Summary
इस पत्र में, हम ligand-gated आयन चैनल समारोह तीव्रता पृथक मस्तिष्क स्लाइस की न्यूरॉन्स में अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी विधि का वर्णन है. इस विधि के मानक पैच दबाना तकनीक का उपयोग कर दर्ज न्यूरॉन्स के लिए दवाओं की स्थानीय आवेदन के लिए एक दवा से भरे micropipette का इस्तेमाल शामिल है.
Protocol
1. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी और इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए समाधान की तैयारी
- मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के लिए समाधान पहले 3, 4 में वर्णित किया गया है. 93 डी एन मिथाइल - glucamine, KCl 2.5, 1.2 नाह 2 4 पीओ, 30 3 NaHCO, 20 HEPES, 25: एन मिथाइल (NMDG) D-glucamine - आधारित काटने और निम्नलिखित संरचना की वसूली समाधान (मिमी) तैयार ग्लूकोज, ना 5 + एस्कॉर्बेट, thiourea 2, 3 Na + पाइरूवेट, 10 MgSO 4 • 7 2 हे, 0.5 CACL 2 2H 2 • ओ 300-310 mOsm NMDG साथ समायोजित करें. 7.3-7.4 10 एन एचसीएल के साथ पीएच को समायोजित करें.
- MgSO • 4 7 2 हे और CACL 2 • 2H 2 हे Millipore पानी में भंग करने के लिए प्रत्येक के 2 एम स्टॉक समाधान.
- बाहर सूचीबद्ध क्रम में अन्य घटकों वजन और Millipore पानी के साथ एक बड़ा आंशिक रूप से भरा फ्लास्क जोड़ने जबकि भंग करने की आलोड़न. एक बार सब कुछ जोड़ा जाता है भरने,Millipore पानी के साथ बड़ा फ्लास्क.
- पीएच उपाय और 10 एन एचसीएल के साथ समायोजित.
- Osmolarity उपाय और NMDG यदि आवश्यक हो तो साथ समायोजित.
- 92 NaCl, KCl 2.5, 1.2 नाह 2 4 पीओ, 30 3 NaHCO, 20 HEPES, 25 ग्लूकोज, 5 ना + एस्कॉर्बेट, thiourea 2, 3 ना: निम्नलिखित संरचना के कृत्रिम मस्तिष्कमेरु (aCSF) द्रव (मिमी) धारण HEPES तैयार + पाइरूवेट, 2 4 MgSO • 7 ओ 2, 2 2 CACL 2H 2 • ओ Sucrose के साथ 300-310 mOsm को समायोजित करें. 7.3-7.4 एन 1 एचसीएल या NaOH के साथ पीएच को समायोजित करें.
- बाहर सूचीबद्ध क्रम में घटकों वजन और Millipore पानी के साथ एक बड़ा आंशिक रूप से भरा फ्लास्क जोड़ने जबकि भंग करने की आलोड़न. एक बार सब कुछ जोड़ा जाता है, Millipore पानी के साथ बड़ा फ्लास्क को भरने.
- पीएच उपाय और NaOH या एचसीएल के साथ समायोजित अगर जरूरत.
- Osmolarity उपाय और यदि आवश्यक sucrose के साथ समायोजित.
- 124 NaCl, KCl 2.5, 1.2 नाह 2 4 पीओ, 24 NaHCO 3, 12.5 ग्लूकोज, 2 4 MgSO • 7 2 हे, 2 2 CACL 2H 2 • ओ: निम्नलिखित संरचना के मानक aCSF रिकॉर्डिंग समाधान (मिमी) तैयार Sucrose के साथ 300-310 mOsm को समायोजित करें. 7.3-7.4 एन 1 एचसीएल या NaOH के साथ पीएच को समायोजित करें.
2. तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें की तैयारी
- ब्रेन टुकड़ा काटने और वसूली के रूप में पहले से 3, 4 में वर्णित किया जाता है. बुलबुला दो क्रिस्टल व्यंजन 95% ऑक्सीजन / 5% सीओ 2 गैस (carbogen), बर्फ पर एक पकवान, पर अन्य 33 डिग्री सेल्सियस के साथ वसूली समाधान NMDG के साथ भरा
- बुलबुला एक क्रिस्टल पकवान कमरे के तापमान पर carbogen साथ पकड़े हुए aCSF HEPES के साथ भरा.
- + ना pentobarbital (200 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के साथ वयस्क चूहे (2 से 12 महीने की आयु वर्ग) anesthetize. प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ें जब जानवर एक पैर के अंगूठे चुटकी कोई जवाब नहीं है.
