Summary
Muskelfunktion Messungen Beitrag zur Bewertung von potentiellen Therapeutika für Muskelpathologie sowie auf die Bestimmung der physiologischen Mechanismen, die von diesem Gewebe. Wir zeigen die Herstellung des Extensor digitorum longus und Zwerchfell Muskeln für Funktionstests. Protokolle für isometrische und exzentrische Kontraktionen wird gezeigt werden, ebenso wie Unterschiede in den Ergebnissen zwischen dystrophischen Muskeln, die einen pathologischen Zustand, und Wildtyp Muskeln.
Abstract
Entscheidend für die Bewertung potenzieller Therapeutika für Muskelerkrankung sind empfindlich und reproduzierbare physiologischen Beurteilung der Muskelfunktion. Da viele pre-klinischen Studien am Mausmodell verlassen für diese Krankheiten hat isolierten Muskel-Funktion zu einem der Standards für Go / NoGo Entscheidungen in Bewegung Wirkstoffkandidaten nach vorne in Patienten. Wir zeigen die Herstellung des Extensor digitorum longus (EDL) und Zwerchfell Muskeln für funktionale Tests, die die vorherrschende Muskeln für diese Studien eingesetzt werden. Die ETL-Muskel Geometrie ist ideal für isolierte Muskelpräparate, mit zwei leicht zugänglich Sehnen und einer geringen Größe, die durch Superfusion in einem Bad unterstützt werden können. Die Membran weist tiefe progressive Pathologie in dystrophischen Tiere, und kann als eine Plattform zur Evaluierung viele potenzielle Therapien begegnen Fibrose, und die Förderung myofiber Stabilität dienen. Protokolle für Routineuntersuchungen, einschließlich isometrisch und Exzentric Kontraktionen, werden angezeigt. Isometrische Kraft bietet Beurteilung der Festigkeit und exzentrischen Kontraktionen helfen Sarkolemm Stabilität, welche in vielen Arten von Muskeldystrophien gestört ist auszuwerten. Vergleiche von den erwarteten Ergebnissen zwischen Muskeln aus Wildtyp und dystrophischen Muskeln werden ebenfalls bereitgestellt werden. Diese Maßnahmen ergänzen können morphologische und biochemische Messungen Gewebshomöostase sowie ganze Tier Einschätzungen der Muskelfunktion.
Introduction
Muskelfunktion Messungen Beitrag zur Bewertung der potentiellen Behandlungen für Muskelpathologie sowie auf die Bestimmung der physiologischen Mechanismen, die von diesem Gewebe. Bei Muskel-Krankheit, haben die Verwendung von Mausmodellen zu einem zentralen Bestandteil für das Verständnis der Zusammenhänge zwischen Genotyp und Phänotyp, und für die Erweiterung dieses Wissen in die Gestaltung und Prüfung von potenziellen Therapeutika. Die Muskeldystrophien insbesondere haben an Mäusen verlassen, um diese Mittel zu bewerten und zu etablieren präklinische Daten erforderlich, um vorwärts zu bewegen, um Studien an Patienten. Ein häufiges Zielkriterium verwendet isolierten Muskel-Funktion, um Kraft, die für eine breite Palette von Studien ist zu bestimmen. Eine weitere Maßnahme ist die Verwendung von exzentrischen, oder Verlängern, um Kontraktionen bestimmen Veränderungen Muskelmembran Integrität, die defizient ist in Duchenne-Muskeldystrophie, und das Maus-Modell der Krankheit (MDX). Daher ist es für diese Typen von Meßebenen wesentlicheEltern sensibel sein und reproduzierbar.
Die Maus extensor digitorum longus (EDL) Muskel wurde ausgiebig für isolierte Muskelfunktion wegen seiner idealen Geometrie und Größe mit einheitlichen Faserorientierung und definitive Sehnen 2, 5, 6, 10, 12 verwendet. Methoden zur EDL Muskeln isometrische funktionelle Messungen wurden in einer früheren JoVE Veröffentlichung 8, sowie in der Treat-NMD SOP 1 beschrieben worden. Wir haben die Beschreibung dieser Methoden, um sowohl isometrische und exzentrische Kontraktionen erweitert. Kennzeichen der Erkrankung sind in der EDL evident, einschließlich heighted Zyklen von Degeneration / Regeneration und verminderte Kraft Ausgang.
