שלי h פוטנציאל הנוכחי, מנוחת קרום, קצב ירי ספונטני, וגודל תא הוא אמצעי אופייני בשימוש כדי לאפיין DA נוירונים 2, 7, 8, 16, 17. שימוש בשיטה שלנו, אפשר גם לאפיין הנוירונים בהתבסס על התגובה שלהם לניקוטין מיושם באופן מקומי או ACH 18, 19. לדוגמה, colliculus המעולה (SC) הוא אזור במוח הטרוגנית ויחסית uncharacterized עם ביטוי גבוה מאוד של nAChRs השונה, כוללים אלה המכילים 20 יחידות משנה α6. בפרוסות מוח מα6 עכברי'S L9, הקליטו ממספר הנוירונים SC וניקוטין מיושם (1 מיקרומטר) באמצעות פליטת לחץ עם פיפטה ניקוטין מלאה. שני סוגים שונים תגובה נצפו: 1) הפעלה של זרמי postsynaptic מעכבים (IPSCs) (איור 5, סוג I תגובות), ו2) זרמים פנימה קטיון גדולים עם כמה inductiעל זרמי postsynaptic מעוררים (EPSCs) (איור 5, תגובות Type II).
השימוש במתורגמן פיזואלקטריים מציע את היתרון שפיפטה תרופה המלאה יכולה להיות מוחזקת במצב נייח במרחק של לפחות 100 מיקרומטר מהתא נרשם עד שהוא עבר במהירות בסמוך לתא לפליטת הלחץ. זה שימושי כי יכול להיות אוטומטי תנועת פיפטה ועולה בקנה אחד מתא לתא וביום ליום. זה גם שימושי כאשר ריכוזים גבוהים של ניקוטין (שרגישות nAChRs) חלים על התא נרשם, כפי שהוא ממזער את ההשפעה של דליפת ניקוטין מפיפטה תרופה המלאה צריך את זה אי פעם יתרחש. כדי להדגים את העקביות של זרמי nAChR כאשר באמצעות מתורגמן פיזואלקטריים, הקליט מתא עצב VTA תובע בפרוסות מוח מα6 עכברי'S L9. האיור 6 מציג תגובות רצופות באותו α6 L9'S VTA התובע נוירון בתגובה לריכוזים של n icotine שמאוד רגיש ולהפעיל α6 nAChRs * (מיקרומטר 1: איור 6 א; 10 מיקרומטר: התרשים 6B). אם אפשר ברציפות לדלוף אל התא המוקלט, ריכוזים אלה של ניקוטין שניתן היו לצפות לרגישות nAChRs על פני התא, והתגובה השנייה תהיה מוחלש יחסית לתגובה הראשונה.
איור 1. תגובות nAChR ייצוג בנוירונים התובע.. התובע נוירון במוח עכבר פרוסת WT היה מתח מהודק, ואחרי יישום מקומי של ACH (100 מיקרומטר) באמצעות פליטת לחץ (250 אלפיות) באמצעות תרופה מלאה 2 פיפטה. סרגל קנה מידה: 100 רשות פלסטינית, 3 שניות ב.. ניסוי בוצע כמתואר ב, פרט לכך שהניקוטין (100 מיקרומטר) היה מוחל על תובע נוירון. סרגל קנה מידה: 60 רשות פלסטינית, 3 שניות.
ogether.within עמודים = "תמיד"> 
איור 2. פתרון זרמי שיא בזמן יישום תרופה משתנית. התובע נוירון במוח עכבר פרוסת WT היה מתח מהודק, ואחרי יישום מקומי של ACH (100 מיקרומטר). שתי תגובות מוצגות לאותו התא מוקלט, בי ACH נפלט מפיפטה תרופה המלאה עבור 250 אלפיות שני (אפור זכר) או 1000 אלפיות שני (עקבות שחורות). סרגל קנה מידה: 50 רשות פלסטינית.
איור 3. לימוד פוטנציאל פעולת ירי בעקבות יישום סמים מקומי. התובע נוירון במוח עכבר פרוסת'S α6 L9 נרשם במהדק הנוכחי (אני = 0) מצב, ופוטנציאל פעולה ספונטני נצפו. ניקוטין (1 מיקרומטר) יושם באמצעות פליטת לחץ (250 אלפיות שני), ושינויים בפוטנציאל פעולת ירי שיעור ופוטנציאל הממברנה מנוחה היונצפה. השימוש בתוכנת pClamp (חיפוש סף), קצב ירי מיידי נגזר ומוצג בפנל התחתון.
איור 4. יישומי תרופות מרובות לאותו התא מוקלט. התובע נוירון במוח עכבר פרוסת'S α6 L9 נרשם במצב מהדק מתח. פיפטה תרופה מלאה הייתה בשימוש באופן מקומי להחלת ACH (1 מיקרומטר; 250 אלפיות השני). תוך כדי להקליט מהתא, פיפטה תרופה המלאה הוצאה מהפרוסה והוחלפה בפיפטה אחרת מלאה עם 3 מיקרומטר ACH. תגובה ל3 מיקרומטר ACH נרשמה, והתהליך חזר על עצמו שוב ל10 מיקרומטר ACH. סרגל קנה מידה: 100 רשות פלסטינית, 1.5 שניות.
איור 5. סיווג של נוירונים לפי סוג תגובת nAChR.קבוצה של נוירונים מעולים colliculus (SC) בפרוסת α6'S L9 עכבר המוח הייתה מתח מהודק, ואחרי יישום מקומי של ניקוטין (1 מיקרומטר) באמצעות פליטת לחץ. סוג I נוירונים הציגו IPSCs גדל בעקבות יישום ניקוטין. הנוירונים סוג II הציגו זרמים פנימה גדולים וEPSCs המוגבר בתגובה לבקשה לניקוטין. סרגל קנה מידה: 20 רשות פלסטינית, 3 שניות.