- यदि आवश्यक हो, बाद में genotyp के लिए एक पूंछ ऊतक नमूने में कटौतीजानवर की रही है.
- छाती गुहा खोलें, दिल का पर्दाफाश, और उतरते महाधमनी घोड़े का अंसबंध. सही atrium चीर - फाड़ करना.
- Transcardially 0-4 ° C NMDG वसूली समाधान के 5-10 मिलीलीटर के साथ पशु छिड़कना.
- पशु वध करना, मस्तिष्क को हटाने और 4 ° C NMDG वसूली समाधान में यह 1 मिनट के लिए जगह है.
- एक बर्फ से ठंडा धातु प्लेट, वांछित अभिविन्यास (राज्याभिषेक, parasagittal, क्षैतिज, आदि) में मस्तिष्क ट्रिम हित के क्षेत्र शामिल हैं.
- Superglue के साथ मस्तिष्क एक हिल slicer की सूखी चरण सतह ब्लॉक प्रत्यय (1 DSK शून्य, Dosaka), 4 में डूब मस्तिष्क ब्लॉक ° सी समाधान NMDG वसूली, और carbogen साथ लगातार बुलबुला समाधान.
- ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र के स्लाइस काटें. स्लाइस मोटाई 200-400 सुक्ष्ममापी है, हित के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र, पशु उम्र, और प्रयोग के लिए किया जाएगा पर निर्भर करता है.
- काटने के तुरंत बाद, में सेते वांछित स्लाइस carbogenated, 33 ° C NMDG वसूली solutiवास्तव में 12 मिनट के लिए, तो carbogenated, कमरे के तापमान पर 60 मिनट की एक प्रारंभिक अवधि के लिए समाधान धारण HEPES हस्तांतरण. इस 60 मिनट ऊष्मायन के बाद, स्लाइस रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्लाइसें दिन भर समाधान धारण HEPES जब तक वे रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं में रखा जाता है.
3. मस्तिष्क स्लाइसें में न्यूरॉन्स से पैच दबाना रिकॉर्डिंग
- एक प्रोग्राम ज्वलंत ब्राउन डांड़ी (Sutter P-97 या समकक्ष खड़ी डांड़ी) के साथ एक मानक पैच micropipette खींचो. Pipettes कि giga ओम सील गठन के लिए इष्टतम हैं आम तौर पर 4-6 MΩ का प्रतिरोध किया है
- एक ईमानदार माइक्रोस्कोप (Nikon FN-1) के मंच पर, रिकॉर्डिंग चैम्बर (वार्नर उपकरण RC-27L) स्थानांतरण करने के लिए एक टुकड़ा. टुकड़ा carbogenated, मानक रिकॉर्डिंग aCSF के साथ गर्म और 32 में बनाए रखा ° सी. लगातार (2.0 मिलीग्राम / मिनट 1.5) superfuse वैकल्पिक रूप से, स्लाइस कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है.
- पता लगाएँ और केंद्र का उपयोग कर ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्रएक 10X हवा उद्देश्य (Nikon योजना Fluor, 10X NA 0.3; WD: 16 मिमी).
- 40X निकट अवरक्त (आईआर) पानी विसर्जन (: 0.80, WD: NA Nikon APO 40XW 3.5 मिमी) उद्देश्य का उपयोग करते हुए व्यक्तिगत न्यूरॉन्स कल्पना IR अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी अवरक्त के पास और एक उच्च गति से जुड़ा युग्मित डिवाइस का आरोप लगाया (सीसीडी) वीडियो कैमरा (हमामात्सू सी - 7500). आईआर - डीआईसी अवलोकन के तहत, स्वस्थ न्यूरॉन्स एक चिकनी, हल्के भूरे प्लाज्मा झिल्ली दिखा रहे हैं.
- एक उपयुक्त intracellular रिकॉर्डिंग समाधान के साथ एक micropipette भरें. 135 पोटेशियम gluconate, 5 EGTA, 0.5 2 CACL, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 मिलीग्राम एटीपी और 0.1 GTP (पीएच Tris आधार, osmolarity के साथ 7.25 समायोजित: सबसे अनुप्रयोगों के लिए, हम निम्नलिखित समाधान (मिमी) का उपयोग करें sucrose साथ 290 mOsm) समायोजित. एक visualized न्यूरॉन से एक पूरे सेल रिकॉर्डिंग की स्थापना.