Die Maus Membran weist die schnellste pathologischen Verlauf der Muskeldystrophie im Vergleich zu anderen Muskeln in der Maus 11. Durch Alter von 6 Monaten umfasst kumulative Fibrose etwa 50% des Muskels. Dies führt zu deutlich impaired Kraftabgabe 11. Daher können therapeutische Wirkstoffe, die fibrotische Infiltration verhindern kann effizient in der Membran ausgewertet werden.
Der Verlust von Dystrophin in Muskelzellen führt zu einer erhöhten Brüchigkeit und erhöhten kontraktilen Schäden in allen Muskeln 9. Daher sind viele Therapien für Duchenne-Muskeldystrophie sind für Dystrophin Ersatz ausgerichtet. Als solches ist ein Test, der notwendig geworden ist für die Bewertung dieser Strategien exzentrischen Kontraktion, die zwischen normalen und dystrophischen Muskel unterscheiden kann, sowie zu bestimmen, welchen Nutzen eine bestimmte Strategie zum Schutz eines dystrophischen Muskel von kontraktilen Schäden 2, 3, 4, 12. Dieses Verfahren erfordert entweder eine Dual-Mode-Servomotor, der moduliert / Aufzeichnungslänge und Kraft, oder ein Verfahren zum Anpassen der Länge rasch getrennt von einem Kraftaufnehmer kann.
Protocol
Alle Verfahren wurden überprüft und von der University of Pennsylvania IACUC zugelassen.
Ein. EDL Dissection und Vorbereitung (ca. 30 min)
- Anesthetize Mäusen, um sicherzustellen, dass sie keine Schmerzen oder Leiden während des Verfahrens zu erleben, sondern dass die Muskeln bleiben auch durch die Zirkulation mit Sauerstoff angereichert. Wir verwenden routinemäßig eine Ketamin / Xylazin-Cocktail (100/10 mg / kg) über IP injiziert. Chirurgische Ebene der Anästhesie wird durch die vollständige Abwesenheit von Pedal oder palpedral Rückzug Reflexe, oder das Fehlen von Ohr Zuckungsantwort bestimmt.
- Immobilisieren die Hinterbeine mit einem Pflaster, und entfernen Sie die Haut des unteren vorderen Hinterlauf, um die Muskeln dieses Bereichs aussetzen. Damit die Muskeln feuchte mit der Anwendung der PBS in regelmäßigen Abständen.
- Unter einem Binokular, einen kleinen Einschnitt lateral des Knies, um die Sehne des proximalen EDL Muskel freizulegen. Es gibt zwei Sehnen in dieser Region, und beide sollten geschnitten, um wieder zu aktivierenfernung der EDL.
- Am medialen Knöchels, schneiden die Sehne des TA Muskels, um die distalen Sehnen des EDL, die entlang der meta Tarsalknochen erstrecken freizulegen. Heben Sie den TA Muskel aus dem Weg, man aufpassen, nicht zu schneiden oder berühren Sie die EDL darunter. Zurück zu den distalen Sehnen der EDL, snip jeweils ein und ziehen sie durch die Knöchel, dann greifen die Sehnen, ziehen Sie die EDL weg vom Rest des Körpers. Es sollte aus dem proximalen Ende frei freizugeben, aber wenn nicht, um die laterale Inzision zurückzukehren, um sicherzustellen, dass die Sehne geschnitten ist. Entfernen Sie den Muskel und in einem Seziertisch Gericht mit gekühlten oxygenierten Ringers gefüllt. Merken die Muskeln durch die Sehnen etwa Ruhelänge, die die Länge in vivo gefunden wird. Die Länge ist zu kurz, wenn der Muskel schlaff ist in der Schale, und zu lang, wenn der Muskel auf den sezieren Stifte ziehen wird.
