Summary
En este artículo, se describe un método útil para estudiar ligandos función del canal iónico en las neuronas de rodajas de cerebro agudamente aisladas. Este método implica el uso de una micropipeta de relleno de fármaco para aplicación local de medicamentos a las neuronas registradas utilizando técnicas estándar de patch clamp.
Abstract
El consumo de tabaco provoca numerosos problemas de salud, incluyendo cáncer, enfermedades del corazón, enfisema y derrame cerebral. La adicción a fumar cigarrillos es un trastorno neuropsiquiátrico frecuente que se deriva de las acciones biofísicos y celulares de la nicotina sobre los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) en todo el sistema nervioso central. La comprensión de los diversos subtipos de nAChR que existen en las áreas cerebrales relacionadas con la adicción a la nicotina es una de las principales prioridades.
Los experimentos que emplean técnicas tales como electrofisiología de pinzamiento zonal de célula completa o de dos electrodos grabaciones de tensión de la abrazadera son útiles para la caracterización farmacológica de nAChR de interés. NAChRs expresan las células, tales como células de cultivo de tejidos de mamífero u oocitos de Xenopus laevis, están físicamente aisladas y por lo tanto fácil de estudiar usando las herramientas de la farmacología moderna. Mucho se ha hecho uso de estas técnicas, en particular cuando el receptor diana ya se conocía unnd expresión ectópica se logró fácilmente. A menudo, sin embargo, es necesario estudiar nAChRs en su ambiente nativo: en neuronas dentro de las secciones de cerebro agudamente recogidas de ratones o ratas de laboratorio. Por ejemplo, ratones que expresan "hipersensibles" subunidades de nAChR tales como ratones α4 L9'A 1 y ratones α6 L9 2, permiten la identificación inequívoca de las neuronas en base a su expresión funcional de una subunidad de nAChR específico. Aunque conjunto de células grabaciones patch clamp de neuronas en rodajas de cerebro se realiza rutinariamente por el electrofisiólogo experto, es difícil de aplicar localmente fármacos tales como la acetilcolina o la nicotina a la célula grabada dentro de un corte de cerebro. La dilución de la droga en el superfusato (baño de aplicación) no es rápidamente reversible, y tubo en U sistemas no se adaptan fácilmente para trabajar con secciones de cerebro.
En este trabajo se describe un método para la rápida aplicación de activación de nAChR medicamentos a las neuronas registradas en adultos mOuse rodajas de cerebro. Estándar conjunto de células grabaciones están hechos de neuronas en rodajas, y una micropipeta segunda llena de un fármaco de interés es maniobrado en posición cerca de la célula registrada. Una inyección de aire a presión o nitrógeno inerte en la pipeta relleno de fármaco provoca una pequeña cantidad de solución de fármaco para ser expulsado de la pipeta sobre la celda de grabado. Usando este método, nAChR mediada por las corrientes son capaces de resolver con precisión de milisegundos. Tiempos de solicitud de medicamentos puede variarse fácilmente, y la pipeta de relleno de fármaco puede ser retraído y se reemplaza con una nueva pipeta, permitiendo curvas concentración-respuesta a crear para una sola neurona. Aunque se ha descrito en el contexto de nAChR neurobiología, esta técnica debe ser útil para el estudio de muchos tipos de canales iónicos activados por ligando o los receptores en las neuronas de rodajas de cerebro.
Protocol
1. Preparación de las soluciones para la preparación de cortes de cerebro y electrofisiología
- Soluciones para la preparación de secciones de cerebro se han descrito anteriormente 3, 4. Preparar N-metil-D-glucamina (NMDG)-basado de corte y solución de recuperación de la siguiente composición (en mM): 93 N-metil-D-glucamina, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glucosa, 5 ascorbato de Na +, 2 tiourea, 3 Na + piruvato, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuste a 300-310 mOsm con NMDG. Ajustar el pH a 7.3-7.4 con 10 N HCl.
- Disolver MgSO 4 • 7H 2 O y CaCl 2 • 2H 2 O en agua Millipore para hacer 2 M soluciones madre de cada uno.