4. स्लाइस में न्यूरॉन्स के लिए ड्रग्स की स्थानीय आवेदन
- ऊपर वर्णित के रूप में एक मानक पैच दबाना micropipette खींचो. का प्रयोगP-97 Sutter कि दो समान कांच के एक ही टुकड़े से "बहन" सुझावों का उत्पादन के रूप में एक विंदुक खींचने फायदेमंद है जब कई दवा समाधान के लिए एक ही सेल पर इस्तेमाल किया जा रहे हैं. टिप आकार है कि ~ MΩ 5 के एक प्रतिरोध है अगर वे intracellular ऊपर वर्णित समाधान के साथ भरा गया होगा इष्टतम हैं.
- बैकफ़िल में पतला carbogenated, मानक रिकॉर्डिंग aCSF दवा की एक समाधान के साथ micropipette. टिप नीचे प्वाइंट, और दवा से भरे किसी भी हवा समाधान के कॉलम में फंस बुलबुले को दूर micropipette झटका.
- दवा से भरे एक विंदुक टयूबिंग के साथ एक Picospritzer III (जनरल वाल्व कं) के रूप में एक उपयुक्त दबाव इंजेक्शन प्रणाली, से जुड़ा धारक में micropipette माउंट. विंदुक धारक ही संकल्प के साथ एक micromanipulator पर रखा जाना चाहिए के रूप manipulators आमतौर पर पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, Sutter सांसद 285). इसके अतिरिक्त, मैनिप्युलेटर में और टुकड़ा से बाहर विकर्ण आंदोलन के लिए अनुमति चाहिए. आदमीually micropipette में 3 से 4 बार दबाव बेदखल क्रम में तरल पदार्थ के स्तंभ के पीछे पर्याप्त दबाव बनाने के लिए.
- Micromanipulator नियंत्रणों का उपयोग, टुकड़ा में दवा विंदुक कम जबकि IR डीआईसी-प्रकाशिकी के तहत टिप visualizing. आदर्श रूप में, एक नेत्रहीन की पहचान करने और एक से दर्ज किया जा न्यूरॉन, टुकड़ा में रिकॉर्डिंग micropipette को कम करने के लिए पहले सेल के पास दवा विंदुक की स्थिति के द्वारा पीछा केंद्र होना चाहिए. दवा विंदुक पोजिशनिंग दर्ज सेल कि रिकॉर्डिंग को बाधित अगर दवा विंदुक एक gigaohm सील की स्थापना के बाद स्थिति में ले जाया जाता है के आसपास के क्षेत्र में ऊतक के आंदोलन हो सकता है.
- आईआर वीडियो का उपयोग करना, ऊतक टुकड़ा के ऊपर की सतह पर दवा micropipette की स्थिति. दबाव एक इंजेक्शन और निगरानी) 1 इंजेक्शन से संबंधित मलबे के आंदोलन के लिए टिप के आसपास है, और किसी भी संकेत हैं कि टिप भरा हुआ या अवरुद्ध के लिए 2) micropipette टिप चलाएँ. यदि टिप अवरुद्ध / भरा हुआ है, pipett वापस लेनाई और यह एक नया एक के साथ बदलें.
- ऐसे टुकड़ा के ऊपर से दर्ज सेल तिरछे दृष्टिकोण है कि अंतिम स्थिति में, जब दवा से भरे विंदुक की टिप दर्ज की सेल और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की नोक (या थोड़ा नीचे) के रूप में एक ही फोकल हवाई जहाज़ में 1) , और) 2 दर्ज सेल से 10 से 40 मीटर है. अगर दवा से भरे विंदुक टिप दर्ज सेल से ऊपर है, दबाव इंजेक्शन से बल gigaohm सील को बाधित कर सकता है.
- जबकि वोल्टेज दबाना मोड या वर्तमान क्लैंप मोड में सेल धारण वांछित सेलुलर प्रतिक्रिया रिकार्ड. हम नियमित acetylcholine रिकॉर्ड और / या सेलुलर धाराओं निकोटीन हासिल है जबकि वोल्टेज क्लैंप मोड में न्यूरॉन्स पकड़े. हालांकि दबाव इंजेक्शन मैन्युअल रूप से चालू किया जा सकता है जब एक Picospritzer III का उपयोग कर अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए यह सलाह है कि एक डिजिटल टीटीएल नाड़ी के साथ अधिग्रहण प्रणाली (Axon Digidata 1440 और pClamp 10.3) का उपयोग करने के लिए दबाव इंजेक्शन ट्रिगर.
