Summary
이 논문에서, 우리는 심하게 절연 뇌 조각의 뉴런에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 연구 할 수있는 유용한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 패치 클램프 기술을 사용하여 기록 뉴런에 약물의 로컬 응용 프로그램에 대한 약물 채워진 micropipette의 사용을 포함한다.
Abstract
담배 사용은 암, 심장 질환, 폐기종, 그리고 뇌졸중 등 수많은 건강 문제로 연결됩니다. 흡연에 중독 중추 신경계에 걸쳐 nicotinic 아세틸 콜린 수용체 (nAChRs)에 니코틴의 biophysical 및 셀룰러 행동에서 유래 유행 neuropsychiatric 장애입니다. 니코틴 중독과 관련된 뇌 영역에 존재하는 다양한 nAChR의 하위 유형을 이해하는 것은 중요한 우선 순위입니다.
이러한 전체 세포 패치 클램프 또는 두 전극 전압 클램프 녹음 등의 전기 생리학 기술을 채용 실험은 관심 nAChRs의 약리 특성에 유용합니다. 같은 포유류의 조직 배양 세포 또는 Xenopus laevis의 oocytes과 같은 세포 표현 nAChRs는 물리적으로 격리되어 있으며 따라서 쉽게 현대 약리학의 도구를 사용하여 공부하고 있습니다. 대상 수용체가 이미 알려진 특히 때 많은 진전은 이러한 기술을 사용하여 만들어졌습니다차 이소성 표현은 쉽게 달성했습니다. 심하게 실험실 쥐 쥐에서 채취 한 뇌 슬라이스 내의 뉴런에 : 종종, 그러나, 그것은 그들의 모국어 환경에서 nAChRs을 연구 할 필요가 있습니다. 예를 들어, 쥐 등 α4 L9'A 마우스 1 α6 L9 'S 마우스 2로 "지나치게"nAChR의 subunits을 표현, 특정 nAChR의 subunit 자신의 기능 표현을 바탕으로 뉴런의 모호 식별 할 수 있습니다. 뇌 조각의 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 녹음이 정기적으로 숙련 된 electrophysiologist에 의해 수행되어 있지만, 로컬 등 아세틸 콜린이나 뇌 슬라이스 내에 기록 된 셀 니코틴 같은 약물을 적용하는 도전입니다. superfusate에 약물의 희석은 (목욕 응용 프로그램) 빠르게 되돌릴 수 없습니다, 그리고 U-튜브 시스템은 쉽게 뇌 슬라이스와 함께 작동하도록 구성되지 않습니다.
이 논문에서, 우리는 빠르게 성인 m에 기록 된 뉴런에 nAChR - 활성화 약물을 적용하는 방법을 설명뇌 조각 ouse. 표준 전체 셀 녹음 조각의 뉴런로 만든되며, 이익의 약물로 가득 두 번째 micropipette는 기록 세포 근처의 위치로 maneuvered입니다. 약물 가득한 피펫에 가압 공기 또는 불활성 질소의 주입은 기록 세포에 피펫에서 배출되는 약물 솔루션의 작은 금액을 발생합니다. 이 방법을 사용 nAChR로 인한 전류는 밀리 초 정확도로 해결 될 수 있습니다. 약물 응용 프로그램 시간은 쉽게 변할 수 있으며, 약물이 가득한 피펫은 농도 - 반응 곡선은 단일 신경 세포를 만들 수 있도록 허용하는 새로운 피펫으로 후퇴하고 교체 할 수 있습니다. nAChR 신경 생물학의 맥락에서 설명했지만,이 기술은 뇌 조각의 뉴런의 리간드 - 개폐 이온 채널이나 수용체의 다양한 종류를 공부하는 데 유용해야합니다.