- Euthanize die Maus unmittelbar nach Muskel-Entfernung durch Genickbruch.
- Tie Nähte an den zehndons, so nahe wie möglich an den Muskel, aber nicht berührt den Muskel. Merken die Muskeln etwa Ruhelänge mit den Nähten.
2. Membran-Dissection und Vorbereitung (ca. 30 min)
- Euthanize die Mäuse vor diesem Verfahren durch Genickbruch unter Anästhesie, wenn die gleiche Maus beiden Sektionen unterworfen ist, oder mit CO 2, gefolgt von der Bestätigung mit Genickbruch.
- Einen Einschnitt in der Haut um den Bauch-und Brusthöhle aussetzen. Öffnen Sie die Bauchhöhle, und schneiden den Körper Wand gerade unterhalb der Rippen. Verwendung Knochen Scheren und ausgehend über der Membran Insertion, um den gesamten Brustkorb nach der Linie der die Rippen geschnitten und Schnitt durch Wirbelsäule. Geschnitten Blutgefäße durch das Zentrum der Membran so daß die Membran leicht entfernt werden kann.
- Entfernen Sie die Membran aus der Maus und in einem Seziertisch Gericht mit Sauerstoff Ringers gefüllt. Vorsichtig geschwenkt, die DIAPhragm in die Schüssel weg zu waschen Blut. Aktualisieren Ringers-Lösung nach Bedarf.
- Schnitt ein schmaler Streifen der Membran von der zentralen Sehne an den Rippen entlang der Ausrichtung der Fasern in dem zentralen Abschnitt der seitlichen hemidiaphragms. Der Streifen sollte zwischen 2-4 mm breit sein. Verwendung Knochen Schere, schnitt die Rippe auf jeder Seite des Streifens, so dass ungefähr 1-2 mm Überhang Rippe auf beiden Seiten der Membran Streifens.
- Tie Nähte an den zentralen Sehne. Nahtmaterial binden an jede der seitlich vorstehenden Rippe endet, und dann binden diese zusammen, um eine große Schleife zu machen.
- Zwei Streifen können aus jedem beliebigen gegebenen Membran (eine von jeder Seite) erhalten werden.
3. Montage Muskeln in der Mechanik Bath
- Fassen die Nähte und verwenden diese, um die Muskel an einem starren Beitrag befestigen an einem Ende, und an einen Kraftaufnehmer am anderen Ende.
- Passen Sie die Länge, um sicherzustellen, dass die Muskeln nicht schlaff, aber nicht straff. Eine gute Näherung ist die Ruhestätte muscle Länge wie in 1,4 bis 1,5.
- Bad sollte mit oxygeniertem Ringers-Lösung bei 22 ° C gehalten wird, um Muskeln Stabilität zum Testen verlängern gefüllt werden. Muskeln sollte für 5 min in diesem Bad vor der Funktionsprüfung ruhen, so daß Muskeln Temperatur äquilibriert bis 22 ° C.
4. Isometrische Kontraktionen
- Stellen supramaximale Stimulation AGB. Nach ein Muskel in das Bad eingesetzt wird, verwenden Einzeldosis von 0,5 msec Stimulationsimpulse an ein Zucken zu generieren und zu überwachen Kraftabgabe. Erhöhen Sie aktuelle, bis die Kraft ein Maximum erreicht, aber stabilen Niveau. Erhöhen des aktuellen 10% mehr als dieser Ebene für die restlichen Experimente.
- Stellen Optimale Länge. Mit isometrische twitch Stimulationen, passen Sie die Länge des Muskels allmählich, bis eine maximale Kraft erreicht wird. Seien Sie der Muskel ~ 10 sec zwischen jeder Kontraktion. Optimale Muskel-Länge (L o) wird erreicht, wenn Zuckungskraft maximal ist. Nimm Muskellänge (die Länge seinschen den Muskel-Sehnen-Übergänge für EDL und zwischen dem zentralen Spannglied Muskel-Sehnen-Übergang und dem Muskel Einführen der Rippe) mittels Messschieber.