5. को नियंत्रित करनेएक Piezoelectric अनुवादक के साथ ड्रग भरे micropipette
- यदि संभव हो तो, एक एकल आयाम अनुवादक piezoelectric दवा से भरे विंदुक धारक माउंट (जैसे Piezojena PA-100 या Burleigh PZM-150) है कि एक एनालॉग वोल्टेज (फिर से, अधिग्रहण प्रणाली से इनपुट), जो तब को स्वीकार करने के लिए सक्षम है उच्च परिशुद्धता micromanipulator (Sutter सांसद 285) पर मुहिम शुरू की. एक piezoelectric अनुवादक उपयोगी है क्योंकि दवा से भरे विंदुक के आंदोलन में और / प्रवेश और निकास के समय की गति सहित टुकड़ा, के बाहर और अधिक आसानी से हो सकता है और नियंत्रित किया जा सकता है प्रयोग से प्रयोग करने के लिए reproduced. जब nAChRs अध्ययन, दवा से भरे विंदुक से निकोटीन रिसाव के desensitizing प्रभाव वे कभी भी हो जाना चाहिए, कम से कम कर रहे हैं, जब विंदुक एक piezoelectric अनुवादक के साथ ही सेल के पास दबाव इंजेक्शन के पल के लिए ले जाया गया.
- Piezoelectric वोल्टेज नियंत्रण एम्पलीफायर पर मैन्युअल रूप से नियंत्रित तनाव नापने का यंत्र का उपयोग करना, वोल्टेज डायलइसकी अधिकतम मूल्य.
- Micromanipulator स्थिति टुकड़ा जहां विंदुक दर्ज सेल पर अपनी सामग्री को बेदखल करना, और स्वयं piezoelectric वोल्टेज नियंत्रण एम्पलीफायर पर शून्य करने के लिए कम वोल्टेज विंदुक वापस लेना में दवा से भरे विंदुक का उपयोग करना.
- रिकॉर्डिंग अधिग्रहण प्रणाली से एक अनुरूप उत्पादन संकेत का उपयोग करना, टुकड़ा में मिसे 250 300 मिसे शुरू करने से पहले दबाव इंजेक्शन टीटीएल नाड़ी होता है की एक अवधि में दवा से भरे विंदुक चाल है. 250 मिसे के एक अवधि पर विंदुक वापस लेना, टीटीएल नाड़ी समाप्त होने के बाद 50 मिसे शुरू.
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Representative Results
हमारे प्रयोगों में, हम नियमित रूप से dopamine (डीए) उत्पादन वेंट्रल टेगमेंटल (VTA) क्षेत्र और सब्सटेंशिया निग्रा पार्स कॉम्पेक्टा (एसएनसी) के न्यूरॉन्स से रिकॉर्ड. , वोल्टेज दबाना मोड में acetylcholine या इन कोशिकाओं को निकोटीन के दबाव आवेदन आम तौर पर एक तेजी से, आवक कटियन वर्तमान कि मिसे 100-200 (चित्रा 1A-B) के भीतर शिखर तक पहुँच में परिणाम होगा. वर्तमान के क्षय के रूप में बड़े पैमाने पर कार्रवाई की साइट से दवा के प्रसार से निर्धारित होता है, और है कि टुकड़ा में एंजाइमों मौजूद एक निष्क्रिय फार्म में दवा metabolize. उदाहरण के लिए, ACH acetylcholinesterases है कि मस्तिष्क के क्षेत्रों कि डीए न्यूरॉन्स 5 में अमीर हैं में कोशिकाओं की सतह पर आने से तेजी से hydrolyzed है. पैदा वर्तमान (चित्रा 1 ए) की एक तेजी से क्षय में यह परिणाम है. इसके विपरीत, निकोटीन hydrolyzed और निकोटीन पैदा धाराओं के रूप में तेजी के रूप में (चित्रा 1B) धाराओं, जो यह दृढ़ता activ के लिए अनुमति देता है ACH-पैदा नहीं क्षय नहीं हैखाया और 6 nAChRs असंवेदनशील बनाना.