- Pesar otros componentes en el orden indicado y añade a un matraz volumétrico de llenado parcialmente con agua Millipore mientras se agita para disolver. Una vez que todo se añade, llenarmatraz aforado con agua Millipore.
- Medir el pH y ajustar con 10 N HCl.
- Medir la osmolaridad y ajustar con NMDG si es necesario.
- Preparar HEPES holding líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) de la siguiente composición (en mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glucosa, 5 ascorbato Na +, 2 tiourea, 3 Na piruvato +, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuste a 300-310 mOsm con sacarosa. Ajustar el pH a 7.3-7.4 con 1 N HCl o NaOH.
- Pesar los componentes en el orden indicado y añade a un matraz volumétrico de llenado parcialmente con agua Millipore mientras se agita para disolver. Una vez que todo se añade, llenar matraz aforado con agua Millipore.
- Medir el pH y ajustar con NaOH o HCl si es necesario.
- Medir la osmolaridad y ajustar con sacarosa, si es necesario.
- Preparar solución estándar de grabación LCRa de la siguiente composición (en mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12,5 glucosa, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuste a 300-310 mOsm con sacarosa. Ajustar el pH a 7.3-7.4 con 1 N HCl o NaOH.
2. Preparación de las rebanadas cerebral agudo
- Corte de cortes de cerebro y recuperación se realizan como se ha descrito anteriormente 3, 4. Burbuja de dos platos de cristal lleno de NMDG solución de recuperación con 95% de oxígeno / 5% de gas CO 2 (carbógeno), un plato sobre el hielo, y la otra a 33 º C.
- Burbuja de un plato de cristal lleno con HEPES que sostienen LCRa con carbógeno a temperatura ambiente.
- Se anestesia el ratón adulto (de 2 a 12 meses) con Na + pentobarbital (200 mg / kg, ip). Continúe con el procedimiento cuando el animal no responde a un dedo del pie-pinch.
- Si es necesario, corte una muestra de tejido de la cola para su posterior genotypING del animal.
- Abrir la cavidad torácica, exponer el corazón, y la abrazadera de la aorta descendente. Lacerar la aurícula derecha.
- Transcardially perfundir los animales con 5-10 ml de 0-4 ° C NMDG solución de recuperación.
- Decapitar a los animales, retire el cerebro y lo coloca en 4 ° C NMDG solución de recuperación de 1 min.
- En una placa metálica enfriada con hielo, recorte el cerebro en la orientación deseada (coronal, parasagital, horizontal, etc) para incluir el área de interés.
- Coloque el bloque de cerebro con pegamento a la superficie etapa seca de una máquina de cortar vibrante (DSK-Zero 1; Dosaka), sumergir el bloque cerebro en 4 ° C NMDG solución de recuperación y continuamente burbujas de la solución con carbógeno.
- Cortar las rebanadas de la zona del cerebro de interés. Espesor de la rebanada es de 200-400 micras, dependiendo del área del cerebro específica de interés, la edad del animal, y experimento a realizar.
- Inmediatamente después del corte, incube las rebanadas deseadas en carbogenated, 33 ° C NMDG de recuperación solutidurante exactamente 12 minutos, luego se transfieren a HEPES carbogenated, sala de temperatura de mantenimiento solución por un período inicial de 60 min. Después de esta incubación de 60 min, las rodajas se puede utilizar para la grabación. Las láminas se mantuvieron en solución de HEPES que sostienen todo el día hasta que se utilizan para la grabación.
3. Patch Clamp grabación de neuronas en rodajas de cerebro
- Tire una micropipeta estándar con un parche programable Flaming-Brown extractor (Sutter P-97 o extractor verticales equivalente). Pipetas que son óptimas para la formación de sello giga-ohmios típicamente tienen una resistencia de 4-6 mW
- Transferir una rebanada a la cámara de grabación (RC-27L; Instrumentos Warner) en la etapa de un microscopio vertical (Nikon FN-1). Continuamente superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) en el sector con carbogenated, grabación estándar LCRa calentado y mantenido a 32 ° C. Alternativamente, las rebanadas se puede mantener a temperatura ambiente.