- Maximale isometrische Tetanic Force. Stimulieren Muskeln an L o gesetzt für einen Zeitraum von 500 ms, mit einer Reihe von 0,5 ms Pulse bei supramaximale Stimulation und Fusion Frequenz (von der Hochebene der Frequenz-Kraft-Beziehung (zB Ref:. 8) Das Plateau für EDL Muskeln typischerweise mit 120 Hz, und für Zwerchfellmuskeln mit 100 Hz erreicht. Stimulieren 3 mal in der jeweiligen Frequenz, mit Ruhezeiten von 5 min Stimulation zwischen Schüben zu jedem Muskel.
5. Exzentrische Kontraktionen
- Lassen Muskel 5 min zwischen der Durchführung isometrische und exzentrische Kontraktionen ruhen.
- Stimulieren Muskeln isometrisch bei 80 Hz für die ersten 500 ms, von einem 10% L o Dehnung in der letzten 200 ms Stimulation (eine Streckrate von 0,5 L o gefolgt/ Sec).
- Wiederholen Stimulationsmuster mit 5 min Pausen zwischen der gewünschten Anzahl von exzentrischen Kontraktionen.
- Messen Sie Kraft für jeder Kontraktion in der Zeit vor der Zielgeraden. Berechnen Sie den Rückgang der Kraft zwischen dem ersten und letzten Kontraktion.
6. Muscle Entnahme aus dem Apparat
- Verkürzen Sie die Muskellänge für schonende Entfernung des Muskels vom Wandler zu ermöglichen und posten und schicken Sie es an einem Seziertisch Gericht mit Ringers.
- Entfernen Nahtmaterialien aus den Muskeln.
- Für die EDL Muskel, auslöschen den Muskel zweimal, dann wiegen, bevor die nachfolgende Verarbeitung (z. B. Einfrieren, Befestigung, etc). Dies wird für die Berechnung der Querschnittsfläche und spezifische Kraft wichtig.
- Für das Zwerchfell, in 0,1% Procion Orange, eine Membran impermeante Farbstoff für 15-20 min tränken. Dies stellt einen Index der Dissektion Beschädigungen.
- Sezieren den Muskel vom knöchernen Insertion sowie der Central Sehne. Dies ist notwendig, um ein genaues Gewicht der Muskel bereitzustellen. Blot wie oben vor dem Wiegen und anschließende Vorbereitung.
- Berechnen Querschnittsfläche (CSA):
CSA (mm 2) = Masse (mg) / [(L o mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm 3)],
wobei L / L o die Faser ist, um Muskeln Längenverhältnis (0,45 für ETL-, 1,0 für die Membran) und 1,06 5 ist die Dichte des Muskels.
Representative Results
Erwartete Werte für die isometrische Kräfte der EDL Muskeln von 12 Wochen alten Tiere sind in Abbildung 1 dargestellt. Da mdx-Muskeln kompensatorische Hypertrophie aufweisen, können insgesamt tetanische Kraft höher sein mdx Muskel im Vergleich zu gleichaltrigen Wildtyp Kontrollen. Jedoch ist eine weitere geeignete Maßnahme von funktionellen Ausgang spezifische Kraft (Abbildung 2), wobei Kraft Querschnittsfläche normalisiert wird, um diesen Wert zu berechnen. Spezifische Kraft hängt von der inhärenten funktionellen Kapazität des Muskels, wo die Schwäche in dystrophischen Muskeln ist umso offensichtlicher, wenn sowohl absolute Kraft und Querschnittsfläche für bilanziert werden. In unseren Händen, erzeugen EDL Muskeln von mdx-Mäusen etwa 20 - 25% geringere spezifische Kräfte als die der gleichaltrigen Wildtyp-Mäusen 10 bis 26 Wochen alt sind.