दबाव इंजेक्शन सिस्टम ऑपरेटर दबाव नाड़ी के समय भिन्न करने के लिए अनुमति देते हैं. यह सुविधा मस्तिष्क स्लाइसें के भीतर न्यूरॉन्स की सतह पर nAChRs का अध्ययन करने में उपयोगी है, क्योंकि यह अन्वेषक निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है कि क्या अधिकतम पैदा वर्तमान में दवा की एक नाड़ी के जवाब में हासिल किया गया है. उदाहरण के लिए, चित्रा 2 शो में दो निशान है कि दवा आवेदन के 250 मिसे ग्रे (ट्रेस) प्रकट नहीं हो सकता है या हो सकता है एक निश्चित अधिकतम पैदा वर्तमान, जबकि दवा आवेदन के हज़ार मिसे (काले ट्रेस) एक स्पष्ट वर्तमान अधिकतम प्लस कुछ स्थिर पैदावार राज्य विसुग्राहीकरण. जब एक सटीक वक्र एकाग्रता प्रतिक्रिया, या जब nAChR desensitization अध्ययन का निर्माण इस तरह के "पीक" धाराओं को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है.
उदर मध्यमस्तिष्क में महंगाई भत्ते न्यूरॉन्स अक्सर सहज कार्रवाई की क्षमता की आग जब तीव्र मस्तिष्क 7 स्लाइस, 8 के भीतर दर्ज. α6'S L9 चूहों, जो पूर्वnAChRs प्रेस है कि निकोटीन या 2 ACH, 9-11 के 10 100-गुना कम सांद्रता के लिए दृढ़ता से जवाब, निकोटीन इंजेक्शन के लिए जवाब में वृद्धि हुई हरकत का प्रदर्शन. व्यवहार के साथ neuronal गतिविधि (कार्रवाई संभावित फायरिंग) सहसंबंधी, यह α6 L9 डीए वर्तमान दबाना मोड में दर्ज न्यूरॉन्स के लिए निकोटीन लागू करने के लिए उपयोगी है. आमतौर पर, निकोटीन की स्थानीय आवेदन (1 सुक्ष्ममापी) α6 L9 डीए न्यूरॉन्स फायरिंग कि आधारभूत 30-40 2 सेकंड (3 चित्रा, ऊपरी पैनल) के भीतर वापस decays की एक तेजी से और क्षणिक त्वरण में परिणाम देगा. निकोटीन के लिए इस तरह की प्रतिक्रियाओं को आसानी से quantifiable उचित विश्लेषण सॉफ्टवेयर (; आणविक उपकरणों कॉर्प जैसे pClamp) (3 चित्रा, कम पैनल) के साथ हैं.
सुसंस्कृत ectopically व्यक्त nAChRs के साथ या कोशिकाओं Xenopus oocytes में प्रयोगों का लाभ है कि दवा सांद्रता की एक श्रृंखला प्रत्येक दर्ज 12 सेल करने के लिए लागू किया जा सकता है का आनंद लें. मेंमस्तिष्क स्लाइसें भीतर न्यूरॉन्स, आम तौर पर एक वक्र एकाग्रता प्रतिक्रिया संभव है, नहीं है और दवा की एक एकल एकाग्रता प्रतिक्रियाओं अक्सर 1 रिपोर्ट कर रहे हैं. हालांकि, इस पेपर में वर्णित के रूप में एक दवा से भरे विंदुक बार बार करने के लिए दवा के कई सांद्रता एक मस्तिष्क टुकड़ा 2, 8, 13, 14 के भीतर वही दर्ज सेल को लागू किया जा के लिए अनुमति देने के लिए बदला जा सकता है चित्रा 4 से एक प्रतिनिधि आंकड़ों से पता चलता है एकल दर्ज डीए न्यूरॉन कि ach की तीन सांद्रता के साथ प्रेरित किया गया था. अन्वेषक का अनुभव है, एक अत्यधिक स्थिर micromanipulator विंदुक दवा से भरे पकड़ के साथ संयुक्त, इस प्रकार के परीक्षण में सफलता के लिए अग्रणी महत्वपूर्ण कारक हैं. जब सफल, इस दृष्टिकोण देशी nAChRs के बारे में बहुमूल्य औषधीय जानकारी प्रदान करता है.