- Y centre el área cerebral de interés utilizandouno de los objetivos del aire 10 veces (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm).
- Visualizar las neuronas individuales utilizando un 40X en el infrarrojo cercano (IR) objetivo de inmersión en agua (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) conectado a contraste de interferencia IR-diferencial (DIC) óptica y una velocidad alta de infrarrojo cercano dispositivo acoplado cargado (CCD) video cámara (Hamamatsu C-7500). Bajo IR-DIC observación, las neuronas sanas presentan una superficie lisa, de color gris claro membrana plasmática.
- Llenar una micropipeta con una solución de registro intracelular adecuado. Para la mayoría de aplicaciones, se utiliza la siguiente solución (en mM): 135 gluconato de potasio, 5 EGTA, 0,5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP y 0,1 (pH se ajustó a 7,25 con Tris base, osmolaridad ajustado a 290 mOsm con sacarosa). Establecer una grabación de célula entera de una neurona visualizado.
4. La aplicación local de medicamentos a las neuronas en rodajas
- Tire una micropipeta de patch clamp estándar como se describe anteriormente. Usoun extractor de pipeta como una Sutter P-97 que produce dos hermanas "idénticas" consejos de la misma pieza de vidrio es ventajoso cuando las soluciones de fármacos múltiples se van a utilizar en la misma célula. Tamaños de la punta que tienen una resistencia de ~ 5 mW si se llenaron con la solución intracelular se ha descrito anteriormente es la óptima.
- Relleno de la micropipeta con una solución de fármaco se diluyó en aCSF carbogenated, grabación estándar. Dirija la punta hacia abajo, y la película de la micropipeta relleno de fármaco para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la columna de solución.
- Montar la micropipeta relleno de fármaco en un soporte de pipetas conectado con un tubo a un sistema de presión de expulsión adecuado, tal como un Picospritzer III (General Valve Co.). El titular de la pipeta debe ser montado en un micromanipulador con la misma resolución que manipuladores comúnmente utilizado para la grabación de patch clamp (por ejemplo, Sutter MP-285). Adicionalmente, el manipulador debe permitir el movimiento diagonal dentro y fuera de la rebanada. Hombreexpulsar manualmente presión 3 a 4 veces en la micropipeta con el fin de acumular la presión adecuada detrás de la columna de fluido.
- Uso de los controles micromanipulador, baje la pipeta fármaco en la porción mientras se visualiza la punta bajo IR-DIC óptica. Idealmente, se debe identificar visualmente y el centro de una neurona a grabarse, seguido por la colocación de la pipeta de drogas cerca de la célula antes de la reducción de la micropipeta grabación dentro de la rebanada. Colocación de la pipeta de drogas puede provocar el movimiento del tejido en la vecindad de la célula grabada que podría interrumpir la grabación si el fármaco pipeta se coloca en posición después de establecer un sello gigaohmio.
- Utilización de vídeo de IR, la posición de la micropipeta fármaco en la superficie superior de la lámina de tejido. Ejecutar una presión de eyección y el monitor 1) la proximidad de la punta para el movimiento de los desechos en relación con la expulsión, y 2) la punta de la micropipeta para detectar cualquier signo de que la punta está tapada o bloqueada. Si la punta está obstruido / tapado, retraiga el pipeteee y reemplazarla con una nueva.
- Enfoque de la célula grabada en diagonal desde la parte superior de la rebanada de tal manera que cuando está en posición final, la punta de la pipeta de relleno de fármaco es 1) en el mismo plano focal (o ligeramente por debajo) como la celda grabada y la punta del electrodo de registro , y 2) 10 a 40 micras de la célula registrada. Si la punta de pipeta relleno de fármaco está por encima de la celda grabada, la fuerza de la presión de eyección podría interrumpir el sello gigaohmio.