Protocol
1. 뇌 슬라이스 준비 및 전기 생리학을위한 솔루션의 준비
- 뇌 조각의 준비를위한 솔루션은 이전에 3, 4를 설명했다. 93 N-메틸 D-glucamine, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 : N-메틸 D-glucamine (NMDG) 기반 다음과 같은 구성의 절단 및 복구 솔루션을 (MM)를 준비 포도당, 5 그렇단 + 아스 코브 산, 2 티오 우레아, 3 그렇단 + pyruvate, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0.5 CaCl 2 • 2H 2 O. NMDG과 300-310 mOsm로 조절합니다. 10 N HCL을 7.3-7.4로 pH를 조정합니다.
- 각각의 2 M 주식 솔루션을 만들기 위해 Millipore 물에 MgSO 4 • 7H 2 O와 CaCl 2 • 2H 2 O를 해산.
- 나열된 순서에 다른 구성 요소를 무게 분해하는 교반하면서 Millipore 물 부분적으로 채워진 용적 플라스크에 추가 할 수 있습니다. 모든이 추가되면 작성Millipore 물 용적 플라스크입니다.
- pH를 측정하고 10 N HCL을 조정할 수 있습니다.
- osmolarity를 측정하고 필요한 경우 NMDG을 조정할 수 있습니다.
- 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 포도당, 5 그렇단 + 아스 코브 산, 2 티오 우레아, 3 그렇단 다음 구성의 인공 뇌척수 (aCSF)을 (MM)를 개최 HEPES 준비 + pyruvate, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. 자당과 300-310 mOsm로 조절합니다. 1 N HCL 또는 NaOH로 pH를 7.3-7.4로 조정합니다.
- 나열된 순서의 구성 요소를 무게 분해하는 교반하면서 Millipore 물 부분적으로 채워진 용적 플라스크에 추가 할 수 있습니다. 모든이 추가되면, Millipore 물과 용적 플라스크를 채 웁니다.
- pH를 측정하고 필요한 경우 NaOH 또는 HCL을 조정할 수 있습니다.
- osmolarity를 측정하고 자당 필요한 경우로 조정합니다.
- 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12.5 포도당, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O에 다음 구성의 표준 aCSF 녹음 솔루션을 (MM)를 준비 자당과 300-310 mOsm로 조절합니다. 1 N HCL 또는 NaOH로 pH를 7.3-7.4로 조정합니다.
2. 급성 뇌 슬라이스의 작성
- 이전에 3, 4에 설명 된대로 뇌 슬라이스 절단 및 복구가 이루어집니다. 버블이 결정 요리가 95 % 산소 / 5 % CO 2 가스 (carbogen), 얼음에 하나 접시, 33의 다른 ° C.와 복구 솔루션을 NMDG로 가득
- 버블 크리스탈 1 요리 상온에서 carbogen과 aCSF를 개최 HEPES로 가득.
- 오세영 + pentobarbital (200 밀리그램 / kg, IP)로 성인 마우스를 (2~12개월 세) 마취. 동물이 발가락 - 핀치에 대한 응답이 없을 때 절차를 진행합니다.
- 필요한 경우, 나중에 genotyp에 꼬리 조직 샘플을 잘라동물 들죠.
- 가슴에 고인을 열고, 마음을 노출하고, 내림차순 대동맥 클램프. 오른쪽 심방을 괴롭히다.
- Transcardially 0-4 ° C NMDG 복구 솔루션의 5-10 ML과 동물을 perfuse.
- 동물 목을 벨, 뇌를 제거하고 1 분에 대해 4 ° C NMDG 복구 솔루션에 배치합니다.
- 얼음 차가운 금속 플레이트에서 관심 영역을 포함하도록 원하는 방향 (등, 수평, parasagittal, 코로나)에 뇌를 잘라.
- 접사 진동 슬라이서의 건조 단계 표면에 superglue과 뇌 블록 (DSK-제로 1; Dosaka), 4 잠기 뇌 블록 carbogen과 ° C NMDG 복구 솔루션, 그리고 지속적으로 거품 솔루션입니다.