सेल प्रकार या एक विषम जनसंख्या के साथ मस्तिष्क के क्षेत्रों में मौजूद लोगों uncharacterized सहित मस्तिष्क स्लाइसें, में न्यूरॉन्स अक्सर विभिन्न बुनियादी तत्वों का उपयोग कर वर्गीकृत कर रहे हैंctrophysiological और / या morphological 15 उपाय. उदाहरण के लिए, मैं ज वर्तमान, आराम झिल्ली क्षमता, सहज फायरिंग दर, और सेल आकार की अभिव्यक्ति ठेठ डीए न्यूरॉन्स 2, 7, 8, 16, 17 विशेषताएँ इस्तेमाल के उपाय कर रहे हैं. हमारे विधि का उपयोग करना है, यह भी संभव है उनके स्थानीय लागू निकोटीन या ACH 18, 19 के जवाब के आधार पर न्यूरॉन्स विशेषताएँ. उदाहरण के लिए, बेहतर colliculus (SC) विभिन्न nAChRs के उन है कि α6 20 सब यूनिटों होते सहित अत्यंत उच्च अभिव्यक्ति के साथ एक विषम और अपेक्षाकृत uncharacterized मस्तिष्क क्षेत्र है. मस्तिष्क α6 L9 चूहों से स्लाइस में, हम कई SC न्यूरॉन्स और लागू (1 सुक्ष्ममापी) निकोटीन एक विंदुक निकोटीन भर के साथ दबाव इंजेक्शन का उपयोग कर से दर्ज की गई है. दो अलग प्रतिक्रिया मनाया निरोधात्मक postsynaptic धाराओं के प्रकार: 1) सक्रियण (iPSCs) (5 चित्रा, मैं प्रतिक्रियाओं लिखें), और) 2 बड़े कुछ inducti के साथ आवक कटियन धाराओं(EPSCs) उत्तेजक postsynaptic धाराओं के पर (5 चित्रा, प्रकार द्वितीय प्रतिक्रियाओं).
एक piezoelectric अनुवादक के उपयोग के लाभ यह है कि दवा से भरे विंदुक एक स्थिर स्थिति में आयोजित किया जा सकता है जब तक यह कम से कम 100 मीटर दर्ज की गई सेल से दूर तेजी से दबाव हटाने के लिए सेल के निकट ले जाया जाता है प्रदान करता है. यह उपयोगी है क्योंकि विंदुक आंदोलन स्वचालित किया जा सकता है और सेल से सेल को और दिन पर दिन के लिए संगत है. यह भी उपयोगी है जब निकोटीन की उच्च सांद्रता (जो nAChRs असंवेदनशील) दर्ज सेल करने के लिए लागू किया जाता है, के रूप में यह दवा से भरे विंदुक से निकोटीन रिसाव के प्रभाव को कम से कम यह कभी चाहिए होते हैं. NAChR धाराओं की स्थिरता का प्रदर्शन जब एक piezoelectric अनुवादक का उपयोग करने के लिए, हम VTA मस्तिष्क स्लाइसें में α6 L9 चूहों से महंगाई भत्ते न्यूरॉन्स से चित्रा 6 दर्ज की गई. N की सांद्रता के जवाब में एक ही α6 L9 VTA डीए न्यूरॉन में लगातार प्रतिक्रिया से पता चलता हैicotine कि दृढ़ता से अत्यंत अनुभुत α6 * nAChRs (1 सुक्ष्ममापी: 6A चित्रा, 10 सुक्ष्ममापी: चित्रा 6B) को सक्रिय. यदि लगातार दर्ज सेल पर रिसाव की अनुमति, निकोटीन की इन सांद्रता कोशिका की सतह पर nAChRs असंवेदनशील की उम्मीद किया जाएगा, और 2 प्रतिक्रिया तनु पहली प्रतिक्रिया के लिए रिश्तेदार होगा.
चित्रा 1 डीए न्यूरॉन्स में प्रतिनिधि nAChR प्रतिक्रियाओं. एक WT माउस मस्तिष्क टुकड़ा में एक दा न्यूरॉन वोल्टेज clamped, दबाव (250 मिसे) इंजेक्शन एक दूसरे भरे दवा विंदुक का उपयोग कर के माध्यम से ACH (100 सुक्ष्ममापी) के स्थानीय आवेदन के द्वारा पीछा किया था. स्केल बार: 100 देहात, 3 सेकंड बी. प्रयोग के रूप में वर्णित प्रदर्शन किया गया था, डीए न्यूरॉन के लिए लागू किया गया था कि निकोटीन (100 सुक्ष्ममापी) को छोड़कर. स्केल बार: देहात 60, 3 सेकंड.
चित्रा 2 अलग दवा आवेदन समय से शिखर धाराओं का समाधान. एक WT माउस मस्तिष्क टुकड़ा में एक दा न्यूरॉन वोल्टेज clamped, ACH (100 सुक्ष्ममापी) के स्थानीय आवेदन के द्वारा पीछा किया था. दो प्रतिक्रियाओं ही दर्ज सेल, जहां ACH विंदुक दवा से भरे 250 (ग्रे ट्रेस) मिसे या 1000 मिसे (काले ट्रेस) के लिए अलग हो गया था के लिए दिखाए जाते हैं. स्केल बार: 50 पीए.