- Registrar la respuesta celular deseada mientras mantiene la celda en modo de tensión de la abrazadera o el modo de abrazadera de corriente. En forma rutinaria grabar acetilcolina y / o la nicotina-suscitó corrientes celulares mientras mantiene las neuronas en el modo de fijación de voltaje. Aunque la presión de eyección puede ser activado manualmente cuando se utiliza un Picospritzer III, para obtener resultados más reproducibles se recomienda para activar la eyección de presión utilizando el sistema de adquisición (Axon Digidata 1440 y pClamp 10,3) con un pulso digital TTL.
5. ControladorLa micropipeta lleno de drogas con un traductor piezoeléctrico
- Si es posible, montar el soporte de pipetas relleno de fármaco a un traductor de una sola dimensión piezoeléctrico (por ejemplo Piezojena PA-100 o Burleigh PZM-150) que es capaz de aceptar una entrada de voltaje analógico (de nuevo, desde el sistema de adquisición), que es luego montado en el micromanipulador de alta precisión (Sutter MP-285). Un traductor piezoeléctrico es útil debido a que el movimiento de la pipeta relleno de fármaco dentro y fuera de la rodaja, incluyendo el tiempo y la velocidad de entrada / salida, puede ser más fácilmente controlados y reproducidos de experimento a experimento. Al estudiar los nAChR, los efectos desensibilizantes de fuga de la nicotina de la pipeta relleno de fármaco, si llegaran a ocurrir, se minimizan cuando la pipeta se mueve sólo cerca de la celda con un traductor piezoeléctrico para el momento de la presión de eyección.
- A través del potenciómetro controlado manualmente en el amplificador de control de tensión piezoeléctrico, marque el voltajea su valor máximo.
- Uso del micromanipulador, la posición de la pipeta relleno de fármaco en el segmento en el que la pipeta se expulsa su contenido sobre la celda grabada, y retraer manualmente la pipeta por la reducción de la tensión a cero del amplificador de tensión de control piezoeléctrica.
- Uso de una señal de salida analógica desde el sistema de adquisición de grabación, mueva la pipeta relleno de fármaco en la rebanada durante un período de 250 mseg a partir de 300 mseg antes de la presión de eyección TTL pulso se produce. Retraer la pipeta durante un período de 250 ms, a partir de 50 mseg después del pulso TTL termina.
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Representative Results
En nuestros experimentos, de manera rutinaria grabar de dopamina (DA)-producción de neuronas del área tegmental ventral (VTA) y la sustancia negra pars compacta (SNc). En el modo de fijación de voltaje, presión de aplicación de la acetilcolina o la nicotina a estas células normalmente se traducirá en una corriente rápida, catión hacia dentro que alcanza pico dentro de 100-200 ms (Figura 1A-B). Decaimiento de la corriente es dictada en gran medida por la difusión del fármaco desde el sitio de acción, y si las enzimas del sector están presentes para metabolizar el fármaco en una forma inactiva. Por ejemplo, ACh es rápidamente hidrolizada por la acetilcolinesterasa que residen en la superficie de las células en áreas del cerebro que son ricas en neuronas DA 5. Esto resulta en una rápida descomposición de la corriente evocada (Figura 1A). En contraste, la nicotina no se hidroliza y nicotina-evocó corrientes no se deterioran tan rápidamente como ACh-evocó corrientes (Figura 1B), lo que le permite Activ fuertementecomieron y desensibilizar nAChRs 6.
Los sistemas de presión de inyección permiten al operador variar el tiempo del pulso de presión. Esta característica es útil en el estudio de nAChR en la superficie de las neuronas en rodajas de cerebro, ya que permite al investigador determinar si la corriente máxima evocada se ha logrado en respuesta a un impulso de fármaco. Por ejemplo, los dos trazos en la Figura 2 muestran que 250 mseg de la aplicación del fármaco (gris traza) puede o no puede revelar una definitivo de máxima corriente evocada, mientras que 1.000 mseg de aplicación del fármaco (negro traza) se obtiene un máximo claro en curso más estable algunos de estado de desensibilización. La resolución de estos "picos" corrientes es crucial en la construcción de una precisa concentración curva de respuesta, o al estudiar la desensibilización nAChR.