- 관심 뇌 영역의 조각을 잘라. 슬라이스 두께는 특정 관심의 뇌 영역, 동물 연령, 수행 할 실험에 따라, 200-400 μm이다.
- 즉시 절단 한 후에 품다 원하는 슬라이스는 33 carbogenated ° C NMDG 복구 soluti정확히 12 분에에 후 60 분의 초기 기간 동안 솔루션을 개최 carbogenated, 룸 온도 HEPES로 전송할 수 있습니다. 이 60 분의 부화 후, 슬라이스는 녹음에 사용할 수 있습니다. 조각들은이 녹음에 사용되는 때까지 하루 종일 솔루션을 가지고 HEPES에 보관됩니다.
3. 뇌 슬라이스의 뉴런에서 패치 클램프 녹음
- 프로그램 불타는 브라운 풀러 (셔터 P-97 또는 이에 상응하는 수직 풀러)와 표준 패치 micropipette를 당겨. 기가 - 옴의 인감 형성을위한 최적의 아르 피펫은 일반적으로 MΩ 4-6의 저항이
- 수직 현미경 (니콘 FN-1)의 무대에, 녹음 챔버 (워너 인스트루먼트 RC-27L)에 한 조각을 전송합니다. 지속적인 superfuse (1.5-2.0 ML / 분) 32시 가열, 유지 carbogenated, 표준 기록 aCSF와 슬라이스 ° C. 또는 조각은 실온에서 유지 될 수 있습니다.
- 사용 관심 뇌 영역을 찾아 센터10X 공기 목적 (니콘 계획 형석 10X, NA 0.3, WD : 16mm).
- 40X에 가까운 적외선 (IR) 물 침적 목표 (; 0.80, WD : NA 니콘 APO 40XW 3.5 mm)을 사용하여 개별 뉴런 시각화 적외선 근처의 IR-차동 간섭 대비 (DIC) 광학 및 고속 연결이 커플 링 장치를 충전 (CCD) 비디오 카메라 (하마 마츠 C-7500). IR-DIC 관찰에서 건강한 뉴런은 부드럽고 밝은 회색 플라즈마 멤브레인을 나타냅니다.
- 적절한 세포 녹음 솔루션 micropipette를 입력합니다. 135 칼륨 글루 콘산, 5 EGTA, 0.5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 MG-ATP, 그리고 0.1 GTP (산도가 트리스베이스, osmolarity를 7.25로 조정 : 대부분의 응용 프로그램의 경우, 우리는 다음과 같은 솔루션을 (MM)를 사용하여 290 자당과 mOsm)로 조정. 시각화 뉴런에서 전체 셀 녹음을 설정합니다.
4. 슬라이스의 뉴런에 대한 약물의 로컬 응용 프로그램
- 위에서 설명한대로 표준 패치 클램프 micropipette를 당겨. 사용여러 약물 솔루션은 동일한 휴대폰으로 사용할 수있는 경우 유리의 조각에서 두 개의 동일한 "자매"팁을 생산하는 셔터 P-97와 같은 피펫을 끌어 당기는이 바람직하다. 그들이 위에 설명 된 세포 솔루션으로 가득 된 경우 MΩ ~ 5의 저항이 것 팁 크기는 최적입니다.
- carbogenated, 표준 기록 aCSF에 희석 약물의 솔루션 백업은 micropipette. 아래 팁을 가리킨 솔루션의 항목에 갇혀있는 공기 방울을 제거 할 수있는 약물이 가득한 micropipette을 버려야지.
- 이러한 Picospritzer III (일반 밸브 (주))와 같은 적절한 압력 분출 시스템에 튜브로 연결 피펫 홀더에있는 약물이 가득한 micropipette를 탑재합니다. manipulators 일반적으로 (예를 들어, 셔터 MP-285) 패치 클램프 녹음에 사용되는 피펫 홀더는 동일한 해상도로 micromanipulator에 장착해야합니다. 또한, 머니퓰레이터는로와 슬라이스의에서 대각선 움직임을 허용해야합니다. 사람ually 유체의 열 뒤에 적절한 압력을 구축하기 위해 micropipette에 압력을 3-4 회를 꺼냅니다.