चित्रा 3. कार्रवाई स्थानीय दवा आवेदन के बाद फायरिंग संभावित अध्ययन. एक α6 L9 माउस मस्तिष्क टुकड़ा में एक दा न्यूरॉन वर्तमान क्लैंप (मैं = 0) मोड, और सहज कार्रवाई की क्षमता मनाया में दर्ज की गई थी. निकोटीन (1 सुक्ष्ममापी) दबाव इंजेक्शन (250 मिसे) का उपयोग कर लागू किया गया था, और कार्रवाई की क्षमता में परिवर्तन दर और आराम झिल्ली क्षमता फायरिंग थेमनाया. PClamp सॉफ्टवेयर (दहलीज खोज) का उपयोग करना, तात्कालिक फायरिंग दर प्राप्त किया गया है और कम पैनल में दिखाया.
4 चित्रा ही दर्ज सेल एकाधिक दवा आवेदनों. एक α6 L9 माउस मस्तिष्क टुकड़ा में एक दा न्यूरॉन वोल्टेज क्लैंप मोड में दर्ज की गई थी. एक दवा से भरे विंदुक स्थानीय ACH (250 मिसे 1 सुक्ष्ममापी) को लागू करने के लिए उपयोग किया जाता था. जबकि सेल से रिकॉर्ड करने के लिए जारी है, दवा से भरे विंदुक टुकड़ा से वापस ले लिया गया था और एक और 3 ACH सुक्ष्ममापी साथ भरा विंदुक के साथ बदल दिया. 3 सुक्ष्ममापी ACH को एक प्रतिक्रिया दर्ज किया गया था और इस प्रक्रिया को फिर से 10 सुक्ष्ममापी ach के लिए दोहराया गया था. स्केल पट्टी: 100 देहात, सेकंड 1.5.
चित्रा 5 nAChR प्रतिक्रिया प्रकार से न्यूरॉन्स का वर्गीकरण.एक α6 L9 माउस मस्तिष्क टुकड़ा में बेहतर colliculus (SC) न्यूरॉन्स के एक समूह थे वोल्टेज clamped, निकोटीन की स्थानीय दबाव इंजेक्शन के माध्यम से आवेदन (1 सुक्ष्ममापी) द्वारा पीछा किया. मैं टाइप न्यूरॉन्स निकोटीन आवेदन के बाद iPSCs प्रदर्शन किया. प्रकार द्वितीय न्यूरॉन्स निकोटीन आवेदन के जवाब में बड़े आवक धाराओं और वृद्धि की EPSCs प्रदर्शन किया. स्केल बार: देहात 20, 3 सेकंड.
चित्रा 6 Piezoelectric अनुवादक स्थिरता प्रदान करता है और नशीली दवाओं के रिसाव से सुरक्षा. एक α6 L9 माउस से एक मस्तिष्क टुकड़ा में एक VTA डीए न्यूरॉन वोल्टेज क्लैंप मोड में 1 सुक्ष्ममापी निकोटीन की आवेदन के दौरान दर्ज की गई थी. विंदुक निकोटीन भरा दबाव इंजेक्शन से पहले अंतिम स्थिति में चतुराई किया गया था और एक piezoelectric अनुवादक का उपयोग इंजेक्शन के बाद मुकर गया. एक दूसरे प्रतिक्रिया फाई के बाद 2 मिनट पर दर्ज की गई थीrst को दिखाना है कि कोई nAChR desensitization हुआ था. स्केल बार: 100 देहात, 8 सेकंड बी. nAChR प्रतिक्रियाओं α6 L9 VTA डीए न्यूरॉन्स में एक के रूप में दर्ज किया गया है, लेकिन 10 सुक्ष्ममापी निकोटीन लागू किया गया था. स्केल बार: 100 देहात, 8 सेकंड.
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Discussion
मोटे तौर पर इस अखबार में प्रस्तुत पद्धति मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में ligand-gated आयन चैनल समारोह के अध्ययन के लिए उपयोगी है. हालांकि, वहाँ कारकों की एक संख्या है कि काफी प्रयोगात्मक परिणाम है कि इस पद्धति का उपयोग करने से डेटा की गुणवत्ता reproducibility प्रभावित करेगा. उदाहरण के लिए, पैदा धाराओं दवा से भरे विंदुक की टिप के व्यास के प्रति बहुत संवेदनशील हैं. छोटे सुझावों को बाहर खदेड़ना दवा समाधान, और कम प्रतिरोध के साथ बड़े सुझाव अधिक दर्ज की सेल और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के बीच gigaohm सील बाधित होने की संभावना हो जाएगा के साथ कठिनाई का कारण होगा. प्रस्तुत विधि के अन्य सीमा यह है कि दवाओं के लिए दर्ज की गई सेल के 10 मीटर के भीतर कोशिकाओं विंदुक दवा से भरे, जो उनकी गतिविधियों में वृद्धि और संभवतः दर्ज सेल को प्रभावित कर सकता है हो सकता है से अवगत कराया जा सकता है कि.