Neuronas DA en el cerebro medio ventral a menudo disparar los potenciales de acción espontáneos cuando se graba dentro de las secciones de cerebro agudas 7, 8. ratones α6 L9, que expresione nAChRs que responden fuertemente a 10 a 100-veces las concentraciones más bajas de nicotina o ACh 2, 9-11, exhiben locomoción aumentada en respuesta a inyecciones de nicotina. Para correlacionar la actividad neuronal (disparo del potencial de acción) con comportamiento, es útil la aplicación de nicotina a α6 L9 neuronas DA grabados en el modo de corriente-clamp. Típicamente, la aplicación local de la nicotina (1 mM) a α6 L9 neuronas DA se traducirá en una aceleración rápida y transitoria de cocción que se descompone a la línea base dentro de 30-40 seg 2 (Figura 3, panel superior). Tales respuestas a la nicotina son fácilmente cuantificables (Figura 3, panel inferior) con el software de análisis apropiado (por ejemplo pClamp; Molecular Corp. Dispositivos).
Los experimentos en células cultivadas o oocitos de Xenopus con nAChRs ectópica expresó disfrutar de la ventaja de que una serie de concentraciones de la droga puede ser aplicada a cada celda grabada 12. Enneuronas en rodajas de cerebro, típicamente una curva de concentración-respuesta no es posible, y las respuestas a una sola concentración de fármaco a menudo se informó 1. Sin embargo, una pipeta de relleno de fármaco como se describe en este documento puede ser cambiado varias veces para permitir múltiples concentraciones de fármaco que se aplican a la celda grabada mismo dentro de un corte de cerebro 2, 8, 13, 14. Figura 4 muestra los datos representativos de una single grabado DA neurona que se estimuló con tres concentraciones de ACh. La experiencia del investigador, combinado con un micromanipulador altamente estable que sostiene la pipeta lleno de drogas, son factores críticos que conducen al éxito en este tipo de experimento. Cuando tiene éxito, este enfoque proporciona una valiosa información farmacológica sobre nAChRs nativos.
Las neuronas en rodajas de cerebro, incluyendo tipos de células no caracterizados o aquellas presentes en áreas del cerebro con una población heterogénea, se clasifican a menudo utilizando elementos de base distintosctrophysiological medidas y / o morfológicas 15. Por ejemplo, la expresión de I h Corriente de potencial de membrana de reposo, la tasa de disparo espontáneo, y tamaño de la célula son medidas típicas utilizadas para caracterizar las neuronas DA 2, 7, 8, 16, 17. Usando nuestro método, también es posible caracterizar las neuronas en base a su respuesta a la nicotina localmente aplicado o ACh 18, 19. Por ejemplo, el colículo superior (SC) es un área del cerebro heterogéneo y no caracterizada relativamente con expresión muy alta de nAChRs diferentes, incluyendo aquellos que contienen subunidades α6 20. En secciones de cerebro de α6 L9 ratones, se registraron a partir de varias neuronas SC y nicotina aplicado (1 mM) utilizando presión de eyección con una pipeta llena de nicotina. Dos tipos distintos de respuesta fueron observados: 1) activación de inhibitoria postsináptica corrientes (IPSCs) (Figura 5, las respuestas de tipo I), y 2) las grandes corrientes de cationes hacia el interior con un poco de inductien de excitatorios postsinápticos corrientes (EPSCs) (Figura 5, las respuestas de Tipo II).