- IR-DIC 광학 아래의 팁을 시각화하는 동안 micromanipulator 컨트롤 사용하여 슬라이스에 약물 피펫을 낮 춥니 다. 이상적으로, 하나는 시각적으로 확인하고 센터 이전에 슬라이스에 기록 micropipette을 낮추는에 셀 근처의 약물 피펫의 위치 다음에서 기록 할 수있는 뉴런을해야합니다. 약물 피펫을 위치하면 약물 피펫은 gigaohm 인감을 맺은 후 위치로 이동하는 경우 녹화를 중단 할 수있는 기록 세포의 주변에 조직의 움직임을 일으킬 수 있습니다.
- IR 비디오 사용하여 조직 슬라이스의 상단 표면에 약물 micropipette를 배치. 한 압력 방출 및 모니터 1) 분사에 관한 파편의 움직임에 대한 팁 주변 및 팁이 막혔거나 차단되어있는 표지판 2) micropipette 팁을 실행합니다. 끝이 차단 / 막힌 경우, pipett를 철회전자하고 새로운 하나를 교체하십시오.
- 이러한 슬라이스의 상단에서 대각선 녹화 셀을 접근 그 마지막 위치에, 약물 가득한 피펫의 끝은 기록 된 셀 기록 전극의 끝과 같은 초점 평면 (또는 약간 아래)에 1) 인 경우 , 그리고 2) 기록 세포 10-40 μm. 약물 가득한 피펫 팁이 기록 된 셀 위에있는 경우, 압력 방출의 힘은 gigaohm 인감을 방해 수 있습니다.
- 전압 클램프 모드 또는 현재 클램프 모드에서 셀을 누른 상태에서 원하는 세포 반응을 기록합니다. 우리는 정기적으로 아세틸 콜린을 기록 및 / 또는 전압 클램프 모드에서 뉴런을 누른 상태에서 세포의 전류를 니코틴 -이 elicited. Picospritzer III를 사용할 때 압력 분사를 수동으로 트리거 될 수 있지만, 더 많은 재현 결과는 디지털 TTL 펄스를 수집 시스템 (축삭 Digidata 1440 및 pClamp 10.3)를 사용하여 압력 분사를 실행하는 것이 좋습니다.
5. 제어압전 번역기로 마약이 가득한 Micropipette
- 가능하면 단일 차원 압전 변환기에 약물이 가득한 피펫 홀더를 마운트 (예 : Piezojena PA-100 Burleigh PZM-150)가있는 아날로그 전압 입력 (다시 수집 시스템에서)을 허용 할 수 있습니다 고정밀 micromanipulator (셔터 MP-285)에 장착. 약물 가득한 피펫의 움직임에와 입국 / 출구의 타이밍과 속도를 포함하여 슬라이스, 부족이 더 쉽게 통제 및 실험에서 실험 재현 할 수 있기 때문 압전 번역 유용합니다. 피펫 만 압력 방출의 순간을 위해 압전 번역으로 셀 근처에 이동 될 때 nAChRs을 공부하면 약물이 가득한 피펫에서 니코틴 누설의 desensitizing 효과, 그들은 지금까지 발생한다 최소화하고 있습니다.
- 압전 전압 제어 증폭기에 수동으로 제어 포텐를 사용하여 전압을 다이얼의 최대 값.
- micromanipulator, 위치에게 피펫가 기록 된 셀에 내용을 추출하고, 수동으로 압전 전압 제어 증폭기에 0으로 전압을 줄여 피펫를 철회 할 슬라이스의 약물이 가득한 피펫을 사용합니다.
- 기록 수집 시스템에서 아날로그 출력 신호를 사용하여, 250의 압력 분출 TTL 펄스가 발생하기 전에 밀리 초 300 밀리 초를 시작 기간 동안 슬라이스로 약물이 가득한 피펫 이동합니다. TTL 펄스가 끝난 후에 50 밀리 초를 시작, 250 밀리 초 기간 동안 피펫을 철회.