איור 6. מתורגמן פיזואלקטריים מציע עקביות ומגן מפני זליגת סמים.. VTA התובע נוירון במוח פרוסה מעכבר'S α6 L9 נרשם במצב מהדק מתח במהלך יישום של ניקוטין מיקרומטר 1. פיפטה ניקוטין המלאה הונחתה לעמדה סופית לפני פליטת הלחץ וחזרה בו לאחר הפליטה באמצעות מתורגמן פיזואלקטריים. תגובה שנייה נרשמה 2 דקות לאחר fiRST על מנת להוכיח כי אין הקהית nAChR התרחשה. סרגל קנה מידה: 100 רשות פלסטינית, 8 שניות ב '.. תגובות nAChR בנוירונים α6 L9'S VTA התובע נרשמו כב, אבל ניקוטין מיקרומטר 10 יושם. סרגל קנה מידה: 100 רשות פלסטינית, 8 שניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה שהוצגה במאמר זה היא רחב שימושית לחקר תפקוד ערוץ היון יגנד מגודר בהכנות פרוסות מוח. עם זאת, יש מספר גורמים שישפיעו באופן משמעותי את האיכות והשחזור של נתונים ניסיוניים הנובעים מניצול שיטה זו. לדוגמה, זרמים מעוררים רגישים מאוד לקוטר של קצה פיפטה תרופה המלאה. טיפים קטנים יגרמו קושי בלהוציא את פתרון הסמים, וטיפים גדולים עם התנגדות נמוכה יהיו יותר סיכוי לשבש את חותם gigaohm בין התא המוקלט והחוט הרושם. מגבלה של השיטה הוצגה אחת אחרת היא שתאים בתוך 10 מיקרומטר של התא נרשם עלולים להיות חשופים לסמים מפיפטה תרופה המלאה, שעשוי להגביר את פעילותם ועלול להשפיע על התאים המוקלטים.
כאשר פונים לסמים לתא מספר רבות של פעמים באותה פיפטה סמים, זה קריטי, כי יוחזר לפיפטהבדיוק באותו התפקיד בפרוסה לכל יישום. אפילו חריגות קטנות (1-2 מיקרומטר למשל) במיקום מתגובה אחת לשנייה לעתים קרובות לגרום להבדלים משמעותיים בתגובה לשיא שנצפתה. מתורגמן לתכנות פיזואלקטריים (כמתואר לעיל) או micromanipulator רובוטית הוא יתרון עבור מיצוב פיפטה הסמים. שיקול מרכזי נוסף הוא עומקו של התא נרשם בתוך הפרוסה. תרופות לעתים קרובות מפוזרות מתא על פני השטח של הפרוסה במהירות רבה יותר, ואילו תרופה ניתן "לכודים" בתוך הפרוסה כשנפלטה אל תא שנמצא עמוק בתוך הפרוסה. לעתים קרובות זהו שיקול מרכזי בעת החלת ניקוטין, שקלות desensitizes nAChRs כאשר זמני חשיפה ארוכים מ 100-200 אלפיות. כמו כן, לחץ (באטמוספרות) שייפלט לתוך פיפטה תרופה המלאה ואת כמות הזמן שלחץ מוחל (איור 2) הם שיקולים חשובים עבור פרשנות nAChR דה הנוכחיתטה. אנו משתמשים באופן שגרתי 10-12 psi של לחץ, ואנו מוצאים כי 250 אלפיות שניים הם זמן מספיק כדי לפתור זרמי שיא nAChR מבלי לגרום להפחתת רגישות הקולטן נרחבת.
יתרון מרכזי של השיטה שאנו מתארים הוא יכולת טיפי טפטפות תרופה מלאת חליפין, כך שריכוזי התרופות המרובים יכולים להיות מיושמים לאותו התא העצב. שיקולים עיקריים כאשר pipettes החלפה הם 1) שינוי במיקום פיפטה טיפ מריכוז אחד למשנו, ו2) השתנות בקוטר קצה פיפטה. מיקום קצה פיפטה בדרך כלל ניתן לשלוט כראוי עם מצלמה ברזולוציה גבוהה IR-ליד וידאו וmicromanipulator מדויק. השתנות בקוטר קצה פיפטה ניתן לשלוט באמצעות "pipettes אחות" בכל הזדמנות אפשרית, ובאמצעות חולץ פיפטה שמושך micropipettes עם רמה גבוהה של דיוק ועקביות.
בסך הכל, שיטת פיפטה תרופה המלאה המתוארת במאמר זה היא גישה מאוד שימושית כאשר studyinAChRs ילידי ng מתבטא בנוירונים הנמצאים בפרוסות מוח חריפות. בנוסף להיות שימושי לחקר נוירוביולוגיה של תלות בניקוטין וביולוגית כולינרגית ניקוטינית, שיטה זו היא קלות החלימה על תעלות יוני יגנד מגודרים אחרות. 3 קולטניים 5-HT, גאבא A רצפטורים, ואת הקולטנים גליצין הם כמה מקולטנים האחרים "cys הלולאה" שניתן ללמוד באמצעות טכניקות אלה 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) המענק DA030396. תודה לחברים במעבדת Drenan לדיון וביקורת של כתב היד מסייע. תודה מיוחדת למי ראן קים לסיוע טכני וג'ונתן תומס טינג לייעוץ לגבי פרוסות מוח עכבר בוגרות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscience. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