El uso de un traductor piezoeléctrico ofrece la ventaja de que la pipeta de relleno de fármaco puede ser mantenido en una posición estacionaria por lo menos 100 m de distancia de la celda de grabado hasta que se mueve rápidamente adyacente a la celda para la presión de eyección. Esto es útil porque el movimiento de la pipeta puede ser automatizado y es constante de célula a célula y en el día a día. También es útil cuando las altas concentraciones de nicotina (que desensibilizar nAChRs) se aplican a la celda de grabado, ya que minimiza el efecto de fuga de la nicotina de la pipeta relleno de fármaco, si alguna vez se producen. Para demostrar la consistencia de las corrientes de nAChR cuando se utiliza un traductor piezoeléctrico, se registraron a partir de VTA neuronas DA en secciones de cerebro de ratones α6 L9. Figura 6 muestra las respuestas consecutivos en el mismo α6 L9 neurona VTA DA en respuesta a concentraciones de nicotine que activar fuertemente hipersensibles α6 * nAChRs (1 mM: Figura 6A; 10 mM: Figura 6B). Si se permite a gotear continuamente sobre la celda de grabado, estas concentraciones de nicotina que se esperaría para desensibilizar a los nAChR en la superficie celular, y la segunda respuesta sería atenuada en relación a la primera respuesta.
Figura 1. Respuestas representativas de nAChR en las neuronas DA. A. Una neurona DA en una rebanada de cerebro de ratón WT se sujeta tensión, seguido de la aplicación local de ACh (100 mM) a través de la presión de eyección (250 ms), utilizando un relleno de fármaco segunda pipeta. Barra de escala: 100 pA, 3 seg B.. El experimento se realizó como se describe en A, excepto que la nicotina (100 mM) se aplicó a la neurona DA. Barra de escala: 60 pA, 3 seg.
Figura 2. Resolución de picos de corriente variable en el tiempo por la aplicación del fármaco. Una neurona DA en una rebanada de cerebro de ratón WT se sujeta tensión, seguido de la aplicación local de ACh (100 mM). Dos respuestas se muestran para la misma célula grabada, donde ACh fue expulsado de la pipeta relleno de fármaco para 250 mseg (gris rastro) o 1000 mseg (trazo negro). Barra de escala: 50 pA.
Figura 3. Estudiar potencial de acción disparando después de la aplicación local de la droga. Una neurona DA en una rebanada L9 α6'S cerebro de ratón se registró en pinza de corriente (I = 0) el modo y los potenciales de acción espontáneos fueron observados. Nicotina (1 mM) se aplicó mediante presión de eyección (250 ms), y fueron los cambios en el potencial de acción de la tasa de disparos y potencial de membrana en reposoobservado. El uso de software pClamp (búsqueda del umbral), tasa de disparo instantáneo se deriva y se muestra en el panel inferior.
Figura 4. Múltiples aplicaciones fármaco a la célula misma grabado. Una neurona DA en una rebanada L9 α6'S cerebro de ratón fue grabado en el modo de fijación de voltaje. Una pipeta de relleno de fármaco se utiliza para aplicar localmente ACh (1 M; 250 mseg). Mientras se continúa grabando desde la célula, la pipeta relleno de fármaco fue retirado de la rebanada y reemplazado con otro pipeta llena con 3 mM de ACh. Una respuesta a ACh 3 mu M fue registrada, y el proceso se repitió de nuevo para 10 mM ACh. Barra de escala: 100 pA, 1,5 seg.
Figura 5. Clasificación de las neuronas por tipo de respuesta nAChR.Un grupo de colículo superior (SC) neuronas en una α6 L9'S cortes de cerebro de ratón se sujeta tensión, seguido de la aplicación local de la nicotina (1 mM) a través de expulsión a presión. Tipo I neuronas exhibieron IPSCs aumento de la nicotina después de la aplicación. Tipo II neuronas exhibieron grandes corrientes de entrada y EPSCs aumento en respuesta a la aplicación de nicotina. Barra de escala: 20 pA, 3 seg.
Figura 6. Traductor piezoeléctrico ofrece consistencia y protege de la fuga de drogas. A. A VTA DA neuronas en un cerebro rebanada de un ratón L9 α6 se grabó en el modo de fijación de tensión durante la aplicación de la nicotina mM 1. La pipeta llena de nicotina fue maniobrado a su posición final antes de que la presión de eyección y se retrae después de la inyección utilizando un traductor piezoeléctrico. Una segunda respuesta fue grabado 2 minutos después de la fiRST para demostrar que no había ocurrido la desensibilización nAChR. Barra de escala: 100 pA, 8 seg B.. respuestas nAChR en α6 L9 VTA neuronas DA fueron registradas como en A, pero el 10 mM nicotina se aplicó. Barra de escala: 100 pA, 8 seg.