जब एक ही दवा विंदुक के साथ कई बार सेल दवा आवेदन, यह महत्वपूर्ण है कि विंदुक को लौट जाठीक प्रत्येक आवेदन के लिए टुकड़ा में एक ही स्थिति है. प्लेसमेंट में भी छोटे (जैसे 1-2 सुक्ष्ममापी) अगले करने के लिए एक प्रतिक्रिया से विचलन अक्सर मनाया चोटी प्रतिक्रिया में काफी मतभेद में परिणाम होगा. एक प्रोग्राम piezoelectric अनुवादक (जैसा ऊपर वर्णित) या रोबोट micromanipulator दवा विंदुक स्थिति के लिए लाभप्रद है. एक अन्य महत्वपूर्ण विचार टुकड़ा के भीतर दर्ज सेल की गहराई है. नशीली दवाओं के अक्सर एक सेल से दूर फैलाना टुकड़ा की सतह पर और अधिक तेजी से, जबकि दवा टुकड़ा के भीतर किया जा सकता है "फंस" जब एक सेल है कि गहरी टुकड़ा भीतर स्थित है पर निकली. यह अक्सर एक महत्वपूर्ण विचार है जब निकोटीन, जो आसानी से nAChRs desensitizes जब जोखिम बार 100-200 मिसे से रह रहे हैं आवेदन. इसी तरह, दबाव (साई) में है कि मादक पदार्थों से भरे विंदुक और समय की राशि है कि दबाव लागू होता है (2 चित्रा) में अलग हो जाता है nAChR वर्तमान दा की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैंटा. हम नियमित रूप से दबाव के 10-12 साई का उपयोग करते हैं, और हम पाते हैं कि 250 मिसे nAChR व्यापक रिसेप्टर desensitization के कारण के बिना शिखर धाराओं को हल करने के लिए पर्याप्त समय है.
विधि का वर्णन हम एक प्रमुख लाभ विनिमय दवा से भरे pipettes सुझाव है कि कई दवा सांद्रता न्यूरॉन ही लागू किया जा सकता करने की क्षमता है. महत्वपूर्ण विचार जब pipettes का आदान प्रदान कर रहे हैं 1) विंदुक टिप एक एकाग्रता से अगले करने के लिए स्थान, और विंदुक टिप व्यास में 2) परिवर्तनशीलता में परिवर्तन. पिपेट टिप स्थान आमतौर पर पर्याप्त रूप से एक उच्च संकल्प पास आईआर वीडियो कैमरा और एक सटीक micromanipulator के साथ नियंत्रित किया जा सकता है. विंदुक टिप व्यास में परिवर्तनशीलता जब भी संभव हो, और एक विंदुक खींचने कि सटीकता और स्थिरता के एक उच्च डिग्री के साथ micropipettes खींचती का उपयोग करके 'बहन pipettes "का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है.
कुल मिलाकर, पिपेट दवा से भरे इस पत्र में वर्णित विधि एक बहुत ही उपयोगी दृष्टिकोण है जब studyiएनजी देशी nAChRs तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में पाया न्यूरॉन्स में व्यक्त की है. निकोटीन निर्भरता और निकोटिनिक cholinergic जीव विज्ञान के तंत्रिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए उपयोगी होने के अलावा, इस विधि आसानी से अन्य ligand-gated आयन चैनल के लिए लागू है. 5-HT 3 रिसेप्टर्स, GABA एक रिसेप्टर्स, और ग्लाइसिन रिसेप्टर्स अन्य "CYS पाश" रिसेप्टर्स कि इन तकनीकों 21 का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है के कई हैं.
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Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) DA030396 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. Drenan प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए उपयोगी चर्चा और पांडुलिपि की आलोचना के लिए धन्यवाद. एम आई के लिए विशेष धन्यवाद तकनीकी सहायता और जोनाथन थॉमस टिंग के लिए वयस्क माउस मस्तिष्क स्लाइस के संबंध में सलाह के लिए किम भाग गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscience. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