Für die Membran, ist nur bestimmte Kraft, die für Vergleiche, da die Zubereitung eine Stück des Muskels abhängig vom dissektion. Vergleich der spezifischen Kraft zwischen Wildtyp und mdx Zwerchfellmuskeln spiegelt die progressive Pathologie in diesem Gewebe. Isometrische Kraft nimmt mit dem Alter (Abbildung 3), so dass durch Alter von 6 Monaten, Zwerchfell Muskeln von mdx-Mäusen nicht mehr als die Hälfte der funktionalen Leistung von Membran-Streifen aus gleichaltrigen Wildtyp Kontrollen zu produzieren.
Ein Beispiel für die von der Membran exzentrischen Kontraktionen Tests ist in Abbildung 4 dargestellt. Mit jeder weiteren exzentrischen Kontraktion, vermindert Kraftabgabeglied in der Membran Streifen sowohl aus Wildtyp (C57) und mdx-Mäusen. Allerdings ist der Verlust der Kraft dramatischer Probenahme von Muskelgewebe aus der mdx-Maus, vermutlich aus dem Fehlen von Dystrophin und die zugehörigen Proteine.
Abbildung 1. Isometrische tetanische Kraft in Wildtyp und mdx EDL Muskeln f rom 12 Wochen alten Mäusen. Absolute Kraft kann höher sein Alter passende mdx EDL Muskeln durch kompensatorische Hypertrophie.
Abbildung 2. Isometrische tetanische Kraft durch Muskelkraft Querschnittsfläche normiert ist Spezifisch Force, und offenbart niedergedrückt Funktionsfähigkeit EDL Muskeln von mdx Mäusen im Vergleich zu denen von Wildtyp-Mäusen. Spuren sind von den gleichen Mäusen, wie in 1.
Abbildung 3. Der fortschreitende Verlust von Gewalt Erzeugungskapazität von bestimmten Kraft beurteilt wird am deutlichsten in der Membran von mdx-Mäusen (rote Balken) im Vergleich zu Wildtyp (C57 in blaue Linie).
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Abbildung 4. Der Verlust der Kraft als Funktion der exzentrischen Kontraktion Nummer für Zwerchfellmuskeln von 12 Wochen alten C57 und mdx Mäusen. Die Daten werden Mittelwert ± SEM für N = 4 Muskeln pro Genotyp.
Discussion
Das Ziel dieses Artikels ist es, Leitlinien für die Durchführung isolierten Muskel-Funktion auf zwei Muskeln von Mäusen liefern - die EDL und das Zwerchfell. Die Auswertung dieser Muskeln können Einblick geben, ob oder nicht therapeutischen Kandidaten für Muskelerkrankung nutzbringende bieten. Für beide Muskeln, ist der wichtigste Faktor bei der Beschaffung von robusten Daten eine saubere Präparation. Daher üben und perfektionieren die anfängliche Isolierung Schritt ist, bevor sie auf funktionale Tests unerlässlich. Darüber hinaus Errichtung funktionaler Benchmarks für normalen Muskel ist wichtig, bevor Vergleiche dystrophischen Muskel oder zwischen den Behandlungen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Ergebnisse der Studie nicht Gegenstand hohe Variabilität durch die Fähigkeit der Person, die die Experimente vermittelt. Die Verwendung einer Membran impermeante Farbstoff kann mit der Optimierung der Dissektion Vorbereitung helfen, zur Inkubation eines Muskels in einer Lösung, die ein solcher Farbstoff wird am beschädigten Fasern zu markieren, und kann als ein Index d dienenissection Erfolg. Minimieren der Anzahl von Fasern in den Muskel beschädigt wird helfen, die Messung zu optimieren. Die Fasern durch Dissektion beschädigt fluoreszieren viel heller als die durch exzentrische Kontraktion beschädigt, und dann, wenn der Farbstoff auch in der Mechanik verwendet, kann man die Intensität des Farbstoffs zu verwenden, um zwischen den zwei Arten von Schäden zu unterscheiden.