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Representative Results
우리의 실험에서, 우리는 정기적으로 도파민 (DA) 생산 복부 tegmental 지역 (VTA)와 substantia nigra 갈 거예요 compacta (SNc)의 뉴런을에서 기록합니다. 전압 클램프 모드에서 아세틸 콜린하거나 세포에 니코틴의 압력 응용 프로그램은 일반적으로 100-200 밀리 초 (그림 1A-B)에서 정상에 도달 빠른, 안쪽 양이온 현재이 높아집니다. 현재의 부패는 크게 작업의 사이트에서 약물의 확산에 의해 결정됩니다, 그리고 슬라이스의 효소가 존재 여부를 비활성 형태로 약물을 흡수 할 수 있습니다. 예를 들어, 이크 DA 뉴런 5 풍부 뇌의 영역에서 세포의 표면에있는 acetylcholinesterases에 의해 빠르게 분해됩니다. evoked 현재 (그림 1A)의 급속한 붕괴에이 결과를 표시합니다. 반면, 니코틴 분해하고 니코틴-evoked 전류로 빠르게이 강하게 activ 할 수 전류 (그림 1B)를 ACH-evoked로 가옥하지 않습니다먹고 nAChRs 6 감도를 줄이다.
압력 분사 시스템은 운영자가 압력 펄스의 시간을 변경할 수 있습니다. 그 탐정은 최대 evoked 전류가 약의 펄스에 대한 응답으로 달성되었는지 확인할 수 있기 때문에이 기능은, 뇌 슬라이스 내에서 뉴런의 표면에 nAChRs을 공부에 유용합니다. 예를 들어, 약물 응용 프로그램을 250 밀리 초 (회색 추적)이 공개하지 않을 수도 있습니다 또는있는 그림 2 쇼의 두 흔적 최종 최대 - evoked 약물 응용 프로그램의 1,000 밀리 초 (검은 색 추적)이 현재 명확한 최대 소수 꾸준한를 얻을 반면, 현재 - 국가 desensitization. 정확한 농도 - 반응 곡선, 또는 nAChR의 desensitization을 공부를 구성했을 때 '최고'전류를 해결하는 것은 매우 중요합니다.
급성 뇌 슬라이스 7, 8에서 기록 할 때 복부 midbrain에서 DA의 뉴런은 종종 자발적인 행동 잠재력을 발사. α6 L9 'S 마우스,하는 예니코틴 또는 ACH 2, 9-11 10 ~ 100 배 낮은 농도에 강력하게 대응 nAChRs을 눌러 니코틴 주사에 대한 응답으로 증가 운동을 나타냅니다. 동작과 neuronal 활동 (작업 잠재적 시행을) 상관 관계 위해서는 전류 클램프 모드에서 기록 α6 L9 'S DA의 뉴런에 니코틴을 적용 할 때 유용합니다. 일반적으로, α6 L9 'S DA의 뉴런에 니코틴의 로컬 응용 프로그램 (1 μM)은 30-40 초 2 (그림 3, 상단 패널) 내에서 기준으로 썩어 없어지고 그 발사의 신속하고 과도 가속 될 것이다. 니코틴에 대한 이러한 반응은 적절한 분석 소프트웨어 (; 분자 장치 주식회사 예 pClamp)와 (그림 3, 낮은 패널) 쉽게 수량화 있습니다.