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Discussion
El método presentado en este documento es en general útil para el estudio de ligando función del canal iónico en preparaciones de cortes de cerebro. Sin embargo, hay un número de factores que afecten significativamente a la calidad y reproducibilidad de los datos experimentales que resultan de la utilización de este método. Por ejemplo, las corrientes evocadas son muy sensibles al diámetro de la punta de la pipeta de relleno de fármaco. Pequeñas sugerencias causará dificultades con expulsar la solución de fármaco, y consejos de grandes con baja resistencia será más probable que altere el sello gigaohmio entre la célula de grabado y el electrodo de registro. Otra limitación del método presentado es que las células dentro de 10 micras de la celda grabada puede estar expuesto a las drogas de la pipeta relleno de fármaco, lo que puede aumentar su actividad y potencialmente podría afectar la celda grabada.
Cuando la aplicación de fármaco a una célula varias veces con la pipeta mismo fármaco, es crucial que la pipeta se volvió aprecisamente la misma posición en la división para cada aplicación. Incluso las pequeñas variaciones (por ejemplo, 1-2 micras) en la colocación de una respuesta a la siguiente menudo se traducirá en diferencias sustanciales en la respuesta máxima observada. Un traductor piezoeléctrico programable (como se describió anteriormente) o micromanipulador robótico es ventajoso para el posicionamiento de la pipeta de drogas. Otra consideración importante es la profundidad de la celda grabada dentro de la rebanada. Drogas a menudo se difundirá fuera de una célula en la superficie de la rebanada más rápidamente, mientras que las drogas puede ser "atrapado" dentro de la rebanada cuando salen a una célula que se encuentra profundamente dentro de la rebanada. Esto es a menudo una consideración clave en la aplicación de la nicotina, que fácilmente se desensibiliza nAChRs cuando los tiempos de exposición son más largos que 100-200 mseg. Del mismo modo, la presión (en psi) que se expulsa en la pipeta relleno de fármaco y la cantidad de tiempo que se aplica presión (Figura 2) son consideraciones importantes para la interpretación de nAChR actual data. Habitualmente usamos 10-12 psi de presión, y encontramos que 250 ms es el tiempo suficiente para resolver nAChR corrientes máximas sin causar la desensibilización del receptor extensa.
Una ventaja clave del método que describimos es la capacidad de intercambio de relleno de fármaco consejos de pipetas de modo que las concentraciones de drogas múltiples se pueden aplicar a la misma neurona. Las consideraciones clave al intercambio de pipetas son 1) la variación en la localización de la punta de pipeta de una concentración a la siguiente, y 2 variabilidad) de diámetro punta de la pipeta. Localización de la punta de pipeta normalmente pueden ser controlados adecuadamente con una cámara de vídeo de alta resolución IR cercano y un micromanipulador precisa. La variabilidad en diámetro de la punta de pipeta puede ser controlada mediante el uso de pipetas "hermanas" siempre que sea posible, y mediante el uso de un extractor de pipeta que tira de micropipetas con un alto grado de precisión y consistencia.
En general, el método de la pipeta lleno de drogas se describe en este artículo es un método muy útil cuando studying nAChRs nativos expresados en las neuronas que se encuentran en las secciones de cerebro agudas. Además de ser útil para el estudio de la neurobiología de la dependencia de la nicotina y la biología colinérgico nicotínico, este método es fácilmente aplicable a otros canales iónicos activados por ligando. 5-HT 3 receptores, los receptores GABA A, y los receptores de glicina son algunos de los otros "cys-loop" receptores que se pueden estudiar mediante estas técnicas 21.
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Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención DA030396. Gracias a los miembros del laboratorio drenan útil para el debate y la crítica del manuscrito. Un agradecimiento especial a Mi Ran Kim para la asistencia técnica y Jonathan Thomas Ting para el asesoramiento con respecto a las secciones de cerebro de ratón adulto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
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