Dissektion Membran Streifen wird fast immer Faserschädigung, einfach weil durch Schneiden entlang der Länge der Fasern, einige zwangsläufig zerstört. Farbstoffaufnahme ist stark in denjenigen beschädigten Fasern, und diese werden in der Regel zu den äußeren Kanten der Herstellung beschränkt. Im Durchschnitt beobachten wir ein Band von beschädigten Fasern, die Fasern in drei ~ Breite (~ 120 um) auf beiden Seiten des Muskels Streifen ist. Wenn das beschädigte Band umfasst mehr als 15% des Muskels, dann werden die Daten verworfen. Die Membran Präparation hat auch Belastungen bei der optimalen Größe für funktionelle Maßnahmen. Wir haben gefunden, dass Stücke von diaphragm, die breiter als 5 mm sind beginnt zu falten auf sich selbst, weil die zentrale Sehne Krawatte ist nur an einer Stelle. Dies führt zu einer verminderten spezifischen Kraft in der Zubereitung. Wir haben auch festgestellt, dass schmalere Streifen auch geringere spezifische Kraft, die wir glauben, ist, weil die Zahl der Fasern während der Präparation beschädigt einen größeren Anteil an der gesamten Faser-Nummer enthalten. Wenn beispielsweise 0,1 mm auf jeder Seite beschädigt ist, dann ist das 5% (2x0.1 mm / 4 mm Streifenbreite) des Muskel-Präparat, das nicht beiträgt zu zwingen, während, wenn das Band nur 1 mm, dann 20 % des Muskel-Präparat ist beschädigt. Somit sind sowohl die Breite der beschädigten Region sowie die Breite der gesamten Zubereitung wichtige Faktoren zu steuern.
Messungen der maximale isometrische Spannung erfordern, dass alle Muskelfasern in den Muskel stimuliert werden. Weil es enormen Schwankungen in den Komponenten der Vorrichtung in Abhängigkeit muss diese für jeden einzelnen Satz ermittelt werdenbis. Beispielsweise kann Badgröße oder die Art des Stimulators beeinflussen die Intensität der Stimulation. Twitch Stimulation ist ein vernünftiger Weg, um supramaximale Stimulation zu bestimmen. Sobald diese für eine bestimmte Einrichtung und Muskel aufgebaut ist, kann sie für nachfolgende Untersuchungen genutzt werden.
Im Gegensatz dazu muss die optimale Länge von jedem gegebenen Muskel für jede Präparation gemessen werden unter Verwendung der iterativen Prozess oben beschrieben. Dadurch wird sichergestellt, dass dicke und dünne Filamente Überlappung optimal ist und die maximal mögliche Kraft Kraftwerksleistung wird gemessen. Alternative Verfahren können auf der Beugungsmuster mit den Muskeln Streifen assoziiert verlassen, aber dies erfordert zusätzliche Ausrüstung hier nicht beschrieben.
Wir verwenden routinemäßig 500 ms Stimulation Dauern, die im mittleren Bereich dieses Parameters von anderen Forschern in diesem Bereich verwendet fällt. Obwohl dies einige Ermüdung des Muskels während der Kontraktion bewirken, ist das evidentdurch ein "Absacken" in der maximalen Kraftentwicklung kann diese an sich informativ sein. Zum Beispiel könnte ein Unterschied in Ermüdung durch verschiedene Therapien einschließlich solche, die auf Calcium-Handling, erreicht werden somit die Durchbiegung Kraft während aktive Kontraktion kann als Index für Verbesserungen dienen. Alternativ könnte der Verlust der Kraft anzuzeigen, dass die Fäden auf die Sehnen nicht fest genug, und dass sie sich während der Kontraktion Verrutschen. Der Muskel muss aus dem Bad entfernt werden, und die Nähte müssen neu geknüpft werden, wenn dies auftritt. Wir verwenden auch eine Reihe von 3 tetanische Kontraktionen, die Beurteilung der Stabilität der Zubereitung hilft. Auch hier würde Naht rutscht zum Verlust der Kraft zwischen Kontraktionen führen, erfordern Naht wieder binden. Große Muskeln kann auch erzeugen anoxischen Kerne, welche sich auf Schäden Kraft während das Protokoll führen. Muskelmasse ist ein limitierender Faktor für die Durchführung isolierten Muskel-Funktionstests, wo EDL Muskeln mit Massen größer als 20 mg verlieren Kraft mit jeder Kontraktiontion, und können nicht durch Superfusion in einem Bad unterstützt werden. Membran-Streifen nicht aus den gleichen Komplikationen leiden, weil sie dünn genug, um längere Lebensfähigkeit im Bad haben sind.