ectopically 표현 nAChRs과 교양 셀 또는 Xenopus의 oocytes에서 실험 약물 농도 일련의 각 기록 셀 12에 적용 할 수있는 장점을 즐길 수 있습니다. 에뇌 조각 내 뉴런은 일반적으로 농도 - 반응 곡선은 불가능하며, 약물의 단일 농도에 대한 답변은 종종 1보고됩니다. 그러나,이 논문에서 설명 된대로 약물이 가득한 피펫은 반복적으로 뇌 슬라이스 2, 8, 13, 14에서 같은 기록 세포에 적용 할 수있는 약물의 여러 농도 수 있도록 변경 될 수 있습니다. 그림 4에서 대표 데이터를 보여줍니다 ACH 세 농도로 자극 된 하나의 기록 DA의 뉴런. 약물 가득한 피펫을 들고 매우 안정적인 micromanipulator와 함께 수사관의 경험은, 이런 유형의 실험에서 성공에 이르는 중요한 요소입니다. 하면 성공,이 접근 방식은 네이티브 nAChRs에 대한 중요한 약리 정보를 제공합니다.
uncharacterized 셀 유형 또는 이기종 인구 뇌 영역에서 그 존재를 포함한 뇌 슬라이스,의 뉴런은 종종 다양한 기본 엘레을 사용하여 분류ctrophysiological 및 / 또는 형태학의 조치 15. 예를 들어, H 전류, 휴식 막 잠재력, 자연 연소 속도 및 셀 크기의 표현은 DA 뉴런 2, 7, 8, 16, 17 특징하는 데 사용 일반적인 조치입니다. 우리의 방법 사용하면, 로컬 - 적용 니코틴 또는 ACH 18, 19에 대한 그들의 반응에 따라 뉴런을 특징하는 것도 가능합니다. 예를 들어, 우수한 colliculus (SC)는 α6 subunits (20)이 포함 된 등 다양한 nAChRs의 매우 높은 표현과 이기종 상대적으로 uncharacterized 뇌 영역입니다. α6 L9 'S 마우스의 뇌 조각에서 우리는 몇 가지 SC의 뉴런과 니코틴이 가득한 피펫으로 압력 분사를 사용하여 적용 니코틴 (1 μM)에서 기록. 두 개의 응답 유형을 관찰했다 : 1) 억제 postsynaptic 전류의 활성화 (IPSCs) (그림 5, 나는 응답을 입력), 일부 inducti 2) 대형 안쪽으로 양이온 전류흥분성의 postsynaptic 전류에 (EPSCs) (그림 5, 타입 II 응답).
압전 변환기의 사용은이 빠르게 압력 분사에 대한 셀에 인접 이동 될 때까지 약물이 가득한 피펫가 최소 100 μm 떨어진 기록 휴대폰에서 고정 위치에 개최 될 수있는 장점을 제공합니다. 이 피펫 운동을 자동화 할 수 있기 때문에 유용합니다, 세포에서 세포와 하루에 하루에 일치합니다. 그 어느 발생해야 그 약물이 가득한 피펫에서 니코틴 누설의 영향을 최소화로 그것은 니코틴의 농도는 (nAChRs을 감도를 줄이다)를 기록 셀에 적용되는 경우에도 유용합니다. 압전 변환기를 사용하는 경우 nAChR 전류의 일관성을 보여줍니다하기 위해, 우리는 α6 L9 'S 마우스의 뇌 조각의 VTA DA의 뉴런에서 기록했다. 그림 6은 동일한 α6 L9 'S VTA DA 뉴런에 연속 반응을 보여줍니다 N의 농도에 대응강력 지나치게 α6 * nAChRs을 (:; : 그림 6B 10 μM 그림 6A 1 μM)을 활성화 icotine. 지속적으로 기록 된 셀에 누출 할 수있는 경우 니코틴의 이러한 농도는 세포 표면에 nAChRs을 감도를 줄이다 할 것으로 예상됩니다, 두 번째 응답은 첫 번째 응답에 감쇠 상대가 될 것입니다.
그림 1. DA의 뉴런의 대표 nAChR 응답.. WT 마우스 뇌 슬라이스의 DA 뉴런은 전압이 두 번째 약물이 가득한 피펫을 사용하여 압력 분사 (250 밀리 초)를 통해 ACH (100 μM)의 로컬 응용 프로그램에 의해 다음, 고정했습니다. 규모 바 : 100 PA, 3 초 B.. 에 설명 된대로 실험은 DA 뉴런에 적용이 니코틴 (100 μM)를 제외하고, 수행되었다. 스케일 바 : 60 PA, 3 초.