Andere Muskeln können für isolierte Muskelfunktion, einschließlich des Soleusmuskel, die üblicherweise verwendet wird genutzt werden, aber hier nicht beschrieben. Viele der gleichen Verfahren können nach dem soleus in Bezug auf die Herstellung und die Funktionsprüfung erlassen. Allerdings sind die wichtigsten Unterschiede in der Stimulationsfrequenz und die Parameter für exzentrische Kontraktionen. Die Nutzung der soleus für Funktion ergänzt, dass die beiden anderen Muskeln, und so sollte es als Teil eines "Standard-Paket" für die Beurteilung dystrophischen Mäusen 4, 7 berücksichtigt werden.
Exzentrische Kontraktion liefert einen Index von kontraktilen Fragilität, und es ist wichtig, um ein Protokoll zu verwenden, das zu bescheidenen Kraftverlust in den Muskeln aus Wildtyp Tieren und einem signifikanten Verlust an Kraft inunbehandelten dystrophischen Muskeln so, dass es einen breiten dynamischen Bereich für Vergleiche. Ein Fehlen einer Kraftverlust in normalen Muskeln nahe, dass die exzentrische Kontraktion zu mild ist, und wird nicht ausreichend sein, um zwischen Therapien, die nicht wirksam sind und solchen, die wirklich nützlich sind, unterschieden. Allerdings kann ein dramatischer Verlust an Kraft in normalen Muskeln unterworfen exzentrischen Kontraktion zu groß sein, um herauszuarbeiten, Differenzen mit der Krankheit assoziiert sind. Unsere Protokoll für die EDL und Membran verwendet einen 0,5 Lo / sec Streckrate, um eine 10% Längenveränderung erzeugen. Wir führen typischerweise 5 exzentrische Kontraktionen, die zu einem kleinen Verlust von Kraft im normalen Muskeln und einem signifikanten Verlust von Gewalt in dystrophischen Muskeln. Sicherlich können all diese Parameter variiert werden, um die Gesamtlänge Veränderung, die Rate der Strecke oder die Anzahl von exzentrischen Kontraktionen zu erhöhen, um Unterschiede zwischen kranken und gesunden Muskel, sowie auf die Wirkungen einer spezifischen Art der Mutation unterscheiden oder tehandlung ein studiert. Solange es einen deutlichen Unterschied zwischen normalen und erkrankten Muskeln, dann gibt es eine Goldstandard für hinsichtlich der Behandlungen erreicht.
Zusammenfassend stellt dieses Protokoll Richtlinien für die Durchführung isometrische und exzentrische Kontraktionen, und hoffentlich werden die möglichen Fallstricke zu vermeiden, wenn die Einstellung dieser Technik in Ihrem Labor.
Disclosures
Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel von Aurora Scientific gesponsert.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| in vitro Muscle Test System |  Aurora Scientific |
1200A | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
| ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
| Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
| Dumont SS forceps - angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
| Medical tape | Transpore | 3M | |
| Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
| TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
| Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
| Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
| Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |
References
- Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro. TREAT-NMD. , (2008).
- Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice. J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).
- Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function. Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).
- Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice. Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J. Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).
- Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (48), e2582 (2011).
- Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).
- Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle. Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).
- Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature. 352, 536-539 (1991).
- Welch, E. M., et al. PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations. Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).