그림 2. 다양한 약물 응용 프로그램 시간에서 피크 전류를 해결. WT 마우스 뇌 슬라이스의 DA 뉴런은 전압이 ACH (100 μM)의 로컬 응용 프로그램에 의해 다음, 고정했습니다. 두 답변은 ACH이 250 밀리 초 (회색 추적) 또는 1000 밀리 초 (검은 색 추적)에 대한 약물이 가득한 피펫에서 배출 된 같은 기록 세포에 대한 표시됩니다. 규모 바 : 50 PA.
그림 3은. 지역 마약 응용 프로그램에 따라 발사 작업 잠재력을 준비중이다. α6 L9의 마우스 뇌 슬라이스의 DA 뉴런은 현재 클램프 (I = 0) 모드, 자발적인 행동 잠재력 관찰되었다에 기록되었다. 니코틴 (1 μM)는 압력 분사 (250 밀리 초)을 사용하여 적용하고, 속도와 휴식 막 잠재력을 해고 조치 잠재력의 변화였다되었습니다관찰. pClamp 소프트웨어 (임계 값 검색)를 사용하여 순간적인 발사 속도가 파생되었으며 하단 패널에 표시됩니다.
4 그림. 같은 기록 세포에 다수의 마약 응용 프로그램을. α6 L9의 마우스 뇌 슬라이스의 DA 신경 세포는 전압 클램프 모드에서 기록되었다. 약물 가득한 피펫가 로컬 ACH를 (; 250 밀리 초 1 μM)를 적용하는 데 사용되었다. 셀에서 기록을 계속하지만, 약물 가득한 피펫은 슬라이스에서 인출, 3 μM ACH가 담긴 피펫으로 바뀌 었습니다. 3 μM ACH에 대한 응답이 기록되었고,이 과정은 10 μM ACH에 다시 반복되었다. 스케일 바 : 100 PA, 1.5 초.
그림 5. nAChR 응답 유형의 뉴런의 분류.α6 L9의 마우스 뇌 조각의 우수한 colliculus (SC) 뉴런의 그룹은 전압이 압력 분사를 통해 니코틴의 로컬 응용 프로그램 (1 μM)에 의해 다음, 고정했다. 입력 I 뉴런은 니코틴 응용 프로그램에 따라 증가 IPSCs을 전시. 유형 II의 뉴런은 니코틴 응용 프로그램에 대한 응답으로 큰 내향 전류와 증가 EPSCs을 전시. 스케일 바 : 20 PA, 3 초.
그림 6. 압전 변환기는 일관성을 제공하며, 약물 유출에서 보호합니다.. α6 L9의 마우스에서 뇌 슬라이스의 VTA DA 뉴런은 1 μM의 니코틴 응용 프로그램을하는 동안 전압 클램프 모드로 기록되었다. 니코틴이 가득한 피펫은 압력 방출하기 전에 최종 위치로 maneuvered과 압전 번역을 사용하여 분사 후 후퇴했다. 두 번째 응답 Fi 접속 설비를 후 2 분 기록 된더 nAChR의 desensitization가 발생하지했다고 설명하는 첫. 스케일 바 : 100 PA, 8 초 B.. α6 L9 'S VTA DA의 뉴런의 nAChR 응답은에서로 기록되었지만, 10 μM의 니코틴이 적용되었습니다. 스케일 바 : 100 PA, 8 초.
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Discussion
본 논문에서 제시하는 방법은 뇌 슬라이스 준비에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 공부 폭넓게 유용합니다. 그러나, 상당히 실험 데이터이 방법을 활용에서 그 결과의 품질과 재현성에 영향을 미칩니다 요인이 있습니다. 예를 들어, evoked 전류는 약물이 가득한 피펫의 팁의 직경에 매우 민감합니다. 작은 팁 약물 솔루션, 낮은 저항을 제공하는 대형 팁이 기록 된 셀 기록 전극 사이의 gigaohm 인감를 중단 될 가능성이 높아집니다 꺼내기에 어려움을 초래하게됩니다. 제시된 방법의 또 다른 한계는 그 기록 세포의 10 μm 내에서 세포의 활동을 증가시킬 수 잠재적으로 기록 된 세포에 영향을 미칠 수있는 약물이 가득한 피펫에서 약물에 노출 될 수 있습니다.
같은 약물 피펫있는 셀을 여러 번에 약물을 적용하면 피펫을에게 반환하는 것이 중요합니다각 응용 프로그램에 대한 슬라이스에 정확히 같은 위치. 다음 한 응답 배치에도 작은 편차 (예 : 1-2 μm) 종종 관찰 피크 응답에 상당한 차이가 발생합니다. 프로그램 압전 변환기 (위에서 설명) 또는 로봇 micromanipulator은 약물 피펫을 위치시키기위한 바람직하다. 또 다른 주요 고려 사항은 슬라이스 내의 기록 세포의 깊이입니다. 약물은 종종 더 빠르게 슬라이스의 표면에 세포에서 떨어져 확산되며, 슬라이스 내에 깊이 자리 잡고있는 셀에 추출 할 때 약물이 슬라이스에서 "덫"할 수 있습니다 반면. 노출 시간이 100-200 밀리 초 이상 때 쉽게 nAChRs을 desensitizes 니코틴을 적용 할 때 종종 중요한 고려 사항입니다. 마찬가지로, 약물 가득한 피펫와 압력이 적용되는 시간의 양 (그림 2)에 배출 압력 (PSI)을 nAChR 현재 다 해석에 중요한 고려 사항타. 우리는 정기적으로 압력을 10-12 PSI를 사용하고 250 밀리 초는 다양한 수용체 desensitization가 발생하지 않고 nAChR 피크 전류를 해결하기에 충분한 시간이다 것을 발견했습니다.
우리가 설명하는 방법의 주요 이점은 여러 약물 농도가 같은 신경 세포에 적용 할 수 있도록 교류 약물이 가득한 피펫 팁의 능력입니다. 주요 고려 사항은 교환 피펫)는 피펫 팁 직경 피펫 팁 다음 한 농도의 위치, 2) 다양성의 변화 1아르 때. 피펫 팁의 위치는 일반적으로 충분히 높은 해상도에 가까운 IR 비디오 카메라와 정확한 micromanipulator를 제어 할 수 있습니다. 피펫 팁의 직경 변화가 가능한, 그리고 정확성과 일관성의 높은 학위 micropipettes를 가져옵니다 피펫을 끌어 당기는를 사용하여 "자매 피펫"를 사용하여 제어 할 수 있습니다.
전반적으로,이 문서에 설명 된 약물이 가득한 피펫 방법은 매우 유용한 접근 할 때 studyiNG 기본 nAChRs는 급성 뇌 조각에있는 뉴런으로 표현. 니코틴 의존도와 nicotinic cholinergic 생물학의 신경 생물학을 공부하는 데 유용 할뿐 아니라,이 방법은 다른 리간드 - 개폐 이온 채널에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 5 HT 3 수용체, GABA 수용체와 글리신 수용체는이 기술에게 21을 사용하여 공부 할 수있는 다른 "cys 루프"수용체의 여러입니다.
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Acknowledgments
이 작품은 건강의 국립 연구소 (NIH) 보조금 DA030396에 의해 지원되었다. 도움이 토론과 원고의 비판에 대한 Drenan 연구실의 구성원에게 감사드립니다. 미의 특별 감사는 성인 마우스 뇌 조각에 대한 조언에 대한 기술 지원 및 조나단 토마스 팅에 대한 김 버렸네.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
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